大肠杆菌基因工程讲解
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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简述大肠杆菌转化法的原理
简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。
其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。
质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。
2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。
这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。
3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。
这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。
4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。
5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。
这些菌落会在培养基中形成可见的生长。
通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。
这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1，基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。
扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。
这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。
基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
大肠杆菌的基因型-概述说明以及解释
大肠杆菌的基因型-概述说明以及解释1.引言1.1 概述大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，属于肠道菌群中的重要成员。
它在自然界和人体内广泛存在，并且具有广泛的基因型多样性。
这使得大肠杆菌成为了微生物遗传学和进化生物学领域的研究模型。
在大肠杆菌中，基因型是指该菌株拥有的基因组合和基因的分布情况。
大肠杆菌的基因型可以通过不同的方法进行分类和鉴定。
目前主要的分类方法包括单核苷酸多态性分析、基因片段分析和全基因组测序等。
通过这些方法，我们可以更全面地了解大肠杆菌的基因型组成和种群结构。
大肠杆菌的基因型在其功能和特点方面具有重要意义。
大肠杆菌是一种典型的益生菌，它在人体内具有多种有益作用，包括帮助消化吸收、维持肠道稳定性和参与免疫调节等。
不同基因型的大肠杆菌可能具有不同的功能特点，比如某些基因型可能携带耐药基因或致病因子，导致感染和疾病的发生。
因此，对大肠杆菌基因型的研究有助于我们深入了解其功能机制和生态适应能力。
总之，大肠杆菌作为一种常见的菌株，其基因型具有多样性和重要性。
通过研究大肠杆菌的基因型，我们可以深入探索其功能特点和生态适应能力，进一步促进微生物遗传学和进化生物学的研究。
未来，我们可以通过结合多样的研究方法和技术，进一步挖掘和解析大肠杆菌基因型的奥秘，并探索其在人体健康和疾病中的作用。
文章结构是指文章部分之间的逻辑关系和组织，它有助于读者理解文章的内容和思路。
本文的结构如下：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 大肠杆菌的基因型分类2.2 大肠杆菌基因型的功能和特点3. 结论3.1 大肠杆菌基因型的重要性3.2 未来研究的方向文章结构部分是为了描述本文的组织结构，它有助于读者了解文章的内容安排和逻辑关系。
在本文中，我们首先介绍引言部分，包括概述、文章结构和目的。
在概述中，我们简要介绍了大肠杆菌的基因型。
在文章结构中，我们明确了本文的结构和章节安排，帮助读者理解文章的整体框架。
大肠杆菌转化原理
大肠杆菌转化原理大肠杆菌作为一种常见的细菌，具有广泛的应用价值。
其中，大肠杆菌转化作为一种基因工程技术，是进行基因操作的重要手段之一。
大肠杆菌转化的原理是什么呢？下面就为您详细介绍。
大肠杆菌转化的基本原理是把外源 DNA 引导到受体菌细胞内，并使其稳定地整合到受体菌细胞的染色体中，并且确保该 DNA 在细胞再生过程中倍增遗传。
大肠杆菌转化实验中的基本步骤包括：菌种的培养、DNA 的提取、外源 DNA 与受体菌细胞的共培养、生长选配与富集。
首先，受体菌细胞必须处于生长期，才能够有效地接收外源 DNA。
其次，外源 DNA 可以通过不同的途径转化到受体菌细胞中，例如自然转化、人为电转化、吉尔伯特法、钙磷共沉淀法等。
其中，自然转化是通过外源 DNA 和细胞的相互作用，使得外源 DNA 进入细胞的过程。
电转化是利用电场的力量让细胞壁上的孔隙扩大，从而使得外源 DNA 可以通过孔隙进入受体菌细胞的过程。
吉尔伯特法是利用微量离子钙离子，与 DNA 形成非常稳定的钙离子-DNA 混合物，然后再使得该物质进入受体菌细胞内的过程。
钙磷共沉淀法是先将 DNA 和钙离子混合，然后加入磷酸钠，形成含钙磷沉淀物，最后通过共培养与受体菌细胞结合的技术完成转化。
在转化的过程中，外源 DNA 长度、浓度以及其与受体菌细胞之间的亲和力会直接影响转化的效率。
