PEG诱导细胞融合

科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合日期2013.03.07 姓名*** 系年级2011级生物基地学号***

实验一利用聚乙二醇为媒介物进行细胞融合

摘要

细胞融合(cell fusion)是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。

诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。

关键词

细胞融合；人工诱导；PEG

前言

人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。

细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。

一．实验目的

1.了解动物细胞融合的常用方法及原理。

2.掌握利用PEG为介导物对细胞进行诱导融合的方法。

3.观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化。

二．实验原理

化学融合剂聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是乙二醇的多聚化合物，是存在一系列不同分子量的多聚体。

PEG可诱导细胞间的融合，主要有两方面的原因：

第一，PEG可以破坏和干扰各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。第二，PEG 可与水分子借氢键结合，在高浓度的PEG 溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，引起细胞融合。为了发挥PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG 溶液，但在高浓度PEG 溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG 融合技术的关键。利用PEG诱导细胞融合,其融合效果受以下几个因素的影响：

1.PEG的分子量：细胞融合效果与PEG的分子量成正比，但PEG的分子量越大，对细胞的毒性就越大。在实验时常常采用的PEG分子量一般为800~1000。

2. PEG的浓度：细胞融合效果与PEG的浓度成正比，但PEG的浓度越高，对细胞的毒性就越大。在实验时常常采用的PEG浓度一般为40~60%。

3.PEG的pH值：经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。

4.PEG的处理时间：处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1~5分钟。

5.融合时的温度：由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。为了获得更好的融合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细,一般采用的温度为38~40℃。本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为:1).鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2).实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，为未融合细胞；有二个至多个核，为融合细胞。三．实验材料

1.材料

用Alsever液悬浮的鸡血红细胞

2.器材

普通光学显微镜、离心机、离心管、滴管、载玻片、盖玻片。

3.试剂

Alsever 液(pH7.4)、0.85％生理盐水、GKN 液、50％PEG

四．实验步骤

1.取鸡血2ml+2ml Alsever液，再加入6ml Alsever液，混匀后制悬液（4℃下保

存）。（已由老师完成）

2.取上步中所得悬液1ml+4ml 0.85％的NaCl溶液，进行以下离心处理：

1200r/min离心5min。

3.将上步的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN液至1-2ml，使

之成10%的细胞悬液。

4.取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，使每毫升含血球15000000个，

即1.5×107个/ml。

5.取步骤4中所得悬液，按以下三种方式进行混匀，滴片，2-3min后观察：（1）1ml+0.5ml 50%的PEG液（这一管标记为1号）；

（2）0.5ml+0.5ml 50%的PEG液（这一管标记为2号）；

（3）0.5ml+1ml 50%的PEG液（这一管标记为3号）。

观察在不同PEG液浓度下的细胞融合情况，并说明，细胞融合率是否随着PEG 液浓度的升高而逐渐提高。

五．实验结果

1.细胞融合观察：

2.不同PEG浓度下，细胞融合率的比较：

据实验观察比较：1ml+0.5ml 50%的PEG诱导的细胞融合率与0.5ml+0.5ml 50%的PEG诱导的细胞融合率都很低，而0.5ml+1ml 50%的PEG诱导的细胞融合率明显高于前两组。于是，可得出结论：在一定的PEG浓度范围内，随PEG浓度的升高，细胞的融合率随之升高。

六．结果分析

从实验结果可知，鸡血红细胞之间出现了不同程度的融合现象，并且随着PEG浓度的升高，融合率也随之提高。总体来说融合率还是不错的。主要原因如为：PEG的分子量、浓度、与PH值较为适合诱导细胞的融合，与鸡血红细胞悬浊液接触时间适宜，向混合液中吹气泡，使PEG与鸡血红细胞充分接触，以至