层析分离技术.
层析分离法
层析分离法《层析分离法》是一项重要的实验分析技术，它可以用来分离和鉴定物质，这种技术被广泛应用于化学分析领域，被用于分离，鉴定和测定物质的组成成分和反应产物。
种技术已被广泛应用在食品、药品安全检测，环境污染监测以及材料表征等领域，因其分离准确、选择性强以及分析时间短等优点，在分析领域具有重要的地位和价值。
层析分离法的基本原理是利用空间分离原理，将能够在特定空间内运动的物质分离出来。
它的空间分离原理是基于物质不同的流体性能，将物质经过预先混合的流体层，然后在某一特定的体积内分道扬镳，从而实现物质的分离。
析分离技术可以有效地分离物质，使得混合物中的组分被完全分离，这种分离准确度非常高，可以达到99%以上，且可以在实验条件下进行重复性实验，更容易获得准确的结果。
层析分离法的基本工艺流程是：先将原料溶液进行调节，利用离子交换和混合，然后将上述溶液注入层析柱中，利用不同流体在层析柱中的运动特性，分离出混合物中的组分，然后使用检测仪器进行定量或定性分析。
在层析分离法分离鉴定时，可以根据不同分析需要，选取不同的柱材料和溶剂，以实现不同的分离结果。
比如，选择极性分子容易沉淀的柱材料和溶剂，可以有效地实现有机物的选择性分离。
另一方面，将非常稳定的离子溶剂和非极性柱材料结合应用，可以有效地实现无机盐类混合物的分离及鉴定。
层析分离法有一定的局限性，最主要的限制是柱材料的种类有限，而且这种方法只能分离出混合物中较大的分子，而小分子可能无法有效地分离出来。
此外，由于溶剂的不稳定性，柱材料的运动可能会受到影响，导致测定结果的不准确。
总之，层析分离法是一种广泛应用的实验分析技术，它的优点是分离准确、选择性强以及分析时间短，可以用于分离，鉴定和测定物质的组成成分和反应产物。
但是，这种技术也有一定的局限性，比如柱材料种类有限，溶剂的不稳定性等。
所以，在应用层析分离技术时，要根据实际分析需要，综合考虑和选择合适的材料，确保测定的准确性。
层析分离技术
4.2 吸附层析
吸附层析（Adsorption Chromatography ）是以吸附剂 为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而 达到分离目的的一种层析技术。
按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三 种类型： 物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差 化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好 交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….
的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉 素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。
大孔吸附树脂的选择和使用
选择依据： 吸附剂及吸附物的极性
一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性 物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。 吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。
常用吸附剂按其化学结构可分两类
有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附 树脂、聚酰胺等
无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅 藻土、羟基磷灰石等
常用吸附剂简介
硅胶 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换
剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子， 遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附 碱性化合物； 应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、 脂肪、氨基酸等的吸附分离。
HA的吸附机理
HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表 面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重 要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正 电荷基团的结合，则起次要作用。
大孔吸附树脂
特点 大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选
层析分离技术
立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用 石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因 此，Tsweet把这种方法称为色谱法。
2
色谱法的发展
在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的 发明。 1931年：德国的Kuhn和Lederer在Tswett实验的基础上用氧 化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分 离了60多种这类色素。 1940年：Martin和Synge提出液-液分配色谱法（LiquidLiquid Partion Chromatography）,即固定相是吸附在硅胶上的 水，流动相是某中有机溶剂。 1941年Martin和Synge提出用气体代替液体流动相的可能性。 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液 色谱方法（Gas-Liquid Chromatography），因而获得了1952年 的诺贝尔化学奖。 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open-Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管气相色谱法 （Capillary Column Chromatography）。
交换树脂表面
操作方法
1.
离子交换剂的处理
2.