而大肠杆菌细胞还会出现自发性和诱导性的 DNA 修复和再组合，从而使得外源 DNA 与受体菌细胞在染色体水平上发生重组，对于一些基因的克隆、表达和遗传分析具有重要的意义。
总之，大肠杆菌转化是一种创新的基因操作技术，是现代分子生物学研究的重要手段之一。
通过对大肠杆菌转化原理的深入理解，可以更好地实现基因的修饰、改造和重组，进一步推动生命科学领域的发展和进步。
8基因表达,大肠杆菌基因工程
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’
，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小 亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子：以AUG；GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列。
C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱
去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，工 艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
人胰岛素的生产方法
利用基因工程菌发酵生产人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素， 成为世界上第一个上市的基因工程药物；1987年，Novo公司又推出
A链和B链分别表达法
基因工程菌的构建战略： 化学合成A链 和B链的编码
Apr
tac
Met b-Gal Met A peptide Apr
tac
Met b-Gal Met B peptide
序列
ori
ori
M
M
M
M
N
C
N
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
表达产物的后处理路线：
b-Gal
外源基因在原核细胞中的表达
现将真核基因在原核细胞中表达： 1、外源基因克隆在表达载体并导人宿主菌。
2、外源基因不能有间隔序列(内含子)，因而必须用cDNA或全
大肠杆菌的分子生物学研究
大肠杆菌的分子生物学研究大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，也是一种广泛应用的模式生物。
在分子生物学研究中，大肠杆菌常常被用作基因工程、蛋白质表达、靶标鉴定等方面的实验材料。
本文将从大肠杆菌分子生物学的视角出发，讲解大肠杆菌相关研究的现状和未来发展方向。
一、大肠杆菌基因组分析对大肠杆菌基因组的分析是分子生物学研究的重要方向之一。
大肠杆菌的基因组长度约为5.5Mb，含有4140个基因。
这些基因可以分为两类：编码蛋白质的基因和编码RNA的基因。
编码蛋白质的基因中，有大约20%的基因是没有已知的功能的，这也是当前研究的重点之一。
大肠杆菌基因组的分析可以通过多种方法实现，包括测序、比较基因组学和功能基因组学研究等。
测序技术是目前最常用的方法，可以得到大肠杆菌基因组的序列信息。
比较基因组学研究则是通过比对大肠杆菌与其他物种的基因组序列，找出它们之间的相同点和不同点，从而了解它们的进化关系。
与之相对应的是功能基因组学研究，它主要关注在基因组层面揭示组织和细胞的功能，包括基因表达分析、蛋白质互作网络研究、代谢通路分析等等。
二、大肠杆菌基因工程研究大肠杆菌基因工程研究是分子生物学研究的另一大方向。
大肠杆菌可以通过基因工程方式来改变其基因结构，从而实现一系列人工合成目的。
例如，利用大肠杆菌来表达蛋白质，就是目前最常用的方法。
首先在大肠杆菌中克隆目标基因，然后将其引入大肠杆菌，最终通过大肠杆菌自身的蛋白质合成机制来合成目标蛋白质。
在基因工程研究方面，重要的工具是质粒。
质粒是一种小而独立的DNA分子，自己携带一些基因，以此与大肠杆菌分子结合，将需要改变的DNA分子或遗传信息被“载入”到大肠杆菌中。
质粒大小一般为1-200kb，基因工程中，通常先将目标基因插入质粒中，再将质粒通过易于使用的接种操作引入大肠杆菌菌体中。
这种基因工程技术可被应用于许多生物医学领域或工业制造方案。
三、大肠杆菌蛋白质结构研究大肠杆菌蛋白质结构研究也是目前分子生物学研究的热点之一。
第十四章：大肠杆菌基因工程资料
突变碱基对，其活性比野生型Plac启动子更强，而 且对葡萄糖及分解代谢产物的阻遏作用不敏感，但 仍为受体细胞中的Lac阻遏蛋白阻遏，因此可以用
乳糖或IPTG进行有效诱导。人工构建的Ptac启动子
由于含有lac操作子区域，所以其阻遏诱导性质与
PlacUV5相同。
cI857 控制 PλL ， cI857 阻遏蛋白在 42℃时失
活脱落， PL 便可介导目的基因的表达，但
在大型细菌培养罐中迅速升温很难，故常
使用双质粒的控制系统，用色氨酸间接控
制目的基因表达。
当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp启动子打开，CI 阻遏蛋白合成，由Pl启动子介导的外源基因转录 关闭；相反，当色氨酸大量存在时，Ptrp启动子 关闭，CI阻遏蛋白不再合成，Pl启动子开放并激 活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然 处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温 度进行诱导表达。
第十四章
大肠杆菌基因工程
第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征
一．大肠杆菌表达外源基因的优势 1.全基因组测序，遗传背景清楚 ， 共有4405个开放阅读框架。 2.基因克隆表达系统成熟完善。
