英骏载体引物对照表
载体通用引物序列
5'-GGC AAC TAG AAG GCA CAG TC-3'
PCDNA3.1F
5'-CTA GAG AAC CCA CTG CTT AC-3’
PCDNA3.1R
5'-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3’
pCEP Frorward
5'-AGC AGA GCT CGT TTA GTG AAC CG-3'
P31430
5'-CGT TTT AAAACCTAAGAGTCAC-3'
P12584
5'-TTT TCA GTA TCT ACG AT-3’
P17110
5'-TAC CAC TAC AAT GGA TG-3’
PAS2-1F
5'-TCA TCG GAA GCG AGT AG-3'
PAS2-1R
5'-CGT TTT AAA ACC TAA GAG TCA C-3'
PQE30R
5'-GTT CTG AGG TCA TTA CTG G-3'
pTARGET-SEQ
5'-TTA CGC CAA GTT ATT TAG GTG ACA-3’
PTRC99C-F
5'-TTG CGC CGA CAT CAT AAC-3’
PTRC99C-R
5'-CTG CGT TCT GAT TTA ATC TG-3’
PEGFP-C-3’
5'-TAT GGC TGA TTA TGA TCA GT-3'
PEGFP-C-5’
5'-CAT GGT CCT GCT GGA GTT CGT G-3'
引物合成订购表模板-zhaxi
提拱量 (O.D)
分装要求 纯化方式
3'末端修饰
5'末端修饰
其他修饰
备注
目的基因
申请人
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共7页，第5页
共7页，第6页
共7页，第7页
ID*
Primer名称
序列(5'to3')
IL33F1 IL-33R1 IL-33F2 IL33R2
Hale Waihona Puke CGCTCGGTCCCGCCTTGCAA TTCCCCTGCGGTGCTGCTGA GAGTTCCATCAAAGACACAGACAT ATGTTCACCATCAGCTTCTTCCCA
共7页，第1页
共7页，第2页
英骏生物技术有限公司引物合成订购表
订购日期: 客户姓名: 客户单位： 发票抬头： 客户地址： 客户电话： 客户Emial： *包装要求： *订单类别 *客户ID： *订单号：
査希 苏州大学生物医学研究院熊思东实验室 苏州大学 苏州市工业园区仁爱路199号，苏州大学独墅湖校区703号楼3305室 18862131525 charcy.529@
共7页，第3页
上海英骏生物技术有限公司 上海合成部：synsh@ 北京合成部：synbj@ 客户服务部服务电话：8008208181 订单要求： 1.此表格仅针对E-mail订单使用，传真订单请勿使用。 2.因此订单是电脑自动处理，订单发送前请仔 细核对信息, 订单接收4小时后将不能再更改 。
客户送样登记表上海英骏生物技术有限公司-ThermoFisherScientific
*为必填测序服务客户送样登记表(生产填写)订单号
测序引物备注：1.如用他人引物，请注明他人姓名及引物名称；2.如片断长度大于800，仅填写“通用引物”但没有选择测通，默认两个反应3．自备引物如为插入片断中序列，请备注说明。
需合成测序引物信息（g小写，C/T/A字母大写；长度在17-25之间）：
引物名称引物序列
引物名称引物序列
引物名称引物序列
引物名称引物序列
客户签字确认/日期：取样员签字/日期：
测序样品送样要求
友情提醒：1. 所有样品和引物均保存1个月，超过期限恕不提供加测以及返还服务。
2. 投诉期为一个月，如果对测序结果有任何异议，请及时联系；超过期限恕不接受。
3. 一般情况下：菌液和PCR未纯化48小时内完成测序，质粒和PCR已纯化24小时内完成测序。
载体与引物表1
Psiren-shuttle pSUPER pTRE2 PtriEX-1 pTrcHisA pTRC99a-c pTARGET TM Ptriplex2
Psiren-shuttle.F T7 pTRE2-F T7 F pTRC99C-F pTarget.F(在T7前面）/T7 T7 T3 pTRE2.R Ptriex-1.R R pTRC99C-R pTarget.R P11751
T3 T3 M13R PYES2.R SP6 p3XFlag-R(没有） AD) BD) BD) pACT2.R P31430 pAS2-1.R pB42ADR BAC2
pBR322.R在客户没有确认情况下不能用 pBR328.R在客户没有确认情况下不能用
TRXF 35S-P. 3' P17110 P10 pAD-GAL4-2.1.R P20
pBV220 PCANTB5E pcDNA3.0 pcDNA3.1 pcDNA4 pShuttle-CMV
pShuttle (stratagene公司)
PBV220F S1/M13R CMV-F/T7 pcDNA3.1-F/pcDNA3.1F/T7 T7/CMV-F(在T7前面） CMV-F pShuttle-F pCEP-F pCMV-F T7 T3 /PFLAG-CMV-F pCMV-F Pcmv5f Pcmv5f P1 M13R(-48) pEGFP-N1-5' pEGFP-N-5’ pEGFP-N-5’ pEGFP-N-5’ pEGFP-C-5’