装柱及上样
装柱主要是防止出现气泡和分层，装填要
均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱 时柱内先保持一定高度的起始洗脱液(一 般为柱高的1/3)，加入树脂时使树脂借水 的浮力慢慢自然沉降。装柱完毕后，用水 或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的 pH、离子强度等。
（4）按使用领域不同对色谱的分类：
①分析型色谱：主要用于各种样品的分析，其特点 是色谱柱较细，分析的样品量少。 ②制备型色谱：又可分为实验室用制备型色谱和工 业用大型制造纯物质的制备色谱。
层析分离技术图文
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
《层析分离技术》课件
总结与展望
1 优势和局限性
层析分离技术具有高效、可靠、灵活等优势，但也存在一些局限性。
2 发展趋势
层析分离技术在分离纯化效果、自动化程度和快速分析方面的发展具有很大潜力。
层析分离技术的应用
1
蛋白质纯化技术
层析分离技术在蛋白质纯化过程中起到关键作用，实现高效的纯化和分离。
2
生物大分子制备
层析分离技术被广泛应用于生物大分子的制备过程，如核酸提取和多肽纯化。
3
制药过程中的应用
总站式层析技术在制药过程中用于分离和纯化药物及其他有关的化合物。
4
其他应用领域
层析分离技术还在食品工业、环境监测等领域得到广泛应用。
应用
层析分离技术广泛应用于蛋白质纯化、生物大分子制备等领域。
层析分离技术的基本原理
1 分子相互作用
层析分离技术基于分子之 间的相互作用，如电荷、 亲疏水性等。
2 物质分子分配系数
物质分子在不同相之间的 分配系数决定了其分离程 度。
3ห้องสมุดไป่ตู้层析柱构成要素
层析柱由填料、梯度溶剂 和流动相等要素构成，起 到分离和纯化作用。
层析分离技术的分类
分离机理
按照分离机理，层析 分离技术可分为吸附 层析、分配层析和离 子交换层析。
层状介质特性
根据层状介质的特性， 可将层析分离技术分 为薄层层析、柱层析 和高效液相层析。
介质形态
介质形态包括液态层 析、凝胶层析和纤维 素层析等。
操作方式
操作方式包括亲和层 析、吸附剂层析和凝 胶过滤层析等。
《层析分离技术》PPT课 件
层析分离技术是一种基于分子之间相互作用的分离技术，通过物质分子在不 同相之间的分配系数实现分离和纯化的方法。
层析分离技术
层析分离技术层析分离技术是一种重要的分离方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
它基于物质在不同相之间的分配差异，通过多次分配和分离步骤，将混合物中的组分分离开来。
本文将从层析分离技术的原理、类型和应用方面进行介绍。
一、层析分离技术的原理层析分离技术基于物质在不同相中的分配差异，利用不同相中物质的亲疏水性、极性、分子尺寸等特性进行分离。
其原理可以概括为：当混合物通过固定相（静相）时，不同组分会因其与固定相的相互作用力不同而以不同速度通过固定相，从而实现分离。
1. 柱层析：柱层析是最常见的层析分离技术，其主要包括液相层析和气相层析两种形式。
液相层析是在液相中进行分离，常见的有凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等；气相层析则是在气相中进行分离，常见的有气相色谱层析、气体吸附层析等。
2. 纸层析：纸层析是一种简单易行的层析分离方法，主要用于分离和鉴定有机化合物。
通过将样品溶液滴到纸上，然后在纸的一端浸入溶剂中，溶剂在纸上上升时，样品中的组分会因其与纸或溶剂的相互作用力不同而以不同速度迁移，从而实现分离。
3. 薄层层析：薄层层析是将样品溶液均匀涂布在薄层层析板上，然后将其浸入溶剂中进行分离。
薄层层析具有操作简便、分离效果好的特点，广泛应用于药物分析、天然产物分离等领域。
三、层析分离技术的应用1. 生物化学：层析分离技术在生物化学研究中得到广泛应用，如蛋白质纯化、核酸提取、酶活性分析等。
2. 药物分析：层析分离技术是药物分析中常用的方法之一，可以用于药物的纯化和分离、药物代谢产物的分析等。
3. 环境监测：层析分离技术可以用于环境中有机物、无机物和杂质的分离和测定，如水质检测、土壤污染分析等。
4. 食品安全：层析分离技术在食品安全领域也有广泛应用，可以用于食品中有害物质的检测和分离，如农药残留、重金属含量等。
层析分离技术作为一种重要的分离方法，具有原理简单、分离效果好、应用广泛的特点。
通过不同类型的层析分离技术，可以实现对混合物中不同组分的高效分离和纯化。
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
层析的原理和应用
层析的原理和应用1. 层析的概念和基本原理层析（Chromatography）是一种将混合物中的组分分离和提纯的技术方法。
它基于组分之间在固定相和流动相之间的相互作用力的不同，使各种组分在系统中以不同速度迁移，达到分离的目的。
层析技术广泛应用于化学、生物、环境等领域。
层析技术的基本原理是利用流动相在固定相上的移动来实现物质的分离。
固定相通常是具有一定吸附性或分配性的材料，如硅胶、纸张、亲水性基质等。
流动相则是将待分离的混合物溶解在溶剂中，通过与固定相的相互作用，使各组分在固定相上以不同速率迁移。
2. 层析技术的分类和应用层析技术根据其基本原理和操作方式的不同，可以分为多种类型。
以下是其中几种常见的层析技术及其应用：2.1 薄层层析法（TLC）薄层层析法是一种在薄层材料上进行的层析技术。
常用的薄层材料包括硅胶和氧化铝等。