3.繁殖迅速，培养简单，操作方便， 遗传稳定。 4.被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物。
5.成本低
二．大肠杆菌表达外源基因的劣势 1.缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。 2.内源性蛋白酶易降解空间构象不正 确的异源蛋白。 3.不具备真核生物的蛋白质复性系统。 4.其细胞膜间隙含有大量的内毒素，
构。将这个区域的DNA片段次级克隆在启动子探针
质粒上，测定其所含有启动子的转录活性。
③滤膜结合法分离
原理是双链 DNA 不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而 DNA-
大肠杆菌基因工程 (2)
大肠杆菌基因工程引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，它可以在动植物肠道中找到。
由于其生长快速、易于培养和转化，大肠杆菌成为了基因工程研究中最重要的模式生物之一。
大肠杆菌基因工程是通过改变大肠杆菌的遗传特征，实现对其功能的改造和优化，从而达到生产特定产物或解决特定问题的目的。
大肠杆菌基因工程的原理基因传递与插入大肠杆菌基因工程的核心在于将目标基因导入到大肠杆菌中。
目前常用的方法有以下几种：1.转化(transformation)：通过将外源DNA直接导入大肠杆菌细胞内，使其在细胞内复制和表达。
2.电转化(electroporation)：利用强电场将质粒DNA引入细胞内，使其与大肠杆菌细胞内的DNA重组。
3.病毒介导的转染(viral-mediated transduction)：使用病毒载体将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
4.转座子介导的DNA转移(transposon-mediated DNAtransfer)：利用转座子将目标基因插入到大肠杆菌染色体的特定位点上。
基因表达与调控在大肠杆菌基因工程中，外源基因导入之后需要进行表达和调控，以产生所需的受体蛋白或产物。
常用的表达系统包括启动子-启动子区域-编码序列-终止子的结构。
其中，启动子可以选择适当的促进剂或抑制剂进行调节，以控制基因的表达水平和时机。
应用案例生物医药领域在生物医药领域，大肠杆菌基因工程被广泛应用于生产重组蛋白药物。
通过引入外源基因，大肠杆菌可以高效地合成重组蛋白，并通过分离和纯化得到高纯度的药物。
例如，利用大肠杆菌表达系统，可以生产出重组人胰岛素、生长激素等重要药物。
环境治理领域大肠杆菌基因工程还可以应用于环境治理领域。
例如，通过改造大肠杆菌的基因组，使其具有降解有机污染物的能力，可以用于处理工业废水和土壤污染。
此外，大肠杆菌的工程还可以用于制造生物能源，例如利用大肠杆菌产生生物柴油或生物氢。
基因工程3大肠杆菌表达系统
01
02
最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高; 表达产物稳定; 生物活性高; 表达产物容易分离纯化。
第一节基因的表达系统与表达策略
容易获得较高浓度的细胞；
01
能利用易得廉价原料；
02
不致病、不产生内毒素；
03
发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；
04
容易进行代谢调控；
05
容易进行DNA重组技术操作；
06
产物的产量、产率高，
07
产物容易提取纯化。
08
适合目的基因表达的宿主细胞的要求:
宿主细胞的选择
01
原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等；
02
真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
宿主细胞分为两大类：
真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
让外源蛋白质定位在周质或胞外表达； 使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株； 将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长； 使目标基因以融合蛋白形式表达； 置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点； 对目标蛋白质作疏水性修饰。 为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：
常用的大肠杆菌表达载体
01
最常用的：噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。
03
迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。
大肠杆菌在生物工程中的应用研究
大肠杆菌在生物工程中的应用研究大肠杆菌是一种常见的细菌，属于革兰氏阴性菌，可以在大肠内生长繁殖。
它是一种典型的模式微生物，也是生物工程中的重要研究对象。
在生物工程中，大肠杆菌不仅可以用作基因工程载体，还可作为研究重要蛋白质的工具。
今天，我们就来探讨大肠杆菌在生物工程中的应用研究。
大肠杆菌在基因工程中的应用研究在生物工程研究中，大肠杆菌作为载体在基因克隆、表达和突变等方面被广泛应用。
其中，基因克隆是指将感兴趣的基因从其它生物中分离出来并插入大肠杆菌染色体中，使它们具有在大肠杆菌中表达的能力。
基因表达指利用大肠杆菌表达人类或其它生物的重要蛋白质，例如生长因子、免疫球蛋白等等。
基因突变指在大肠杆杆菌中引入人为突变，以研究这些基因对细胞机制、代谢调节等方面的影响。
