新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞

新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细

胞

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：毕聪明，王珅，王军，费东亮，肖银霞

【摘要】目的探讨小鼠精原干细胞体外诱导分化精子样细胞的可行性。方法以7～8日龄小鼠睾丸为材料，采用小鼠睾丸支持细胞作为饲养层，应用维甲酸诱导、成年小鼠睾丸组织液诱导以及低温诱导精原干细胞分化，应用流式细胞仪分析诱导精子样细胞的染色体倍性。采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞，观察受精卵的发育状况。结果三种方法诱导精子样细胞比例分别为5.9%、1.6%、0.35%；流式细胞仪分析维甲酸诱导单倍体比率为19.3%；诱导精子样细胞能激活卵母细胞，囊胚发育率20.36%。结论新生小鼠精原干细胞体外可以诱导分化为精子样细胞，并具有激活卵母细胞的能力。

【关键词】精原干细胞分化单倍体小鼠

Abstract: Objective To discuss the possibility of SSCs of Newly-born mice inducing the differentiating Sperm-like cells. Methods Taking the testis of male mice of 7～8 days for material

and adopting the testis of mice , SSCs differentiating were induced by using retinoic acid, tissue fluid of adult mice and low temperature. Flow cytometry was used to analyse the ploidy of chromosome inducing sperm-like cells. Microinjection was used to inject the sperm-like cells into oocytes and enucleate oocytes to observe the development situation of zygotes. Results The proportions of sperm-like cells induced by the three methods were 5.9%,1.6%,0.35% respectively. The rate of Flow cytometry to analyse retinoic acid haploid is 19.3% .The sperm-like cells achieved could activate bovine oocytes by sperm injection (ICSI), and the development rate of blastosphere was 20.36%. Conclusions SSCs of newly -born mice can be induced and differentiated into sperm-like cells and are also capable of activating oocytes.

Key words:SSCs; differentiating; haploid; mice 在生精过程中，原始生殖细胞在胚胎期迁移到生殖嵴，经有丝分裂，迅速增殖形成精原干细胞（spermatogoial stem cells， SSCs），然后进一步形成精原细胞。吴应积等［1］利用曲细精管体外共培养法长期培养精原干细胞自分化为精子样细胞，另外应用外源基因修饰的雄性生殖细胞系或青春期的精原干细胞也可分化出精子样细胞［2－5］，通过体内移植使无内源性精子的动物产生精子。但在体外研究

SSCs诱导精子的很少，某些雄性性原细胞可以直接分化成精原细胞［6］，这提示具有一少部分雄性性原细胞维持在干细胞状态。本实验通过体外诱导新生小鼠SSCs分化为精子样细胞，探讨不同诱导方法的诱导效率；采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞，探讨其体外重构胚的发育能力，为SSCs体外分化研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 动物与材料

1.1.1 实验动物清洁级7～8 日龄雄性昆明乳鼠(辽宁医学院实验动物中心提供)。

1.1.2 材料碘化丙锭（propidium iodide，PI）维甲酸（retinoic acid，RA）、EGF（epidermal growth factor）、二氢睾酮（dihydrotestosterone）、促卵泡生成素（follicle stimulating hormone）均为SIGMA公司产品。

1.1.3 培养液的配制

A 基础培养液 DMEM+10% FBS培养液+6 mM 谷氨酰胺+0.5 mM 丙酮酸钠+0.1%非必需氨基酸+10 ng/mL EGF+10 ng/mL 类胰岛素样生长因子+500 ng/mL促卵泡生成素+133 mIU人生长激素+ 5 mg/mL胰岛素+5 mg/mL转铁蛋白+5 mM维生素A+ 0.1 mM视黄醛+ 0.1 mM睾酮+0.1 mM二氢睾酮+0.01% 核苷+0.5% 青霉素。

B 条件培养液基础培养液+30% 成年小鼠睾丸组织浸提液。

1.2 方法

1.2.1 SSCs的获取

采用组合酶消化法分离SSCs，采用支持细胞和SSCs共培养的方法培养，接种密度为1.0×105/mL，每周换液体2 次。

1.2.2 SSCs的诱导

A.RA诱导原代培养用基础培养液，添加10-5 mol/L RA处理48 h，培养4 d，更换为基础培养液，37 ℃培养，定时观察细胞生长状况，显微镜观察照相。

B.条件培养液诱导原代培养用基础培养液培养，3 d换上条件培养液（50% 细胞基础培养液+50% 睾丸组织浸提液培养液），37 ℃培养，每2～3 d半量换液1 次，定时观察细胞生长状况，显微镜观察照相。

C.低温培养诱导原代培养用基础培养液培养，37.8 ℃培养

3 d，然后34.8 ℃继续培养，每2～3 d半量换液1 次，定时观察细胞生长状况，显微镜观察照相。