它具有简单、快速、经济的特点，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
2.2 柱层析法柱层析法是将固定相填充在柱中，通过流动相沿着柱内固定相的分布，实现各组分的分离。
根据固定相的不同，柱层析法又可分为凝胶柱层析和高效液相层析等。
柱层析法在药物分离纯化、天然产物提取、有机合成等领域具有广泛应用。
2.3 气相层析法（GC）气相层析法是将待分离的混合物蒸发为气体状态，通过在柱中固定相的分离，最终使各组分在检测器上进行定性和定量分析。
气相层析法广泛应用于石油化学、环境监测、食品安全等领域。
2.4 液相层析法（LC）液相层析法是将待分离混合物溶解于液相，在柱中利用固定相进行分离。
液相层析法根据流动相的不同，可分为常压液相层析和高效液相层析等。
液相层析法在制药、生物、环保等领域具有广泛应用。
2.5 离子层析法（IC）离子层析法是利用不同组分之间的化学亲合性进行分离的一种层析技术。
它广泛应用于水质分析、环境监测、生物学研究等领域，尤其是对离子的分析具有很高的选择性和灵敏度。
3. 层析技术的优点和局限性层析技术具有许多优点，使其成为众多分析方法中的重要手段。
薄层层析分离技术的原理和应用
薄层层析分离技术的原理和应用薄层层析分离技术（Thin Layer Chromatography，TLC）是化学分离分析技术中的一种经典的方法，它在各种科研领域中得到了广泛的应用。
本文将从原理和应用两个方面对薄层层析分离技术进行介绍。
一、原理1. 薄层层析分离技术的基本原理薄层层析分离技术是基于化学物质在固定相（薄层硅胶等）和流动相（含有溶剂的液相）中运动时的协同作用来进行物质分离的一种方法。
化学物质在固定相中会因为与涂层材料之间的极性和吸附性差异而发生分离，因此这种分离技术常常被用来对复杂混合物中的化学物质进行定性或定量分析。
2. 薄层层析分离技术的过程薄层层析分离技术的过程可以分为三个步骤：样品的制备、薄层涂层材料的选取和设备的制备。
（1）制备样品：将待分离物质用适当的溶剂溶解或提取，制成样品溶液。
（2）选取涂层材料：涂层材料要选用与待分离物质有足够的吸附能力的固体物质，如硅胶、氧化铝等。
然后将这些固体物质均匀地涂在无水薄层板上，使涂层厚度相同。
（3）设备制备：设备一般由薄层板、涂层材料和流动相组成。
待分离物质通过样品施加在薄层层析板的一边，此时，待分离物质会根据其在涂层材料和流动相之间的吸附和分配状态沿着板子逐渐移动。
二、应用1. 定性分析薄层层析分离技术在化学分离分析领域的应用最广泛的就是对化学物质进行定性分析，如有机分析中对结构相似的物质进行鉴定。
2. 定量分析薄层层析分离技术还可以用来进行化学物质的定量分析。
在这种情况下，定量方法是比定性方法更复杂的，因为有必要确定待分离物和标准物在吸附场中的吸附和分配行为，并且必须保证定量方法的准确性和精密度。
3. 活性物质检测薄层层析分离技术除了可以用来分离和检测化学物质，还可以用来检测活性物质，如抗菌物质、抑制物和酶。
4. 生物分离薄层层析技术在生物分离领域中也有应用。
如用于蛋白质的纯化，薄膜层析也可以作为分离生物样品中的氨基酸或核苷酸的一种方法，还可以通过薄层层析技术提取和分离植物中的生物活性成分。
层析分离技术二吸附层析
PART 05
吸附层析的优缺点
优点
高选择性
吸附层析法可以选择性地分离和纯 化目标物质，对于特定结构和性质
的化合物具有较高的分离效果。
操作简便
吸附层析的操作相对简单，只 需选择合适的吸附剂填充到层 析柱中，然后进行洗脱即可。
适用范围广
吸附层析可以用于分离各种类 型的化合物，包括有机物、无 机物和生物大分子等。
分离效果好
吸附层析的分离效果较好，能 够实现高纯度物质的分离和纯
化。
缺点
吸附剂选择限制 吸附层析的成功与否很大程度上 取决于吸附剂的选择，有时需要 针对特定化合物进行筛选和制备。
操作压力大 在吸附层析过程中，由于需要较 高的操作压力来推动流动相通过 层析柱，可能会导致柱床的压实 和分离效果的降低。
填充介质
将吸附剂填充到柱子中，确保填充均匀、紧密， 无气泡和间隙。
柱子压力
控制柱子的压力，确保介质填充稳定，避免介质 流失或压实。
上样
01
02
03
样品的准备
将待分离的样品进行适当 处理，如溶解、稀释、离 心等，确保样品适合上样。
上样方式
选择合适的上样方式，如 直接上样、分批上样或连 续上样，确保样品与吸附 剂充分接触。
引言
层析分离技术的概述
01
层析分离技术是一种基于不同物 质在固定相和流动相之间分配平 衡的差异，从而实现混合物中各 组分分离的物理化学分离方法。
02
该技术广泛应用于生物、医药、 食品、化工等领域，用于分离纯 化各类生物分子、有机化合物和 无机离子等。
吸附层析的原理和应用
吸附层析的原理是利用固体吸附剂对不同组分 吸附能力的差异，通过流动相的洗脱实现各组 分的分离。
层析技术基本原理及应用
层析技术（Chromatography）是一种用于分离混合物中不同成分的重要方法，广泛应用于化学、生物化学、药学等领域。
以下是层析技术的基本原理及应用：
基本原理：
1. 分离原理：
-层析技术利用不同物质在固定相（stationary phase）和移动相（mobile phase）之间的分配系数不同来实现分离。
-样品在固相上受到吸附力和解吸力的影响，在移动相的推动下，不同组分以不同速度迁移，最终实现分离。
2. 类型：
-按照相对位置可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
-常见的层析技术包括气相色谱、液相色谱、离子色谱、薄层色谱等。
应用领域：
1. 生物化学：
-在蛋白质纯化、药物筛选、基因分析等方面广泛应用。
-用于分离和鉴定生物样品中的蛋白质、氨基酸、核酸等生物分子。
2. 制药工业：
