氧化应激与心肌

氧化应激与心肌

1957年美国克里夫兰临床中心，首先将大隐静脉搭桥术应用于冠心病病人，此后冠状动脉粥样硬化性心脏病血运重建治疗快速发展。冠状动脉溶栓术、经皮冠状动脉成形术、冠状动脉支架植入术、冠状动脉旁路手术已成为挽救缺血心肌的重要治疗方式。但血流恢复本身也会引起显著的损伤，部分患者在血供恢复后，出现细胞超微结构变化、细胞代谢障碍、细胞内外环境改变，导致缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion-associated tissue injury，IRI），临床表现为心律失常、心力衰竭等。IRI也出现在心脏手术、心脏移植、心肺复苏等临床情况后。目前研究表明细胞IRI的机制主要包括：氧自由基含量增多、细胞内钙超载、线粒体膜去极化等。氧化还原失衡是IRI发生的重要起始因素，但其机制和细胞中存在的保护机制尚不完全明确，本文重点对氧化应激与心肌IRI的研究进展做一综述。

1.氧化应激和ROS

氧化应激（oxidative stress，OS）主要是由于内源性和(或)外源性刺激引起机体代谢异常而骤然产生大量活性氧簇（ROS）。ROS是指在外层电子轨道含有一个或多个不配对电子的原子、原子团或分子，包括超氧阴离子（O2- ·）、过氧化氢（H2O2）、过氧亚硝酸盐（ONOO-）和羟基自由基（·OH）。ROS作为第二信使介导了许多生理性与病理性细胞事件，包括细胞分化、过度生长、增殖及凋亡。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶作为体内清除自由基的重要物质，在维持体内氧化还原平衡方面发挥重要的作用。但在IRI过程中，参与合成ROS的酶体系增多，且活性更强，如NADPH氧化酶、线粒体黄素酶、黄嘌呤氧化酶、未偶联的一氧化氮合酶、细胞色素P450、脂氧合酶、环氧合酶和过氧化物酶体，ROS的生成量明显高于细胞内的清除能力，导致氧化还原失衡。ROS虽然半衰期很短，但具有极强的氧化活性，与细胞内脂质、蛋白质、核酸等生物大分子发生过氧化反应，造成细胞结构损伤和代谢障碍。

2.ROS的主要来源

NADPH氧化酶是细胞内ROS的最主要来源，是由催化亚基gp91phox或其同系物，即非吞噬细胞氧化酶1~4(NOX1~4) 、双功能氧化酶1~2(Duox1~2) ，跨膜亚基p22phox，胞浆亚基p47phox、p67phox等蛋白分子共同组成的多亚基蛋白复合体。NOX家族蛋白亚型与跨膜亚基、胞浆亚基结合并组装成有活性的复合体后发挥其生物学功能。活化的NADPH氧化酶复合物与NADPH结合并释放2个电子，通过黄素腺嘌呤二核苷(FAD)传递给亚铁血红素，与细胞膜的外侧的2个氧分子结合生成O2-，最后生成H2O2、过氧化硝酸盐(ONOO-) 、羟基团(-OH) 及其它基团[1,2]。NOX源性的ROS在维持机体稳态中是把双刃剑，NOX源性ROS 一方面在氧化还原信号通路中起到了第二信使作用，参与多种细胞生理功能；另一方面，在高血压、动脉粥样硬化以及心肌IRI的病程中发挥了重要作用，因此单一抑制NOX活性对治疗心肌IRI并不是最好的选择。Vincent等[3]研究发现在30分钟缺血-24小时再灌注小鼠模型中，NOX4基因敲除组与NOX1和NOX2敲除组相比，表现出更大面积的心肌梗死，提示内源性NOX4 在H/R损伤中可能发挥着心肌细胞保护作用。

黄嘌呤氧化酶（XO）是IRI中ROS产生的另一重要来源，与合成抗氧化剂尿酸的黄嘌呤还原酶（XDH）作用相反。XDH/XO活力受细胞因子、细胞内化学物质及激素的调节。细胞缺血时XO活力升高，并且A TP分解产物次黄嘌呤积聚，再灌注时O2大量介入，次黄嘌呤和氧在XO作用下反应生成O2- ·和H2O2。有研究指出，XO不仅通过合成ROS参与心肌缺血再灌注损伤，XO本身可以与白细胞产生相互作用，造成微循环阻塞，导致再灌注的无复流现象。此外，XO可以直接损伤血管内皮细胞（EC）或通过ROS间接损害EC，影响心肌血流再灌注[4]。

