发酵工程 第五章 种子制备

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0.025% 0.015%
2.薯干粉
成分
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
10% 22-28% 0.5%
3、种子罐级数的确定 谷氨酸:一级种子扩大培养,二级发酵
茄子瓶斜面或摇瓶种子→一级种子罐→发酵罐
青霉素:二级种子扩大培养,三级发酵
孢子悬液→ 一级种子罐 →二级种子罐→发酵罐 50m3
3.菌种稳定性的检查
发酵生产的规模大,一旦发酵失败会造成很严重的经济损失。菌种的稳 定性是发酵成败的重要因素之一。因此,种子使用前一定要进行遗传稳 定性检查(如无菌镜检、摇瓶实验测产量指标)。
种子无菌进罐方法
1.松a,关E,开F,蒸汽过A,杀菌;2.关F,开E,移走a,无菌空气过A,降 温;3.松B,连接A和B,关E,C通入无菌空气,增压;4. 开E,种子压入发 酵罐;5.关E,移走种子罐,上a,开F,杀菌
2.流程
冷冻管 砂土管
斜面F1(第1代) 斜面F2(第2代)
Fn(n代 )
种子罐
3、种子培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长,对孢子培 养基应该是有利于孢子的生长。
在原料方面,实验室种子培养阶段,规模一般 比较小,因此为了保证培养基的质量,培养基 的原料一般都比较精细。
在多级培养中,最后一级种子培养基的成分最 好能较接近发酵培养基,这样可使种子进入发 酵培养基后能迅速适应,快速生长。
2.流程
菌悬液
大(小)米培养基
“亲米”
砂土管 冷冻管
琼脂斜面
大(小)米培养基 孢子悬浮液
“生产米” 种子罐
细菌孢子的制备
1.培养基与培养条件
(1)采用碳源限量而氮源丰富的配方。牛肉膏、蛋 白胨是常用的有机氮源。
(2)细菌培养温度大多数为37℃,少数为28℃。 细菌菌体培养时间一般为1~2d,产芽孢的细菌则 需培养5~10d。
1. GJ开, D,I,A,B,H,E,F开, C关,实罐灭菌,
2.摇瓶菌丝进罐法
① 将固体培养基上繁殖的孢子接入摇瓶液体培养 基中,使其生长繁殖成菌丝,再将摇瓶菌丝接 入种子罐扩大培养。
② 优点: 节省砂土管或冷冻管的用量,缩短菌 种在种子罐内的生长时间。
③ 缺点:菌丝不易保存,批次更换频繁,批与批 之间的种子质量有差异,容易造成生产上的波 动;由于菌丝制备工艺时间长,增加了杂菌污 染的机会。
发芽罐
繁殖罐
链霉素:三级种子扩大培养,四级发酵
种子罐级数确定的依据
种子扩大的级数受发酵规模、菌体生长特性、接种 量等因素的影响。 级数大,难控制、易染菌、易变异,管理困难, 得到的种子质量通常更高。
级数越小,越利于简化工艺及控制,并可减少 种子罐污染杂菌的机会,种子质量可能降低。
一般2-4级。
固化培养基:液体培养基中加入适量的琼脂等固化剂而制成的固态 培养基。
固体培养基产孢
• 谷类作物
大麦,玉米,大米,小米,麦麸等 比表面积大,孢子量多,湿度要求大
金霉素链霉菌种子制备
孢子种子的使用
对 菌 丝 形 态 的 影 响
克 拉 维 酸 种 子 制 备
最后一级种子罐接孢子
沙 加 霉 素 种 子 制 备
Typical Bioprocess
Stock culture Microorganism cell preparation Shake flask
Seed fermenter
Raw materials Medium preparation
Medium formulation
Sterilization
双种:两个种子罐接种到一个发酵罐中。
如卡那霉素发酵,双种比单种的产量提高8%。
倒种:一部分种子来源于种子罐,一部分来源于发酵罐。
如链霉素发酵,倒种法比单种法的产量提高12%。
5、种龄(Cell age)
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级 种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短:菌体太少;种龄长:易老化。 原则:对数生长期末,细胞活力强,菌体浓度相 对较大,但是最终由实验结果定。
放线菌孢子的制备
1.培养基与培养条件
(1)琼脂,和其他营养成分如麸皮、豌豆浸汁、蛋 白胨、牛肉膏和一些无机盐等,碳源和氮源不要 太丰富,碳氮比例大一些为好,干燥和限制营养 可直接或间接诱导孢子的形成。
(2)多为28℃,部分为30℃或37℃。一般在4~7d, 也有的为14d左右。
2.流程
砂土管 冷冻管
间管理,因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