PBV220R S6 BGH/SP6 pcDNA3.1R BGH pShuttleCMV.R 无反向引物 EBV-R pCMV-R SP6/M13R T7 pCMV-R Pcmv5r Pcmv5r P2 M13F(-47) pDSRED-N1-R pEGFP-N-3’ pEGFP-N-3’ pEGFP-N-3’ pEGFP-C-3'
载体及其上下游引物
载体名称上游引物（5'primer）下游引物（3'primer）P3*FLAG-CMV CMV-30(825-854)CMV-24(1129-1152)pAc5.1/V5-His(_A,_B,_C) pAc5-5 BGH revpAcG2T pGEX-5 not availablepACT T7EEV T3/EBVrevpACT2GAL4 ADfor pGAL4-ADrvpACT2p17110p12584pACYC184(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBampACYCDuet-1(MCSI)ACYCDuetUP1 Primer DuetDOWN1 pACYCDuet-1(MCSII) DuetUp2 T7-TerminatorpAdEasy-1 not available not availablepAdTrack-CMV not available not availablepAS2-1GAL4 Bdfor/P24990pGAL4-BDrv/P31430pB42AD pB42ADF PB42ADRpBABE pBMN_5' pBacPAK8BAC1BAC2pBAD pBAD-F pBAD-RpBAD/HisABC pBAD-5' pBBR1MCS T3/M13rev T7/M13forpBD-GAL4pBD-GAL4-F PBD-GAL4-RpBI12135S NOSpBIND GAL4-Bdfor T3,EBVrevpBK-CMV M13F/T7M13R/T3 pBluescriptIIKS(+/-) T3/M13rev T7/M13for（优先用M13F）pBluescriptIISK(+/-) T3/M13rev T7/M13for pBluescriptKS(+/-) T3/M13rev T7/M13for pBluescriptSK(+/-) T3/M13rev T7/M13forpBR322(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBampBR322(EcoRI/HindIII-sites) pBRforEco pBRrevHindpBR325(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBampBR329(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBampBridge(MCSI) GAL4-Bdfor3'BDpBridge(MCSII) not available not availablepBS-T II T3/M13rev T7/M13forpBS（AMP）T7T3pBSR T3T7terpBudCE4.1(MCSI) CMV-Profor,T7 c-mycrev,EBVrevpBudCE4.1(MCSII)EF-1α Fwd BGHpBudCE4.1/lacZ/CAT CMV-Profor,T7 c-mycrev,EBVrevpBV220pBV220F PBV220RpCAL-c T7/Tac-Profor T7-TerminatorpCAL-n T7/Tac-Profor T7-Terminator pCAMBIA1301(1300)pCAMBIA1301-5'(ECORI)/M13R pCAMBIA1301-3'(HindIII) pCAMBIA1304pCAMBIA1301-5'(ECORI)pCAMBIA1301-3'(HindIII) pCAMBIA2300M13R(-48)M13F(-47)/M13F(-49) pCANTB5E S1S6pCAT3-enhancer RVP3此载体无反向引物pCDFDuet-1(MCSI)ACYCDuetUP1 Primer DuetDOWN1 pCDFDuet-1(MCSII)DuetUP2T7TERpcDNA1.1 CMV-Profor,T7 pCDM8-3pcDNA2.1 M13for/T7 M13rev/Tac-Profor pcDNA3 T7/CMV-Profor BGH rev/SP6pcDNA3.1(+/-) pcDNA3.1F/T7/CMV-Profor BGH revpcDNA3.1/His(_A,_B,_C) T7/CMV-Profor BGH revpcDNA3.1/myc-His(_A,_B,_C) T7/CMV-Profor BGH rev/c-mycrev pcDNA3.1/V5-His(_A,_B,_C) T7/CMV-Profor BGH rev/V5revpcDNA3.1/Hygro(+,-) T7/CMV-Profor BGH rev/V5revpcDNA3.1/Zeo(+.