-用于药物分析、药物提取和纯化等环节。
-常用于药物配方中主成分和杂质的分离和检测。
3. 环境监测：
-用于水质、大气、土壤等环境样品中有害物质的检测与分析。
-能够帮助监测环境中的污染物并进行有效处理。
4. 食品安全：
-在食品中添加剂、残留农药、重金属等的检测和分析中发挥作用。
-有助于确保食品安全和合规。
总的来说，层析技术通过精密的分离原理和操作流程，可以对复杂混合物进行高效分离和分析，为科学研究和工业生产提供了重要的技术支持。
层析技术的种类及其基本原理
层析技术的种类及其基本原理层析技术是一种分离化合物的方法，它是基于物质在不同相中的分布系数不同而实现的。
层析技术主要包括三种类型：薄层层析、柱层析和气相色谱。
一、薄层层析1.1 基本原理薄层层析是一种简单易行的分离方法，它利用了化合物在固定相和移动相之间的分配系数差异进行分离。
通常情况下，我们将待测样品涂在硅胶或氧化铝等吸附剂上，然后将其放置在一个玻璃板上，形成一个薄而均匀的涂层。
接着，我们将这个玻璃板放入一个密闭的槽中，在槽底部加入适量移动相。
当移动相向上升时，它会与样品发生反应并带走它们。
由于不同化合物在固定相和移动相之间具有不同的分配系数，因此它们会以不同速度被带走，并最终被分离出来。
1.2 分类根据吸附剂的不同，薄层层析可以进一步分为硅胶层析、氧化铝层析和纸层析等。
1.3 应用薄层层析广泛应用于食品、化妆品、药品等行业中，用于分离和鉴定其中的成分。
二、柱层析2.1 基本原理柱层析是一种利用固定相和移动相之间的互作用进行分离的方法。
通常情况下，我们将待测样品注入到一个装有固定相的柱子中，然后通过加入适量移动相来进行分离。
在这个过程中，不同化合物会以不同速度被带走，并最终被分离出来。
2.2 分类根据固定相的不同，柱层析可以进一步分为凝胶柱层析、反相柱层析和离子交换柱层析等。
2.3 应用柱层析广泛应用于生物技术、制药工业以及环境监测等领域中，常用于纯化和提取目标物质。
三、气相色谱3.1 基本原理气相色谱是一种利用气体载流体将混合物分离成单独组分的方法。
通常情况下，我们将待测样品注入到一个装有固定相的柱子中，然后通过加热来蒸发样品中的化合物，并将它们带入气相。
接着，我们将气相送入到一台质谱仪中进行分析。
在这个过程中，不同化合物会以不同速度被带走，并最终被分离出来。
3.2 分类根据固定相的不同，气相色谱可以进一步分为毛细管气相色谱、开放管气相色谱和微柱气相色谱等。
3.3 应用气相色谱广泛应用于食品、环境、制药等领域中，常用于分析和鉴定其中的成分。
层析分离的基本原理
层析分离的基本原理层析分离的基本原理1. 层析分离的定义层析分离（Chromatographic Separation）是一种常用的物质分离技术，通过样品在固定或液相介质中的运动速度差异，使不同组分在给定条件下相互分离。
层析分离技术广泛应用于化学、生物、制药等多个领域。
2. 层析分离的主要原理层析分离的主要原理是基于分子在吸附剂上的相互作用，其中吸附质与固定相通过物理吸附或化学吸附相互作用，从而分离出不同成分。
3. 层析分离的基本步骤层析分离通常包括以下几个基本步骤：•样品加载：将待分离的样品溶液加载到固定相或液相上。
•洗涤：通过洗涤剂，去除样品中的杂质，使得目标物质更加纯净。
•洗脱：通过改变流动相组成或条件，使目标物质从吸附剂上脱附，实现分离。
•采集分离产物：脱附的目标物质被采集以获取纯净的样品。
4. 层析分离的分类根据分离介质的性质和相之间的联系，层析分离可分为多种类型，常见的包括：•吸附层析：通过目标物质与吸附剂的物理或化学吸附进行分离。
•离子交换层析：基于离子交换树脂对样品中的离子进行选择性吸附和释放。
•凝胶层析：利用凝胶材料对分子的尺寸选择性吸附和分离。
•气相层析：利用固定相和流动相的相互作用分离气体中的成分。
5. 层析分离的应用领域层析分离技术在众多领域中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：•制药领域：用于药物的提取纯化、药效物质的分离等。
•化学领域：用于化学品的生产、分离和纯化。
•生物学领域：用于蛋白质、细胞等生物分子的分离和纯化。
•环境分析：用于环境样品中有害物质的分析和监测。
•食品安全：用于检验和分离食品中的添加物、残留物等。
6. 层析分离的优势和不足层析分离具有以下优势：•高效：能在短时间内分离和纯化目标物质。
•选择性强：能针对具体的目标物质进行选择性吸附和分离。
•可逆性：可通过调整条件实现目标物质的洗脱和重复利用。
然而，层析分离也存在一些不足之处：•对分子大小敏感：无法对相似大小的分子进行有效分离。
第五章 层析分离技术
Resolution: depends on efficiency and selectivity
27
层析分离的基本概念
色谱柱的理论塔板数N与高度H
tR 2 N 5.54( ) W1/ 2
N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽
AU280
理论塔板高度：L---柱长
Wh = Peak width at half peak height Vr
22
层析分离的基本概念
分配系数 可由Langmuir方程得出
q Kd c K ---分配系数
d
q、c---溶质在固相和液相中的浓度
23
层析分离的基本概念
滞留时间（tR）和滞留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱 过程的基本热力学参数之一
24
层析分离的基本概念
洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱 体积
20
3、有机溶剂沉淀