基因克隆是利用大肠杆菌的DNA重组技术实现的。
当染色体DNA遭受化学或物理作用而断裂时，通常会出现两种不同的DNA断裂形式：端断和内切。
大肠杆菌中，当外源DNA准备进入宿主细胞时，这些DNA可以直接与大肠杆菌染色体DNA发生重组，从而允许特定基因的插入和删除。
这充分说明了大肠杆菌在基因工程中的应用优势。
大肠杆菌在重要蛋白质的表达中的应用研究大肠杆菌一直被用作研究生物技术和药物开发的重要工具。
它具有高效表达目的基因和纯化重要蛋白质的功能，特别是在产生重要的生物医药品方面，大肠杆菌有着较为显著的优势。
例如，大肠杆菌用于表达疫苗和生物制品、裂解蛋白和其他生物大分子材料，这些产品通过利用大肠杆菌的表达系统生产。
这个系统专门用于生产疫苗和生物制品，并为生物药物产业提供可靠和高效的货源。
另外，大肠杆菌的生物合成能力在蛋白生产和制定新型蛋白的过程中得到了广泛应用。
一些蛋白本身的结构和物理化学特性就能够在大肠杆菌进行生产。
目前，大肠杆菌在表达酶类和仅含小分子的特殊蛋白方面已经有了较好的基础。
通过使用基因工程方法构建不同的蛋白表达平台，在基因表达、突变物的制成和纯化方面，具有很大的应用潜力。
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌是微生物中最为普遍的种类之一，其在生物工程研究中也扮演着重要角色。
大肠杆菌不仅因关系到人类营养和生态环境而广泛应用，而且由于其生长繁殖迅速，具有
良好的遗传性状以及可调控性强等特点，在基因工程中的应用也得到了越来越多的关注。
首先，大肠杆菌可以用于制备新型微生物色素。
由于大肠杆菌的膜蛋白性状和抗病毒
的质量，它们能够用于制造出自然结构完整的大肠杆菌色素。
这些色素能够用于抗肿瘤药
物的开发。
大肠杆菌色素可以被用来改变多种抗病毒活力，使它们更有效地抑制肿瘤细胞
的生长。
此外，大肠杆菌还可以用作基因表达系统。
它可以被用来做基因组挖掘和表达分析，这些工作为药物研发提供有价值的信息，例如新型药物的发现和开发，重组蛋白的制造和
功能的研究。
此外，大肠杆菌也可以被用作能够识别细菌毒素的选择性培养介质，从而检
测特定的病原体。
最后，大肠杆菌可以作为能够大量合成药物以及相关产品的“小工厂”，如重组植物
激素、抗生素和其他生物活性物质。
大肠杆菌是一种极具潜力的生物反应器，可以稳定生
产大量重要化学物质，并长期保持较高的性能质量。
此外，它还可以用作研究新颖的化学
过程的实验室，不仅可以证明一种化学反应是可行的，还可以利用实现它们的生物工程技
术来建立化学工厂，产生更大规模的产品。
综上，大肠杆菌具有良好的基因组可调控性，能够快速繁殖，形成色素，稳定表达，
能产生多种活性物质，检测病原体以及应用于研究新型化学过程等特性，这些特性都使得
大肠杆菌在基因工程中有着巨大的应用价值,使之成为一种普遍意义上重要的微生物细胞。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体
技术创新
随着技术的不断进步，基因工程32大肠杆菌克隆载体的效率和安全性将得到提高。法规完善
随着基因工程-32大肠杆菌克隆载 体的应用范围扩大，相关法规和 监管体系也将逐步完善，为技术 的健康发展提供保障。
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利用基因工程手段改造微生物，提高微生物对污染物的降解能力，实现对环境污染的生 物修复。
生物监测
通过基因工程技术构建具有特定功能的微生物，实现对环境污染物的实时监测和预警。
05
基因工程-32大肠杆菌克 隆载体的挑战与前景
安全性问题
潜在的健康风险
基因工程-32大肠杆菌克隆载体可能含有对人体有害的基因或基因 片段，导致基因突变或产生新的疾病。
环境影响
基因工程-32大肠杆菌克隆载体可能对环境造成破坏，如基因污染、 生态失衡等。
长期影响未知
由于基因工程-32大肠杆菌克隆载体的应用时间较短，其长期对人 体和环境的影响尚未完全明确。
伦理问题
01
02
03
人类基因干预
基因工程-32大肠杆菌克 隆载体涉及到对人类基因 的干预，可能引发伦理争 议。
基因歧视
1990年代
人类基因组计划启动，推动了基因组学和功能基因组学的研究。
21世纪
基因编辑技术的发展，如CRISPR-Cas9系统，使得对DNA的精确编辑成为可能。
基因工程的应用
医药领域
用于药物研发、疾病诊断和治疗，如胰岛素、 生长激素和肿瘤免疫治疗等。
工业领域
用于生物燃料、生物塑料和生物酶的生产， 以及环境污染的生物治理等。
基因工程-32大肠杆菌克 隆载体的应用可能导致基 因歧视现象的出现，对某 些人群造成不公平待遇。
基因工程：第三章 大肠杆菌基因工程
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
高效转录 O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控
lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物
存在时，整个操纵子处于基
底水平表达；诱导物可以使
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
高水平转录 阻遏蛋白
l噬菌体启动子PL / PR
受CI阻遏蛋白阻遏
阻遏作用
常采用温度敏感型突变cI857
cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，
Ptrp
PL便可介导目的基因的表达。但
在大型细菌培养罐中迅速升温非
常困难，因此常使用一个双质粒
控制系统，用色氨酸间接控制目
的基因表达。 Ptrp
cI857 PL
A
色氨酸 PL
A
目的基因 B
