发酵工程 第五章 种子制备

第二节 工业发酵种子的制备
一、实验室种子制备 二、生产车间种子制备
一、实验室种子制备阶段
1. 培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特 点最终的培养物可分为两类：
1.不产孢子和芽孢的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
2.产孢子的 ——获得一定数量和质量的孢子 ——获得一定数量和质量的菌体
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
如卡那霉素发酵，双种比单种的产量提高8%。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
如链霉素发酵，倒种法比单种法的产量提高12%。
5、种龄（Cell age）
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级 种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相 对较大，但是最终由实验结果定。
三、种子扩大培养的工艺流程
沙土孢子或冷冻干燥孢子→斜面孢子→摇瓶液体培பைடு நூலகம்（茄子瓶斜面培养或固体 培养基培养）→种子罐培养→发酵罐发酵
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见
设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这 些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车
间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
四、种子扩大培养的方法
1.孢子进罐法：
以孢子形式的种子直接进罐的方法 – 先在固体培养基（固化培养基）上生长繁殖成
大量孢子，将孢子直接接入种子罐扩大培养。 – 优点：一次可以制备较大量的孢子，易于保存。
既可以节省大量的人力、物力和时间，又可减 少杂菌污染的机会。 – 缺点：砂土管或冷冻管的用量大。
种子培养的最早阶段接种孢子
影响孢子种子质量的因素
1.原材料质量
麸皮，大（小）米；蛋白胨等，主要是无机离子含量不同。
2.培养温度
对多数微生物的斜面孢子质量有显著影响； 龟裂链霉菌斜面，最适温度为36.5℃～37℃；温度高于37℃，则孢子成
熟早、易老化。
3.湿度
斜面孢子培养基的湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。
2.流程
冷冻管 砂土管
斜面F1（第1代） 斜面F2（第2代）
Fn（n代 )
种子罐
3、种子培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培 养基应该是有利于孢子的生长。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般 比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基 的原料一般都比较精细。
在多级培养中，最后一级种子培养基的成分最 好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发 酵培养基后能迅速适应，快速生长。
细菌种子制备
丙酮丁醇梭菌种子制备
枯草芽孢杆菌杆菌产酶，芽孢的影响，对数期种子 食醋发酵，氧的要求，倒种 乳酸发酵，种子液中乳酸的影响，去除乳酸
棒酸clavulanic acid生产菌Streptomyces clauuligerus
（棒酸链霉菌）种子制备
菌 丝 体 种 子 制 备
固化培养基（琼脂培养基）产孢
3.菌种稳定性的检查
发酵生产的规模大，一旦发酵失败会造成很严重的经济损失。菌种的稳 定性是发酵成败的重要因素之一。因此，种子使用前一定要进行遗传稳 定性检查（如无菌镜检、摇瓶实验测产量指标）。
种子无菌进罐方法
1.松a,关E，开F，蒸汽过A，杀菌；2.关F，开E，移走a，无菌空气过A，降 温；3.松B，连接A和B，关E，C通入无菌空气，增压；4. 开E，种子压入发 酵罐；5.关E，移走种子罐，上a，开F，杀菌
4.通风与搅拌
种子罐中的两个重要因素。
5.培养时间和冷藏时间
衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段， 物质趋于分化状态。 土霉素菌种斜面培养4.5d，孢子尚未完全成熟，冷藏7～8d菌丝即开始 自溶；培养5d，孢子完全成熟，冷藏20d也不会自溶。
保证种子质量的控制措施
1.减少传代次数，防止菌种发生基因突变
②接种时密一点，得到大量的孢子。
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
二、生产车间种子制备阶段
1、培养物的选择原则
最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： (1)缩短发酵时间 (2)有利于获得好的发酵结果
2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基 的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体 的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。
6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度 质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等）
理化指标：C、N、P的含量，pH，酶活等
无污染
酵母菌种子的制备
1. 啤酒 crop ，pitching
（1）传统敞口上面发酵：top fermentations ‘middle skimmings’ ，treatments （2）锥形罐发酵 酵母活力不高，罐底环境，低温，厌氧保存 Sterols 甾醇 与氧 ，麦汁通风，酵母通风 （3）Active dry yeast (ADY) ,
第一节 概述
一、种子扩大培养的目的
1.为每次发酵罐的投料提供一定数量代谢旺 盛的种子，有利于发酵过程更早地开始。
2.缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，同时 也减少染菌机会。
二、优质种子必须具备的条件
①菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速 生长，迟缓期短；
②生理性状稳定，以得到稳定的菌体生长过程； ③具有适宜的菌体总量及浓度，满足大容量发酵的
4、接种量（Inoculation quantity）的确定
移入种子的体积 接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%、谷 氨酸为1%左右。但是一般认为大一点好（较大接种量可以缩短发 酵罐中菌体繁殖达到高峰的时间，使产物形成提前；且减少染菌 机会）。
2. 孢子培养基
