流式细胞仪结果分析.ppt
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《流式细胞术贝克曼》课件
贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究 中广泛应用，可以用于检测免疫 细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液 学研究，检测血细胞的表面标志 物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤 研究，检测肿瘤细胞的表面标志 物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射 伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环 境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的 特点，能够在短时间内处理大量 细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电 检测技术，能够检测到微弱的荧光 信号，具有高灵敏度，能够检测到 低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多 个参数，包括细胞大小、颗粒性、 荧光信号等，从而对细胞进行多维 度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通 过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通 过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选 。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是 将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流 动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光 电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵 子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代
流式细胞仪结果分析共73页
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
流式细胞仪结果分析
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
流式细胞仪结果分析78页PPT
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
流式细胞仪结果分析
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
ห้องสมุดไป่ตู้
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
流式细胞仪结果分析
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
ห้องสมุดไป่ตู้
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
49
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
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（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
流式细胞仪结果分析ppt课件
56
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色（固相芯片是 用探针在芯片上的坐标位置给 基因的特异性编码；而液相芯 片则是用颜色来编码）
57
58
通过对标记不同荧光素分子的检测，实 现FCM对可溶性物质的定量分析
59
四、流式细胞免疫学技术的质量控制
（一）单细胞悬液制备的质控
• 适当的制备方式 • 处理红细胞 • 实体组织来源标本用机械法 • 温度25~37℃，pH7.0~7.2
4
流式细胞仪可以做什么？
样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓， 实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微 生物，人工合成微球等。 检测大小：一般是0.5um～40um
5
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞 仪
分选型流式细胞仪
6
（1液）液流cell）是液流系统的核心部件，流动室是 由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕 通过流动室内一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细 胞在此与激光垂直相交。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
42
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均 为任意门
43
线性门
44
•Region设置:
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈 可与门对应，但是也可以包含于门。
45
如十字门分析时，起 就可以由四个区域构 成，即 G=D1+D2+D3+D4。
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色（固相芯片是 用探针在芯片上的坐标位置给 基因的特异性编码；而液相芯 片则是用颜色来编码）
57
58
通过对标记不同荧光素分子的检测，实 现FCM对可溶性物质的定量分析
59
四、流式细胞免疫学技术的质量控制
（一）单细胞悬液制备的质控
• 适当的制备方式 • 处理红细胞 • 实体组织来源标本用机械法 • 温度25~37℃，pH7.0~7.2
4
流式细胞仪可以做什么？
样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓， 实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微 生物，人工合成微球等。 检测大小：一般是0.5um～40um
5
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞 仪
分选型流式细胞仪
6
（1液）液流cell）是液流系统的核心部件，流动室是 由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕 通过流动室内一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细 胞在此与激光垂直相交。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
42
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均 为任意门
43
线性门
44
•Region设置:
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈 可与门对应，但是也可以包含于门。
45
如十字门分析时，起 就可以由四个区域构 成，即 G=D1+D2+D3+D4。
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
流式细胞仪结果分析报告模板74页PPT
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
ห้องสมุดไป่ตู้1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
流式细胞仪结果分析报告模板 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
2021流式细胞分析完美版PPT
信号，并传送到相应的探测器。
• 电系统：把光信号转换为电信号。
• 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。
任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都 适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进展流式 细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进展分解 。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照 射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就 会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统〔相应 的透镜，滤片和探测器〕收集。分光器和滤光片引导散 射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。
●流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
• 其特点是： • ①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞； • ②可进展多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理
、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义 ；
• ③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、
计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多 领域的知识和成果；
如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋 巴细胞亚群的荧光特性。
第一台流统式细的胞仪核, 具心有分部选功件能 ，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为
Single cells sorted 目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm的激光器能够激发一种以上的荧光。
FALS Sensor
• 侧向角散射：侧向角散射〔SSC〕光与被
测细胞的颗粒密度和内部构造有关，对 细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感 。SSC收集与激光束正交90度方向的散射 光信号。
90 Degree Light Scatter 90度侧向角
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2020/10/7
（一）几种常见的荧光染料
细 胞 悬 液
激光
2020/10/7
FITC 异硫氰酸荧光素
Texas red 得州红
PE.PC.APC 藻胆蛋白类 PEcy5 能量传递复合染料
FL1 FL2 FL3 FL4
常用的几类荧光染料
名称
染料
异硫氰酸荧 光素 得州红
藻红蛋白
FITC
Texas red PE
2020/10/7
1.双参数直方图点图
红 色 荧 光 强 度
2020/10/7
绿色荧光强度
2020/10/7
双参数直方图点图
2. 二维等高图
• 由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。
• 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。
• 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。
藻青蛋白 PC
激发 波长 488
568
488
488
荧光颜 色
绿 525
红 615
橙 575
溶解性 易 不易
易
别藻青蛋白 APC 633 红 670
能量传递复 PEcy5 488 红
易
合染料
670
2020/10/7
对PH敏 感性 敏感
不敏感
特点
易溶于水，与抗体结 合不影响特异性 稳定，偶联后量子产 额低
2020/10/7
液流系统示意图
鞘液
喷嘴
Fluorescence signals
Focused laser beam
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FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
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（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率 。与分选速度成反比。
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第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双
参数散点图 、二维等高图 、假三维 等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
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一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直 方图上，根据该图的细胞群分布选定 其中想要分析的特定细胞群，并要求 该样本所有其他参数组合的直方图只 体现这群细胞的分布情况。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
2020/10/7
2020/10/7
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
2020/10/7
二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
2020/10/7
2020/10/7
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞 等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
488nm
575nm CY5
PE
CY5
藻红蛋白
CY5
花青苷5
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670nm 红色荧光
（二）免疫荧光标记
➢ 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合
➢ 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记
波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
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光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
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荧光染料的特性 •激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
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流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
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第一节 概述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光 强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析 和分选基础上发展起来的对细胞的物理 或化学性质（如大小、内部结构、DNA 、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测 量并可分类收集的高技术。
• 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
2020/10/7
2020/10/7
二维等高图
3. 假三维等高图
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（三）三参数直方图
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（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信 号可根据需要进行组合分析。