表达水平高，遗传较稳定 优良的工业性能： 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统
一、大肠杆菌表达系统的优缺点 你有不足，但你仍是最爱——缺点
缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖 基化蛋白、结构复杂的蛋白等） 胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵 体），分泌机制不完善 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
组成型与诱导型启动子
大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达
包涵体的变性与复性操作
包涵体的溶解与变性：
包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键 在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进
包涵体溶解变性的试剂和条件包括：
清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化
促溶剂
盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应
融合型异源蛋白的表达
融合型目的蛋白表达系统的构建
用于融合蛋白构建的受体蛋白：
谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 麦芽糖结合蛋白（MBP） 促进分泌 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 pTrxFus 外膜蛋白（OmpF） 促进分泌 b-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象
分泌表达形式的优点： 目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳 稳定性大约是在细胞质中的10倍 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有 甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质 N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠 杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去
混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强
极端pH 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应
包涵体型异源蛋白的表达
包涵体的变性与复性操作
包涵体的复性与重折叠（refolding）： 包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 通过次级键的形成使蛋白质复性
基因工程大肠杆菌发酵的研究
讨论
• 含PL启动子的 启动子的E.coli工程菌的表达及温度敏感株 启动子的 工程菌的表达及温度敏感株 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（ ℃ 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（30℃） 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度， 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度，然后迅 速提高温度诱导目的产物的表达。 速提高温度诱导目的产物的表达。 • 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素：一是 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素： 在30℃发酵过程中尽可能提高菌体密度；二是快 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度； 速升温诱导。 速升温诱导。
• 科学家们把人的胰岛素基 因送到大肠杆菌的细胞里， 因送到大肠杆菌的细胞里， 让胰岛素基因和大肠杆菌 的遗传物质相结合。 的遗传物质相结合。人的 胰岛素基因在大肠杆菌的 细胞里指挥着大肠杆菌生 产出了人的胰岛素。 产出了人的胰岛素。并随 着它的繁殖， 着它的繁殖，胰岛素基因 也一代代的传了下去， 也一代代的传了下去，后 代的大肠杆菌也能生产胰 岛素了。 岛素了。这种带上了人工 给予的新的遗传性状的细 被称为基因工程菌。 菌，被称为基因工程菌。
• 二、生物工程下游技术的必要性 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 酶制剂及某些检测试剂，如人（ 酶制剂及某些检测试剂，如人（牛、猪） 生长激素、 （ ， ）干扰素、链激酶、 生长激素、α-（β-，γ-）干扰素、链激酶、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 降钙素、仔猪腹泻疫苗、 型肝炎检测试 降钙素、仔猪腹泻疫苗、C-型肝炎检测试 剂等都是应用基因工程大肠苗菌进行生产 的。