孢子培养基：供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基。孢子培养 基能使菌体快速生长，并产生较多优质的孢子。
对于大多数丝状真菌和放线菌而言，种子扩大培养的目的 主要是菌种的孢子繁殖。
对孢子培养基的基本要求： 第一，有机氮源等营养不能太丰富，否则不易产孢子。
如灰色链霉菌在葡萄糖-硝酸盐的培养基上都能很好地生长和产 孢子，但若加入0.5%的酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长 孢子。
要求； ④无杂菌污染； ⑤保持稳定的生产能力，使最终产物的生物合成量
持续、稳定、高产。
种子质量的检测标准
1.无菌试验及显微镜镜检观察有无杂菌污染。 2.生化测定。糖、氮、pH、菌体浓度等代谢指
标是否合格。 3.菌丝形态，菌丝浓度，培养液外观（色泽、
气味、浑浊度、 颗粒等）。 4.产物指标，酶活等。
2.流程
菌悬液
大（小）米培养基
“亲米”
砂土管 冷冻管
琼脂斜面
大（小）米培养基 孢子悬浮液
“生产米” 种子罐
细菌孢子的制备
1.培养基与培养条件
（1）采用碳源限量而氮源丰富的配方。牛肉膏、蛋 白胨是常用的有机氮源。
（2）细菌培养温度大多数为37℃，少数为28℃。 细菌菌体培养时间一般为1～2d，产芽孢的细菌则 需培养5～10d。
0.025% 0.015%
2.薯干粉
成分
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
10% 22-28% 0.5%
3、种子罐级数的确定 谷氨酸：一级种子扩大培养，二级发酵
茄子瓶斜面或摇瓶种子→一级种子罐→发酵罐
青霉素：二级种子扩大培养，三级发酵
孢子悬液→ 一级种子罐 →二级种子罐→发酵罐 50m3
发芽罐
繁殖罐
链霉素：三级种子扩大培养，四级发酵
种子罐级数确定的依据
种子扩大的级数受发酵规模、菌体生长特性、接种 量等因素的影响。 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难， 得到的种子质量通常更高。
级数越小，越利于简化工艺及控制，并可减少 种子罐污染杂菌的机会，种子质量可能降低。
一般2-4级。
微生物每繁殖一代，其DNA就必须复制一次，微生物生长繁殖速度快， DNA复制次数多。DNA在复制过程中容易发生基因突变，导致菌种的优良 特性丧失。所以，必须控制菌种的传代次数，防止由于传代而引起的基 因突变，保证菌种的遗传稳定性。
2.提供种子培养的适宜环境条件，防止杂菌污染
菌种活化和扩大培养过程中都要严格无菌操作，培养基和培养设备要保 证无菌，防止杂菌污染。
Production fermenter
Computer control
Air Recovery
Purification Effluent treatment
Products
第五章 种子制备
概念
种子制备就是将保存在沙土管、冷冻干燥管中 处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经过摇瓶或扁瓶及种子罐逐级扩大培养而获 得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培 养物称为种子。
4、起始接种物的传代问题
细菌和酵母 保藏斜面 → 活化斜面
产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
5. 孢子培养过程
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去除变异 株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落。
Typical Bioprocess
Stock culture Microorganism cell preparation Shake flask
Seed fermenter
Raw materials Medium preparation
Medium formulation
Sterilization
1. ＧＪ开， D,I,A,B,H,E,F开， C关，实罐灭菌，
放线菌孢子的制备
1.培养基与培养条件
（1）琼脂，和其他营养成分如麸皮、豌豆浸汁、蛋 白胨、牛肉膏和一些无机盐等，碳源和氮源不要 太丰富，碳氮比例大一些为好，干燥和限制营养 可直接或间接诱导孢子的形成。
（2）多为28℃，部分为30℃或37℃。一般在4～7d， 也有的为14d左右。
2.流程
砂土管 冷冻管
1.松A,B，入蒸汽 20min，灭菌;
2.紧A,B，关E,G，开 D,F,C，无菌空气进大 罐，降温；
3.种子罐与A,B松连， 关D,H,I,C，开E,F,G, 20min；
4. 紧A,B，关E,G，开 D，保压，降温；
5.当大罐压力低于5psi， 关F，开H,I,C，压入种 子液
6.关D,H,I,C，ＡＢ加 塞，开Ｅ，Ｇ杀菌，清 管线。
母斜面
孢子悬浮液
种子罐
子斜面 孢子悬浮液
霉菌孢子的制备
1.培养基与培养条件
（1）多数采用大米、小米、玉米、麦麸等天然农产品，来 源丰富 ，适合霉菌的生长繁殖，表面积较大 。制备大 （小）米培养基，严格控制含水量，使其不粘不散。
（2）25℃～28℃，培养时间随菌种而不同，一般为4～
14d。为了使通气均匀，要注意翻动。
2. 孢子培养基
第二，所用无机盐的浓度要适量，如果过高会影响孢 子数量和颜色。 第三，pH和湿度要合适。
发酵生产上常用的孢子培养基： 麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和利 用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。 小米培养基和大米培养基常用作霉菌孢子培养基，因它们含氮 量少，疏松、表面积大，所以是较好的孢子培养基成分。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是更 接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:
一是成本 二是驯化
例：柠檬酸发酵 1.以蔗糖为原料
成分
斜面
麦芽汁 蔗糖
NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
麦汁 2%
种子罐 发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11%
固化培养基：液体培养基中加入适量的琼脂等固化剂而制成的固态 培养基。
固体培养基产孢
• 谷类作物
大麦，玉米，大米，小米，麦麸等 比表面积大，孢子量多，湿度要求大
金霉素链霉菌种子制备
孢子种子的使用
对 菌 丝 形 态 的 影 响
克 拉 维 酸 种 子 制 备
最后一级种子罐接孢子
沙 加 霉 素 种 子 制 备
2.摇瓶菌丝进罐法
① 将固体培养基上繁殖的孢子接入摇瓶液体培养 基中，使其生长繁殖成菌丝，再将摇瓶菌丝接 入种子罐扩大培养。
② 优点： 节省砂土管或冷冻管的用量，缩短菌 种在种子罐内的生长时间。
③ 缺点：菌丝不易保存，批次更换频繁，批与批 之间的种子质量有差异，容易造成生产上的波 动；由于菌丝制备工艺时间长，增加了杂菌污 染的机会。