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二、数据显示方式
直分析方图 • 单参数直方图 • 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析
设门分析:REGION和GATE设置
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（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
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流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
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一、工作原理
➢采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； ➢利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； ➢用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
2020/10/
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侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结 构属性。
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侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
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90LS Sensor
流式细胞仪分析技术及应用
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第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理
第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制
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Laser
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
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基本工作原理
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已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
偏转落入收集器
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（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细
不敏感 具较多发光基团，消 光系数和量子产额高
不敏感 减少交叉，成本高
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结 合在一起，在488nm激发光照射下，通过 一个荧光染料被激发后产生的发射波长再 激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检 测到该特定荧光信号。
2020/10/7
能量传递复合染料机制
2020/10/7
三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小 的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把 针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标 本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激 光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行 定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相 芯片”之称 。
2020/10/7
2020/10/7
荧光补偿
2020/10/7
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
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（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
（一）几种常见的荧光染料
细 胞 悬 液
激光
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FITC 异硫氰酸荧光素
Texas red 得州红
PE.PC.APC 藻胆蛋白类 PEcy5 能量传递复合染料
FL1 FL2 FL3 FL4
常用的几类荧光染料
名称
染料
异硫氰酸荧 光素 得州红
藻红蛋白
FITC
Texas red PE
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1.双参数直方图点图
红 色 荧 光 强 度
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绿色荧光强度
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双参数直方图点图
2. 二维等高图
• 由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。
• 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。
• 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。
藻青蛋白 PC
激发 波长 488
568
488
488
荧光颜 色
绿 525
红 615
橙 575
溶解性 易 不易
易
别藻青蛋白 APC 633 红 670
能量传递复 PEcy5 488 红
易
合染料
670
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对PH敏 感性 敏感
不敏感
特点
易溶于水，与抗体结 合不影响特异性 稳定，偶联后量子产 额低
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液流系统示意图
鞘液
喷嘴
Fluorescence signals
Focused laser beam
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FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
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（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率 。与分选速度成反比。
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第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双
参数散点图 、二维等高图 、假三维 等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
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一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直 方图上，根据该图的细胞群分布选定 其中想要分析的特定细胞群，并要求 该样本所有其他参数组合的直方图只 体现这群细胞的分布情况。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
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A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
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二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
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前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞 等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
488nm
575nm CY5
PE
CY5
藻红蛋白
CY5
花青苷5
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670nm 红色荧光
（二）免疫荧光标记
➢ 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合
➢ 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记
波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
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光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
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荧光染料的特性 •激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
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流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
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第一节 概述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光 强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析 和分选基础上发展起来的对细胞的物理 或化学性质（如大小、内部结构、DNA 、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测 量并可分类收集的高技术。
• 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
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二维等高图
3. 假三维等高图
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（三）三参数直方图
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（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信 号可根据需要进行组合分析。
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二、数据显示方式
直分析方图 • 单参数直方图 • 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析
设门分析:REGION和GATE设置
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（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
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流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
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一、工作原理
➢采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； ➢利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； ➢用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
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侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结 构属性。
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侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
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90LS Sensor
流式细胞仪分析技术及应用
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第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理
第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制
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Laser
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
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基本工作原理
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已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
偏转落入收集器
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（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细
不敏感 具较多发光基团，消 光系数和量子产额高
不敏感 减少交叉，成本高
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结 合在一起，在488nm激发光照射下，通过 一个荧光染料被激发后产生的发射波长再 激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检 测到该特定荧光信号。
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能量传递复合染料机制
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三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小 的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把 针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标 本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激 光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行 定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相 芯片”之称 。
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荧光补偿
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四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
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（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。