基因工程产业化除上游构建工程菌之外， 基因工程产业化除上游构建工程菌之外，下 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破 目的产物的分离、纯化、 碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的天 然结构使之具有生物活性， 然结构使之具有生物活性，有的表达产物还需进 一步加工修饰， 一步加工修饰，如人胰岛素原的化学切断与酶切 降钙素C-末端的酰胺化修饰 末端的酰胺化修饰， 断，降钙素 末端的酰胺化修饰，以及质量控制 等，没有这些下游技术的建立就没有基因工程产 品。
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌在基因工程中的应用大肠杆菌是一种常见的细菌，因为其易于培养和遗传学特性而成为了基因工程的重要模型生物之一。
基因工程是人类利用分子遗传学、细胞生物学等技术手段对生物体进行基因改造的过程，使其实现某些人类所需的生物学功能。
本文将深入介绍大肠杆菌在基因工程中的应用。
一、大肠杆菌在DNA重组中的应用DNA重组是指将不同来源的DNA进行拼接、克隆或删除等操作来改变基因的结构和功能。
大肠杆菌是一种真正的工程菌，在DNA重组中有着重要的作用。
因为大肠杆菌的染色体只有一根，而且细胞的分裂时期只有30分钟左右，这就为大肠杆菌的DNA重组提供了非常便利的条件。
利用基因工程技术，可以将人类需要的目的基因克隆到大肠杆菌中，并利用大肠杆菌代谢途径的生物反应来合成所需要的特定蛋白。
此外，大肠杆菌也可以通过作为载体来传播适当的DNA。
大肠杆菌的细胞质中有着非常多的质粒，这些质粒可以独立于染色体进行复制和表达。
这意味着我们可以把重要的基因克隆到质粒上，利用大肠杆菌作为载体携带质粒将其引入真核细胞中。
这样，大肠杆菌及其质粒成为了一种高效的基因转移方法，为生命科学和生物技术中的基因治疗、基因诊断和疫苗等的研究带来了无限的可能性。
二、大肠杆菌在蛋白质表达中的应用大肠杆菌非常适合用于蛋白质表达，因为大肠杆菌具有快速繁殖、生长周期短和容易生长等优点。
在常规的重组蛋白制备过程中，研究人员常常使用大肠杆菌作为表达主机，将重组蛋白基因导入到大肠杆菌中，然后通过不同的表达条件来诱导基因表达，最终得到高含量且纯度较高的重组蛋白。
这项基因工程技术具有质量稳定、生产过程简单和成本低等优点，因此在医药生物领域的蛋白质药物和医用耗材领域受到广泛应用。
三、大肠杆菌在基因敲除中的应用基因敲除是一种通过人工手段消除某些基因表达功能的方法。
大肠杆菌是一种常见的基因敲除菌种。
利用基因敲除技术，研究人员可以选择性地删除大肠杆菌的某些基因，以了解这些基因在生物体代谢和生理过程中的功能，同时也能够根据需要对基因进行改造，以达到预期的效果。
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第一节 大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系 克隆基因正确表达的基本条件
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
基因工程的重要目标之一是，制备按其它方法难以生产 的大量纯化的蛋白质产物，为此就需要有一种能够高水平表 达异源蛋白质或重组蛋白质的表达系统。而良好的表达系统 的选择要考虑多方面的因素，如寄主细胞的生长特性、蛋白 质产物转译后的修饰与生物活性，以及异源蛋白质的表达水 平和分泌方式等。目前被选作表达异源蛋白质的表达系统有 细菌（包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、酵母、昆虫、植物 和哺乳动物细胞等。
➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生 产。
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌中表达体系表达真核基因的不足：
➢ 真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别，在 大肠杆菌细胞中不可能具有为真核RNA加工剪辑所需要的 酶体系，真核基因很难直接在大肠杆菌细胞中实现功能性 表达；
➢ 通过引进突变的的方法消除细菌中存在的能降解外源真核 蛋白质的蛋白酶分子。
2020/8/16
中英联合实验室
克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件：能进行正常的转录和翻译，在正常情况下还与 翻译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。 重要条件 ➢ 编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性； ➢ 具有核糖体结合位点； ➢ 具有克隆基因的功能（强）启动子； ➢ 插入序列的正确取向
制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS）； ➢ 标记：有适合的标记，易于选择； ➢ 安全性：要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内 特殊菌种内才可复制等； ➢ 表达：有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达 ，并且尽可能是高效的表达。
2020/8/16
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性：
➢ 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理 有深刻的了解；
➢ 一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株 和不同类型的载体；