降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间 的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩， 导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生 沉淀。
21
五、层析系统的基本概念及要求
Resolution Efficiency Selectivity Symmetry
3
第一节 层析概述
一、层析的原理
层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的 混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化 性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、 结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比） 不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两 相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。
层析技术实验报告
一、实验目的1. 了解层析技术的原理和方法。
2. 学习并掌握薄层层析和凝胶过滤层析两种层析技术的操作步骤。
3. 通过实验，分离和鉴定混合物中的不同组分。
二、实验原理层析技术是一种基于物质在固定相和流动相之间分配系数的差异，使混合物中的各组分分离的方法。
本实验采用薄层层析和凝胶过滤层析两种技术进行分离。
1. 薄层层析（TLC）：利用样品中各组分在固定相（薄层板）和流动相（溶剂）中的吸附或溶解性能差异，使各组分在薄层板上分离。
2. 凝胶过滤层析：利用凝胶介质中的孔径梯度，只允许小分子通过，而大分子被阻拦，从而实现不同大小分子的分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合物、硅胶薄层板、氧化铝薄层板、凝胶柱、凝胶片、溶剂、显色剂等。
2. 实验仪器：薄层层析仪、凝胶过滤层析仪、显微镜、电子天平等。
四、实验步骤1. 薄层层析分离实验（1）制备薄层板：将硅胶或氧化铝均匀涂布在玻璃板上，晾干后切成小块。
（2）点样：用微量移液器吸取混合物，点在薄层板上，点样原点尽量小而圆，直径不超过2mm。
（3）展开：将点样后的薄层板放入装有溶剂的层析缸中，使溶剂前沿距离薄层板边缘约2cm，盖上盖子，待溶剂前沿到达预定位置时取出薄层板。
（4）显色：将分离后的薄层板放入显色剂中，观察各组分在薄层板上的位置。
2. 凝胶过滤层析分离实验（1）准备凝胶柱：将凝胶柱固定在层析架上，用溶剂冲洗凝胶柱，使凝胶均匀填充柱内。
（2）上样：将混合物样品通过注射器注入凝胶柱中。
（3）洗脱：用溶剂洗脱凝胶柱，收集洗脱液。
（4）显色：将收集到的洗脱液进行显色，观察各组分在凝胶柱上的位置。
五、实验结果与分析1. 薄层层析分离实验通过观察薄层板上的分离结果，可以看出混合物中的各组分在薄层板上的位置，从而分离出不同组分。
2. 凝胶过滤层析分离实验通过观察凝胶柱上的分离结果，可以看出混合物中的不同大小分子在凝胶柱上的位置，从而分离出不同大小的分子。
六、实验结论1. 通过薄层层析和凝胶过滤层析两种技术，成功分离了混合物中的不同组分。
四种层析方法
四种层析方法层析方法是一种将混合物中的化合物分离出来的方法。
这种技术通过利用化合物在固定相和移动相之间的不同亲和性来实现分离。
层析方法因其简单性和广泛的适用性而成为化学、生物化学和制药学中最基本的分离技术之一。
本文将介绍四种常见的层析方法，包括薄层层析法、气相层析法、离子交换层析法和凝胶层析法。
这些方法将被讨论其原理、应用、实施步骤和优缺点。
一、薄层层析法薄层层析法（TLC）是一种快速、低成本的液相分离技术。
该技术将被分析物和固定相通过一个毛细管作为裂隙分裂（slit split），使用一层非极性或极性的固定相作为分离基质，包括硅胶、氧化铝和氢氧化铝。
被分离的化合物随着移动液相在固定相上移动，不同化合物基于其不同亲和性分配到不同位置上。
该方法的实施步骤包括样品的准备、涂抹和显色步骤。
样品通常被溶解在一个合适的溶剂中，并用玻璃毛细管将其施加到固定相上。
一旦样品施加到固定相上，被分离的化合物将随着移动液相在固定相上移动。
显色可以通过利用化学试剂或紫外线进行检测。
TLC 广泛应用于化学、生物化学和制药学中，用于分析中等大小的有机和无机化合物，如氨基酸、脂肪酸、天然产物和药物。
优点：TLC是一种快速、低成本的分离技术，对于中等大小的化合物具有很好的分离效果。
TLC可以用于大规模样品纯化，并且可以被用于对化合物混合物进行初步分析的快速筛选。
缺点：TLC存在分离效率低和灵敏度低的问题，并且与其他层析技术相比，其分辨率相对较低。
TLC在数据分析方面存在可重复性差的问题。
二、气相层析法气相层析法（GC）是一种对挥发性和半挥发性化合物进行分离的技术。
此方法使用长列的液体或固定相，将待分离的化合物从液态或气态的样品中吸附并分离出来。
通过加热样品，在固定相中获得了一个气态分离的组分，可以将化合物通过检测器进行检测。
该方法通常使用非极性液态或固态固定相，如聚硅氧烷或聚乙二醇。
GC也可以选择更具有极性的固定相，从而实现对更极性化合物的分离。
层析的概念
层析的概念层析的概念层析是一种物理化学分离技术，利用样品中不同成分在固定相（也称为层析柱）和流动相（也称为移液相）之间的差异性，通过逐渐分离出各个组分达到纯化或者分离的目的。
层析技术广泛应用于生物、化学、制药等领域中。
