细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE,WesternBlot

医学生物学研究技术与实验

实验报告

实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot

一、实验目的

1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质

2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理

3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术

4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术

二、实验原理

1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。

蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。膜蛋白的抽提比较复杂。膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。较为理想的增溶剂是去垢剂。目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水

解酶活力，以减少细胞的自溶过程。主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。

2. Lowry法测定蛋白质浓度

1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；

2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线

3.SDS-PAGE分离蛋白质

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。

4. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

5. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。

（1）浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸

离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。

（2）电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。

（3）分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。

图1 电泳操作示意图

表1凝胶浓度与蛋白质分离范围的相关联系。

6. 转膜(半干转移)法

蛋白质带负电，电场中会向正极移动，而PVDF膜在凝胶和正极之间，将蛋白质拦截在膜上，PVDF膜可以牢固吸附蛋白质，使蛋白质保留在膜上。

将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间：－|纸|胶|膜|纸|＋，如图2所示。

图2转膜(半干转移)法示意图

三、实验步骤

1. 制胶:

玻璃板上做好标记（加样孔位置和分离胶位置）→配制分离胶溶液，一旦加入TEMEM就立即灌胶，上加水饱和正丁醇，待凝→弃去正丁醇，蒸馏水冲洗，滤纸吸干多余水分→配制浓缩胶溶液并灌胶，插梳子，待凝→取下制胶器，插入电泳槽中，上槽加电泳缓冲液，没过小玻璃板，下槽加一半量的电泳缓冲液（TGS），拔梳子

2. 细胞总蛋白的制备：

收集1管细胞，3000rpm 离心5分钟弃上清，沉淀以10mLPBS垂悬洗涤，同上离心，再次以1mLPBS垂悬沉淀并移入1.5mL离心管，再次离心，弃上清→加入5倍体