3.ROS与细胞损伤

氧化应激反应中ROS急剧增多，造成细胞内生物大分子损伤。ROS与细胞膜的氧化反应主要是细胞膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的过氧化，生成脂质过氧化物，再经过氧化物酶分解生成丙二醛（MDA），最终磷脂结构发生变化，生物膜受到严重损伤，细胞膜和细胞器膜的液态性、流动性降低，通透性升高，造成细胞肿胀、细胞内肌红蛋白和肌钙蛋白等大分子蛋白外渗；溶酶体膜的不稳定引起溶酶外泄，激活细胞自噬通路；内质网膜受损引起Ca2+释放进入胞质导致细胞内钙超载，同时诱导内质网应激及其相关的凋亡通路。蛋白质的过氧化反应引起酶蛋白的失活，如线粒体内膜上与能量代谢有关的酶如细胞色素C还原酶、柠檬酸合酶等活性下降将导致线粒体能量代谢障碍；细胞膜受体、离子通道和肌浆网钙泵蛋白的过氧化引起细胞信号通路传导功能障碍和正常生理调节功能受损。ROS对核酸的直接攻击造成DNA断裂和染色体畸变。

4.膜结构与氧化应激

已经认识到I/R可以引起细胞膜磷脂的损伤，膜结构流动性和稳定性受损，膜稳定剂应用组与对照组相比，LDH、特异性肌钙蛋白（cTnI）的释放明显减少，细胞内Ca2+超载减弱，细胞凋亡介导因子caspase-3活性完全受抑[5]。但细胞膜的损伤也是IRI的重要机制，细胞氧化应激损伤参与其中，在缺氧-复氧造成的IRI模型中应用膜稳定剂和应用抗氧化剂可以起到相似的细胞保护作用[5]。脂筏（LR）是鞘脂和胆固醇在生物膜上构成一种微区结构，质膜微囊（Caveolae）是脂筏的一种。它们参与信号转导和物质运输，能把激素、生长因子及胞外调节分子的信号传入胞内，在信号转导中发挥枢纽作用。Caveolae与内皮型细胞一氧化氮合酶（eNOS）、NADPH 氧化酶等共同形成信号平台。Caveolae的标志蛋白陷窝蛋白-1（Caveolin-1）通过与NOXs、p22连接，将NADPH氧化酶定位在小窝上，这些与细胞氧化应激反应相关的功能性复合物形成氧化还原信号平台。富集Caveolin-1的质膜微囊影响NADPH氧化酶的组装、移位和ROS介导的信号转导[6,7]。通过Caveolin-1 siRNA敲除Caveolin-1可以抑制脂筏所介导的NADPH氧化还原信号激活[8]。缺少膜胆固醇的平滑肌细胞细胞模型中，外界不良刺激诱导的ROS的合成和细胞增殖水平降低[9]。但也有研究发现Caveolae不仅参与细胞的IRI过程，同时也起着保护作用[10]。在心肌、脑、后肢缺血性损伤模型中，Caveolin-1基因敲除小鼠与野生型相比，表现出更严重的损伤程度[11]。质膜微囊的组成除Caveolin-1外，还有Caveolin-2、Caveolin-3等。Caveolin-2具有增强质膜微囊内部结构的作用，但并不影响微囊中其他成分的表达。而在相同条件下Caveolin-3敲除的小鼠与对照组相比，IRI显著并出现线粒体肿胀，七氟醚、替普瑞酮等可通过此途径发挥对心肌的保护作用[12,13]。

5.线粒体与氧化应激

线粒体参与心肌细胞IRI的主要机制包括ATP生成减少、Ca2+过荷、ROS大量产生及线粒体膜通透性转换孔（mPTP）持续开放等，各机制之间相互关联、相互影响，共同介导了心肌I/R过程中的线粒体功能障碍，最终导致细胞凋亡、组织损伤。线粒体不仅是ROS 介导细胞氧化损伤的主要靶点，也是ROS产生的重要位点，再灌注损伤是造成线粒体ROS 生成的重要原因之一。线粒体电子传递链是ROS生成的重要来源，生理状态下，线粒体中的呼吸链利用分子氧进行氧化磷酸化产生A TP，但在心肌IRI过程中，由复合物I、II、III、IV及电子载体组成的电子传递链，其完整性遭到破坏，复合物I、III成为ROS电子来源，如复合体III的Q循环中Q0位点中半醌自由基(UQH·)是O2- ·的单电子来源，还原细胞色素C（Cyt-C）是生成H2O2的双电子供体。线粒体呼吸链产生的O2- ·和H2O2构成生物体内最大数量ROS的恒定来源。过量产生的ROS损害线粒体的膜系统，影响线粒体膜两侧的质子梯度，引起膜结构蛋白质和脂质过氧化，膜通透性增加，电子传递链活性的进一步下降，形成恶性循环，最终造成线粒体破裂[14,15]。虽然线粒体电子传递链上ROS生成的具体位点尚有争议，但呼吸链电子传递受阻仍然是呼吸链大量生成O2- ·和H2O2等ROS的必要条件。