一、层析技术的基本原理1.1 固定相固定相是指在某种材料上涂覆或者填充有一种特殊化合物，这种化合物能够与样品中成分发生作用，并且能够将不同成分区分开来。
常见的固定相包括硅胶、氧化铝、聚合物等。
1.2 流动相流动相是指在固定相中流动的液体，它可以将样品输送到固定相上，并且通过与固定相发生作用来实现成分之间的分离。
流动相可以是单一溶剂或者是多种溶剂混合而成的溶剂体系。
1.3 分离原理在层析过程中，样品中不同成分会因为它们与固定相和流动相之间作用力的不同而被逐渐分离。
比如，如果一个成分在固定相上的亲和力比较强，那么它就会在固定相上停留的时间比较长，从而与其他成分分离开来。
二、层析技术的分类2.1 按照固定相的不同，层析技术可以分为几种类型：- 气相层析（GC）- 液相层析（LC）- 离子交换层析（IEC）- 亲和层析（AC）- 尺寸排除层析（SEC）2.2 按照流动相的不同，层析技术可以分为几种类型：- 反相层析- 正相层析- 离子对反向色谱- 亲和色谱三、常用的层析技术3.1 气相层析气相色谱是一种利用气体作为流动相，在某种特殊材料上涂覆有化合物作为固定相，在高温下将样品中各个组分逐渐分离出来的技术。
气象色谱广泛应用于环境、食品、制药等领域。
3.2 液相色谱液象色谱是一种利用液体作为流动相，在某种特殊材料上涂覆有化合物作为固定相，通过逐渐分离出各个组分达到纯化或者分离的目的。
液相色谱广泛应用于生物、制药、食品等领域。
3.3 离子交换层析离子交换层析是一种利用带电荷的固定相与样品中带电荷的成分之间发生作用，通过逐渐分离出各个组分达到纯化或者分离的目的。
离子交换层析广泛应用于制药、生物等领域。
层析分离原理
层析分离原理层析分离原理（也称层析分离，LC）是一种基于化学层析理论的分离和纯化技术，可用于分离同一样品中的多种化合物。
层析分离技术最早由美国的Robert K. Schenck和C.G. Cremer于1948年提出，一直被广泛应用于实验室或工业生产中。
它具有实验简便、效率高、低成本、再现性强等优点，在分析测定、药物及活性物质纯化等领域有广泛的应用。
一般而言，层析分离原理是在一定条件（如温度、pH等）下，采用能够与多种物质在体系中相互作用的吸附剂作为载体，将其与溶解体系中的混合物分开，从而达到分离及纯化的目的。
层析分离的基本程序包括质谱和吸附两个部分，分别在吸附管内和外进行。
质谱部分主要是溶解体系和吸附剂的混合，以达到不同的混合物的分离效果；吸附部分是将质谱部分分离出的混合物分离成更加纯净的化合物。
层析分离中，通常需要使用常见的几种表观效应，如拉斯维加斯效应（LVSE）、蒙古斯塔因效应（MSIE）、拉伯效应（RAVC）以及离子交换效应（IC）。
在分离过程中，这些表观效应的存在将决定分离的结果。
拉斯维加斯效应，是指物质溶液中存在一种吸附作用，使它们在表面上形成一层膜，从而形成一种交互作用。
这一表观效应在特定pH值、温度、压强条件下发生，如果系统状态符合，则可以在有限的质量范围内，使溶解体系中的两种成分互相分离，形成了层析分离状态。
拉伯效应，是指在给定条件下，流动态能即溶解体系中的某种物质有一种表面张力，使这种物质的溶解性在的大的pH范围内保持稳定，而造成表观效应。
此表观效应可用于解决分离技术中的问题，如在某物质的溶解性不受pH变化影响的状况下，采用pH的变化来实现对这种物质的分离纯化。
蒙古斯塔因效应，是指溶解体系中存在一种“蒙古斯塔因效应”，使物质沉淀在吸附剂上，而不是分散在溶液体系中，从而形成表观效应。
在层析分离过程中，蒙古斯塔因效应可以在化学性质较活泼的物质之间发挥重要作用，使得分离过程更加高效。
层析分离技术
层析分离技术层析分离技术是一种在化学分析中常用的分离技术，通过不同物质在固相与液相之间的分配系数差异来实现分离。
该技术广泛应用于环境监测、食品安全、药物分析等领域，具有高效、灵敏、选择性好等优点。
层析分离技术的基本原理是根据不同物质在固相与液相之间的分配行为来实现分离。
在层析柱中填充有固定相，通常为多孔性的吸附剂或离子交换剂。
样品溶液经过层析柱时，不同成分在固相与液相之间的分配系数不同，从而在柱中发生分离。
层析分离技术的基本步骤包括样品处理、样品注入、洗脱和检测等。
首先，对样品进行必要的前处理，如提取、浓缩、稀释等，以适应层析分离的要求。
然后，将样品注入层析柱，样品中的不同成分在固相与液相之间进行分配。
根据不同物质的亲和性差异，可以通过改变液相的成分、pH值或温度等条件来调节分离效果。
接着，通过洗脱剂的使用，将目标物质从固相上洗脱下来。
最后，对洗脱液进行检测，可以使用各种分析方法，如光谱法、电化学法、质谱法等，对目标物质进行定量或定性分析。
层析分离技术有多种类型，常见的有薄层层析、柱层析、气相层析等。
薄层层析是一种简单、快速、经济的分离方法，广泛应用于药物分析、农药残留检测等领域。
柱层析是一种常用的分离技术，通过将样品溶液通过填充有固定相的柱子进行分离，可实现复杂样品的分离与纯化。
气相层析则是利用气体作为载气相，将样品中的揮发性成分进行分离，适用于挥发性物质的分析。
层析分离技术在实际应用中具有广泛的优势。
首先，层析分离技术可以实现对复杂混合物的分离与纯化，可用于样品预处理、纯化与富集等过程。
其次，层析分离技术具有高效、灵敏的特点，能够对微量物质进行分离与检测。
此外，层析分离技术选择性好，可通过调节条件来实现对目标物质的选择性分离。
最后，层析分离技术操作简单，设备成本低，易于实施。
层析分离技术是一种常用的分离技术，通过不同物质在固相与液相之间的分配行为来实现分离。
该技术在环境监测、食品安全、药物分析等领域具有广泛应用，具有高效、灵敏、选择性好等优点。