四、种子扩大培养的方法
1.孢子进罐法:
以孢子形式的种子直接进罐的方法 – 先在固体培养基(固化培养基)上生长繁殖成
大量孢子,将孢子直接接入种子罐扩大培养。 – 优点:一次可以制备较大量的孢子,易于保存。
既可以节省大量的人力、物力和时间,又可减 少杂菌污染的机会。 – 缺点:砂土管或冷冻管的用量大。
第一节 概述
一、种子扩大培养的目的
1.为每次发酵罐的投料提供一定数量代谢旺 盛的种子,有利于发酵过程更早地开始。
2.缩短发酵时间,提高发酵罐利用率,同时 也减少染菌机会。
二、优质种子必须具备的条件
①菌种细胞的生长活力强,移种至发酵罐后能迅速 生长,迟缓期短;
②生理性状稳定,以得到稳定的菌体生长过程; ③具有适宜的菌体总量及浓度,满足大容量发酵的
要求; ④无杂菌污染; ⑤保持稳定的生产能力,使最终产物的生物合成量
持续、稳定、高产。
种子质量的检测标准
1.无菌试验及显微镜镜检观察有无杂菌污染。 2.生化测定。糖、氮、pH、菌体浓度等代谢指
标是否合格。 3.菌丝形态,菌丝浓度,培养液外观(色泽、
气味、浑浊度、 颗粒等)。 4.产物指标,酶活等。
4、起始接种物的传代问题
细菌和酵母 保藏斜面 → 活化斜面
产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的:使菌种的传代次数尽可能的少。
5. 孢子培养过程
母瓶:活化、纯化,使保藏菌种生长,并去除变异 株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
子瓶: 大量繁殖,得到大量孢子。 接种:①从母斜面上点接种,选取生长好的单菌落。
第二节 工业发酵种子的制备
一、实验室种子制备 二、生产车间种子制备
一、实验室种子制备阶段
1. 培养物选择的原则 目的:种子扩培到一定的量和质,根据菌种的特 点最终的培养物可分为两类:
1.不产孢子和芽孢的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
2.产孢子的 ——获得一定数量和质量的孢子 ——获得一定数量和质量的菌体
微生物每繁殖一代,其DNA就必须复制一次,微生物生长繁殖速度快, DNA复制次数多。DNA在复制过程中容易发生基因突变,导致菌种的优良 特性丧失。所以,必须控制菌种的传代次数,防止由于传代而引起的基 因突变,保证菌种的遗传稳定性。
2.提供种子培养的适宜环境条件,防止杂菌污染
菌种活化和扩大培养过程中都要严格无菌操作,培养基和培养设备要保 证无菌,防止杂菌污染。
三、种子扩大培养的工艺流程
沙土孢子或冷冻干燥孢子→斜面孢子→摇瓶液体培养(茄子瓶斜面培养或固体 培养基培养)→种子罐培养→发酵罐发酵
实验室阶段:不用种子罐,所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见
设备,在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成,因此形象地将这 些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段:种子培养在种子罐里面进行,一般在工程归为发酵车
6、种子的质量要求:
量:要求达到一定的浓度 质: 形态 (生长处于某个阶段、均匀等等)
理化指标:C、N、P的含量,pH,酶活等
无污染
酵母菌种子的制备
1. 啤酒 crop ,pitching
(1)传统敞口上面发酵:top fermentations ‘middle skimmings’ ,treatments (2)锥形罐发酵 酵母活力不高,罐底环境,低温,厌氧保存 Sterols 甾醇 与氧 ,麦汁通风,酵母通风 (3)Active dry yeast (ADY) ,
2. 孢子培养基
第二,所用无机盐的浓度要适量,如果过高会影响孢 子数量和颜色。 第三,pH和湿度要合适。
发酵生产上常用的孢子培养基: 麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和利 用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。 小米培养基和大米培养基常用作霉菌孢子培养基,因它们含氮 量少,疏松、表面积大,所以是较好的孢子培养基成分。
种子培养的最早阶段接种孢子
影响孢子种子质量的因素
1.原材料质量
麸皮,大(小)米;蛋白胨等,主要是无机离子含量不同。
2.培养温度
对多数微生物的斜面孢子质量有显著影响; 龟裂链霉菌斜面,最适温度为36.5℃~37℃;温度高于37℃,则孢子成
