实验二：细菌涂片的制备和染色镜检

– 干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。
2、 细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。
3、 细菌常用染色方法：革兰氏染色法
实验二：细菌涂片的制备和染色镜检
革兰氏染色法： 1. 制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥 、固定。 2. 初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。 3. 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗 。 4. 脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾 斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出 的乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。
实验二 细菌涂片的制备和染色镜检
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实验二：细菌涂片的制备和染色镜检
目的要求：1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。 2、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。
实验内容：
1、 细菌抹片的制备：
– 玻片准备：透明、洁净、无油渍。
细菌抹片 的制备
– 抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。
革兰阳性菌 革兰阴性菌
革兰氏 染 色法
革兰氏染 色法动画
实验报告：
1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察 结果。 2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色1~2min
细菌抗酸染色
1. 初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿 沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分 钟，待标本冷却后用水冲洗。
2. 脱色: 3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟；用水冲洗。
3.复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。
G+菌与G-菌细胞壁的区别
细胞壁
强度 厚度 肽聚糖层 肽聚糖量 糖类量 脂类量 磷壁酸 外膜
革兰阳性菌 革兰阴性菌
较坚韧
较疏松
21~80nm 10~15nm
可达50 层
1~2层
50%~80%
5 %~80%
约45%
15%~20%
1%~4%
11~22%
﹢
﹣
﹣
﹢
革兰氏染色法过程示意图 革兰氏染 色法动画
5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。 6. 镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。
革兰氏染色法原理：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结 构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫 色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强 了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果 是不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成， 且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径 缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在 细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不 同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时 ，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物 比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色 。