➢ 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、 高水平的表达；
翻译终止子
mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌偏爱终止子 UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下 ，转译终止的效率将进一步的增强。
➢ 真核基因的转录信号同原核不同。细菌的RNA聚合酶不能 识别真核启动子；外源基因可能含有具有大肠杆菌转录终 止信号功能的核苷酸序列。
➢ 真核基因mRNA的分子结构同细菌有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性和同细菌核糖体相结合的能力，从而阻碍 正常的转录和翻译；
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
2020/8/16
中英联合实验室
第二节 大肠杆菌的表达载体
2020/8/16
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第二节 大肠杆菌的表达载体
大肠杆菌载体系统 大肠杆菌表达载体的基本成分 常用的大肠杆菌表达载体
2020/8/16
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大肠杆菌载体系统
➢ 容量：分子较小，可携带比较大的DNA片段； ➢ 复制：能独立于染色体而进行自主高效的复制； ➢ 酶切位点：有尽可能多的多种限制酶切位点，但每一种限
中英联合实验室
大肠杆菌克隆载体
Vector plasmid λ phage cosmid P1 phage PACs BACs
2020/8/16
Host
E. coli
E. coli E. coli E. coli E. coli E coli
Insert size (kb) <8 9~24
35~45 70~100 100~300 ≤300
2020/8/16
中英联合实验室
翻译起始序列
5’-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。
在核糖体结合位点（RBS）的序列结构中，增加腺嘌呤 和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发碱基发生定点突 变；或使用转译偶联系统进行克隆基因表达
2020/8/16
中英联合实验室
翻译增强子
显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率
大肠杆菌Lac操纵子的lac启动子，Trp操纵子的trp启动子及
tac启动子，λ噬菌体的PL和PR启动子以及pBR322载体的β内酰胺酶启动子
➢ 从真核细胞中分离完成加工的mRNA，使用反转录酶合成 出cDNA，并连接到适当的载体上，可以克服真核基因的 间隔子问题；
➢ 根据蛋白质的氨基酸序列，应用化学方法合成出不带间隔 序列的寡聚脱氧核糖核酸的短片段；
➢ 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰 （正确折叠和组装），而大多数的修饰作用在细菌细胞中 并不存在；
➢ 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质 分子，将其降解。
2020/ห้องสมุดไป่ตู้/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
为了克服上述这些问题，已经发展出了许多种不同的方法：
➢ 将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游附近部位，如
中英HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室
基因工程原理
何光源
2016-04-05
第九章 大肠杆菌基因工程
第一节 大肠杆菌表达体系 第二节 大肠杆菌的表达载体 第三节 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达
2020/8/16
中英联合实验室
第一节 大肠杆菌表达体系
2020/8/16
中英联合实验室
中英联合实验室
大肠杆菌表达载体
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达载体的基本成分
组成部分 ➢ 启动子 ➢ 转录终止子 ➢ 翻译起始序列 ➢ 翻译增强子 ➢ 翻译终止子
2020/8/16
中英联合实验室
启动子
最佳启动子具备的条件：
➢ 必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表 达量占细胞总蛋白的10%~30%以上；
➢ 应能呈现出一种低限的基础转录水平，具有高度抑制性（ 抑制型启动子）；
➢ 应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物得以 诱导（诱导型启动子）。
2020/8/16
中英联合实验室
转录终止子
转录终止子能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质 产物的水平。
启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用， 当其通过下游启动子时，会使该启动子的功能受到抑制，这 种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象