熟早、易老化。
3.湿度
斜面孢子培养基的湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。
1.松A,B,入蒸汽 20min,灭菌;
2.紧A,B,关E,G,开 D,F,C,无菌空气进大 罐,降温;
3.种子罐与A,B松连, 关D,H,I,C,开E,F,G, 20min;
4. 紧A,B,关E,G,开 D,保压,降温;
5.当大罐压力低于5psi, 关F,开H,I,C,压入种 子液
6.关D,H,I,C,AB加 塞,开E,G杀菌,清 管线。
细菌种子制备
丙酮丁醇梭菌种子制备
枯草芽孢杆菌杆菌产酶,芽孢的影响,对数期种子 食醋发酵,氧的要求,倒种 乳酸发酵,种子液中乳酸的影响,去除乳酸
棒酸clavulanic acid生产菌Streptomyces clauuligerus
(棒酸链霉菌)种子制备
菌 丝 体 种 子 制 备
固化培养基(琼脂培养基)产孢
母斜面
孢子悬浮液
种子罐
子斜面 孢子悬浮液
霉菌孢子的制备
1.培养基与培养条件
(1)多数采用大米、小米、玉米、麦麸等天然农产品,来 源丰富 ,适合霉菌的生长繁殖,表面积较大 。制备大 (小)米培养基,严格控制含水量,使其不粘不散。
(2)25℃~28℃,培养时间随菌种而不同,一般为4~
14d。为了使通气均匀,要注意翻动。
4.通风与搅拌
种子罐中的两个重要因素。
5.培养时间和冷藏时间
衰老的孢子不如年轻的孢子,因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段, 物质趋于分化状态。 土霉素菌种斜面培养4.5d,孢子尚未完全成熟,冷藏7~8d菌丝即开始 自溶;培养5d,孢子完全成熟,冷藏20d也不会自溶。
保证种子质量的控制措施
1.减少传代次数,防止菌种发生基因突变
在原料方面:不如实验室阶段那么精细,而是更 接近于发酵培养基,这有两个方面的原因:
一是成本 二是驯化
例:柠檬酸发酵 1.以蔗糖为原料
成分
斜面
麦芽汁 蔗糖
NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
麦汁ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ2%
种子罐 发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11%
②接种时密一点,得到大量的孢子。
孢子培养时注意湿度,子斜面使用一般不超过1个月
二、生产车间种子制备阶段
1、培养物的选择原则
最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利: (1)缩短发酵时间 (2)有利于获得好的发酵结果
2、培养基选择的原则
目的:获得一定数量和质量的菌体,因此培养基 的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体 的生长,所以营养要比发酵培养基丰富。
2. 孢子培养基
孢子培养基:供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基。孢子培养 基能使菌体快速生长,并产生较多优质的孢子。
对于大多数丝状真菌和放线菌而言,种子扩大培养的目的 主要是菌种的孢子繁殖。
对孢子培养基的基本要求: 第一,有机氮源等营养不能太丰富,否则不易产孢子。
如灰色链霉菌在葡萄糖-硝酸盐的培养基上都能很好地生长和产 孢子,但若加入0.5%的酵母膏或酪蛋白后,就只长菌丝而不长 孢子。
4、接种量(Inoculation quantity)的确定
移入种子的体积 接种量= —————————
接种后培养液的体积
过大过小都不好,最终以实践定,如大多数抗生素为7-15%、谷 氨酸为1%左右。但是一般认为大一点好(较大接种量可以缩短发 酵罐中菌体繁殖达到高峰的时间,使产物形成提前;且减少染菌 机会)。
Production fermenter
Computer control
Air Recovery
Purification Effluent treatment
Products
第五章 种子制备
概念
种子制备就是将保存在沙土管、冷冻干燥管中 处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后, 再经过摇瓶或扁瓶及种子罐逐级扩大培养而获 得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培 养物称为种子。
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