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Ft V R R •=m s m s V V K q q k =='b u 色层分离技术色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。
按固定相的基质（载体）类型分类：层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。
色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。
也有人将层析称为色谱。
用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。
层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。
高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。
色层分离过程包含两部分：●固定相：载体或载体+功能基团●流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。
液相色谱的基本原理和参数●保留时间(t R )和保留体积(V R )从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用t R 表示。
在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用V R 表示。
理论塔板数的计算公式为：2)(σRt N =容量因子k ' 和平衡常数K某物质的k '定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。
而平衡常数K 为平衡时，物质在两相的浓度比：)()('m s q q k 物质在流动相的量物质在固定相的量=)/)/(m m s s V q V q K 物质在流动相的浓度（物质在固定相的浓度= Vs 和Vm 分别为柱内固定相和流动相所占的体积。
于是有 溶质在固定相停留的时间分数= '1'k k q q q m s s +=+ 溶质在流动相停留的时间分数'11k q q q m s m +=+= 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：)'11(k u u m b += 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比： Ro R m b t t u u = )'1(0k t t R R += 当柱外死体积可忽略不计时，m R V V =0 s m m m R KV V k V V V +=+='0'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-= 柱效率： 塔板高度（H ）和塔板数（N ）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。
塔板高度（H ）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP 或H)。
理论塔板数的计算公式为： 式中R t 为标准偏差。
理论塔板高度为： 式中， L − 柱长。
m u 2)(σR t N =L H =m R V V =00'0001'RR R R R R R t t t t t t t k =-=-=塔板高度小，塔板数高，色谱分离效率高。
●影响柱效的因素（1）理论塔板高度随填料粒度减少而减少；（2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效；（3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于柱高减小；（4）分子量较小的样品分子柱高较小。
色层分离的类型●凝胶筛分●离子交换●反向色谱●疏水色谱（层析）●亲合色谱（层析）凝胶过滤层析（体积排阻色谱）Gel filtration chromatography,GFCSize exclusion chromatograpy，SEC是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大小进行分离的层析技术。
应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。
一般用作原料液的初分离，获取几个不同分子量物质分级，供进一步分离纯化使用。
●分离原理：含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出色谱柱（层析柱）。
较小的分子可通过部分孔道、更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体）内部。
这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分离的目的。
●凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关。
（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；（3）具有一定的孔径分布范围；（4）机械强度高，允许较高的操作压力。
常用的分离介质●天然及高分子介质经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚乙烯醇类合成凝胶（TSKgel）。
