层析分离技术.

F

t V R R •=m s m s V V K q q k =='b u 色层分离技术

色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。

按固定相的基质（载体）类型分类：

层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。

色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。也有人将层析称为色谱。

用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。

层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。

高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。

色层分离过程包含两部分：

●固定相：载体或载体+功能基团

●流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。

液相色谱的基本原理和参数

●保留时间(t R )和保留体积(V R )

从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用t R 表示。在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用V R 表示。 理论塔板数的计算公式为：2)(σR

t N =

容量因子k ' 和平衡常数K

某物质的k '定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。而平衡常数K 为平衡时，物质在两相的浓度比：)()('m s q q k 物质在流动相的量物质在固定相的量=

)

/)/(m m s s V q V q K 物质在流动相的浓度（物质在固定相的浓度= Vs 和Vm 分别为柱内固定相和流动相所占的体积。于是有 溶质在固定相停留的时间分数= '

1'k k q q q m s s +=+ 溶质在流动相停留的时间分数'11k q q q m s m +=+= 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：)'

11(k u u m b += 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反

比： R

o R m b t t u u = )'1(0k t t R R += 当柱外死体积可忽略不计时，m R V V =0 s m m m R KV V k V V V +=+='

0'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-= 柱效率： 塔板高度（H ）和塔板数（N ）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。

塔板高度（H ）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP 或H)。

理论塔板数的计算公式为： 式中R t 为标准偏差。

理论塔板高度为： 式中， L − 柱长。 m u 2)(σR t N =L H =m R V V =00'0001'R

R R R R R R t t t t t t t k =-=-=

塔板高度小，塔板数高，色谱分离效率高。

●影响柱效的因素

（1）理论塔板高度随填料粒度减少而减少；

（2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效；

（3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于柱高减小；

（4）分子量较小的样品分子柱高较小。

色层分离的类型

●凝胶筛分

●离子交换

●反向色谱

●疏水色谱（层析）

●亲合色谱（层析）

凝胶过滤层析（体积排阻色谱）

Gel filtration chromatography,GFC

Size exclusion chromatograpy，SEC

是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大

小进行分离的层析技术。

应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离和

除盐。一般用作原料液的初分离，获取

几个不同分子量物质分级，供进一步分离纯化使用。

●分离原理：

含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出色谱柱（层析柱）。较小的分子可通过部分孔道、更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体）内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分离的目的。

●凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：

（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关。

（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；

（3）具有一定的孔径分布范围；

（4）机械强度高，允许较高的操作压力。

常用的分离介质

●天然及高分子介质

经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚乙烯醇类合成凝胶（TSKgel）。

（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）

⑴Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G 后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。（二）琼脂糖凝胶：

商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。

（三）聚丙烯酰胺凝胶：

是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加