（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G 后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。
例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。
交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。
因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。
一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。
琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
交联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P ），由美国Bio-Rod 厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
凝胶过滤的特点是：填料多为带有羟基、但不带电荷的惰性材料，亲水性能好，又不与待分离物质发生作用，因此分离条件温和，蛋白质回收率高，重现性好；工作范围广，分离分子量的覆盖面大可分离几百到数百万分子量；设备简单、易于操作，周期短。
填料再生性好，可连续使用数百次到上千次。
功能脱盐：分离大小两类不同的分子即无机盐与生物大分子；分级：将分子大小相近的物质分开，通常为大分子间的分离。
缺点：凝胶强度低，可耐受的压力通常低于0.2个大气压，故流速低，通常的线速度小于20cm/h 。
因此，处理速度较慢。
但Superdex 的最大耐受压力可达15个大气压，流速也提高近10倍。
无机填料：表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以外的其他效应。
优点：可耐受较高的压力，最高压力可达上百个大气压。
具有较高的柱效率和分离度。
缺点：pH 的适用范围窄。
以硅胶为基质的填料，pH 范围在2.0-7.0，如果超过了这个范围，将会使有机层的溶解速率加快，减少柱子寿命。
凝胶特性参数（1）排阻极限（exclusion limit):凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
不同的凝胶过滤介质品牌具有不同的排阻极限。
Sephadex G50的排阻极限是30kD 。
（2）分级范围（fractionation range):即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。
Sephadex G-50的分级范围为1.5 ~30kD.（3）溶胀率：某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G 系列），使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，即Sephadex G50 的溶胀率为500%±30%。
（4）凝胶粒径：一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。
粒径越小，分离效率越高。
软凝胶粒径较大，一般为50 ~ 150μm ，硬凝胶粒径较小，一般为5 ~ 50 μm 。
Sepharose 和Sephadex 凝胶粒径分布为45 ~ 165 μm ，而Superdex 和TSK Toyopearl HW 系列可小到20 ~ 40 μm ，甚至6 ~ 10 μm 。
（5）床体积（bed volume ）即1g 干燥凝胶溶胀后所占的体积。
Sephadex G50的床体积为9 ~ 11cm 3/g 干胶。
（6）空隙体积（void volume)指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即V 0值。
空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。
一般使用相对分子质量为2000kD 的水溶性兰色葡聚糖。
影响分离特性的因素1、填料分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比是选择填料要考虑的首要问题。
目前TSK 系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱，其特点是分离度高和吸附性小。
2、柱长体积排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，因此应根据分离的要求确定柱长，一般柱%100⨯-=干燥重量干燥重量）（溶胀处理平衡后重量溶胀率长60-120厘米对于蛋白质的分离比较理想，而长30厘米的柱子多用于快速分离。
3、洗脱液洗脱液的pH值和离子强度都将影响到分离效果。
以硅胶为基质的填料，pH范围在2.0-7.5,如果超出这个范围，将会使键合相的有机层溶解。
当离子强度很低时，TSK系列凝胶柱上的硅醇基会与待分离的蛋白发生离子反应，一般通过加入0.3-0.5mol/L的NaCl来抑制。
蛋白质和柱填料的疏水作用一般通过加入5-10%的乙醇或异丙醇来控制。
3、流速是影响蛋白质分离的重要因素。
一般流速低分离效果好。
如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在0.5-1.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。
4、样品容量进样体积和样品浓度将明显影响到蛋白质的分离度，高浓度、小体积对分离有利。