-) T7BGHrevpcDNA3.3TOPOTA CMV-Profor TKPAreversepcDNA4/HisMax(_A,_B,_C) Xpressfor BGH revpcDNA4/HisMax-TOPO Xpressfor BGH revpcDNA4/HisMax-TOPO/lacZ Xpressfor BGH revpcDNA4/myc-His(_A,_B,_C)T7,CMV-Profor BGH rev,c-mycrev pcDNA4/TO TREfor/CMV-Profor BGH revpcDNA4/V5-His(_A,_B,_C) CMV-Profor,T7 BGH rev,V5revpcDNA4-TET/ON/AMP+CMV-Profor pcDNA5/FRT T7/CMV-Profor BGH revpcDNA6/myc-His(_A,_B,_C) CMV-Profor,T7 BGH rev,c-mycrev pcDNA6/V5-His(_A,_B,_C) CMV-Profor,T7 BGH rev,V5revpCEP4pCEP-F/CMV-Profor EBVrevpCI T7（17BASE） EBVrevpCI-neo T7（17BASE） EBVrev,T3pCMS-EGFP T7 T3pCMS-EGFP T7 EBVrev,T3pCMV-3Tag-4A T3 /PFLAG-CMV-F T7pCMV5pCMV5F PCMV5RpCMV6 CMV-Profor pCMV6-3、HGHrev pCMV6-XL4 CMV-Profor/T7 pCMV6-3、HGHrev pCMV-HA PCMV-F,CMV-Profor,TREfor PCMV-R，EBVrev pCMV-MYC(AMP+)PCMV-F PCMV-R, EBVrev pCMVmyc/nuc CMV-Profor BGH rev,c-mycrevpcmv-scriptEXVector T3 T7pCMV-Sport6 T7/M13for SP6/M13rev pCOLADuet-1(MCSI)ACYCDuetUP1 Primer DuetDOWN1pCOLADuet-1(MCSII)DuetUP2T7TERpCR2.1 T7,M13for M13revpCR2.1-TOPO M13for,T7 M13revpCR3.1 T7 BGH revpCR3.1-Uni T7 BGH revpCR4 T3/M13rev T7/M13forpCR4-Blunt T3/M13rev T7/M13forpCR4-TOPO M13rev,T3 M13for,T7pCR-Blunt M13rev T7,M13forpCR-BluntII M13rev/SP6 T7/M13forpCR-BluntII-TOPO M13rev/SP6 M13for/T7pCRII M13rev/SP6 T7/M13forpCRII-TOPO M13rev/SP6 M13for/T7pCR-ScriptSK(+) T7/M13for T3/M13revpCR-XL-TOPO M13rev T7,M13forpCS2+(MCSI) SP6 EBVrev,T7?pCS2+(MCSII) T3 pSG5-3pDB_GAL4cam T7P pDB_leu PDBLeu-5 PDBLeu-3pDEST22DEST22F DEST22RpDEST15 pGEX-5 T7-TerminatorpDEST20 pGEX-5 pFastBac-3pDEST26 TREfor/CMV-Profor T7/M13forpDisplay T7/CMV-Profor c-mycrevpDNR-LIB(MCS_A) M13for,T7 pSG5-3,M13RpDonar M13F M13RpDONR201PDONR-F PDONR-RpDONR207PDONR-F PDONR-RpDONR223M13F M13RpDrive T7/M13rev SP6/M13forpDsRED1-C1(DsRed1-N-f)DsRed1-C-rpDsRed1-N1 CMV-Profor RFP-Nrev,CMV-R? pDsRed2-N1(DsRed1-N-f)DsRed1-C-rpDsRed2-C1(DsRed1-N-f)DsRed1-C-rpDsRED2-C1(KAN+)pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’pDsRed-Express dsRed1_N_primer/CMV-F dsRed1_C_primer/CMV-R pDSRED-monomer-N1(KAN+)dsRed1_N_primer pDSRED-N1(KAN+)pEGFP-N-5’ pDSRED-N-RpEASY-Blunt M13F T7/ M13RpEASY-BluntSimple M13F T7/ M13R（距离插入位点合适，优先安排）pEASY-T1 Simple M13F M13R（距离插入位点合适，优先安排）pEASY-T1M13F/T7M13RpEASY-T3M13F/T7M13R/SP6pECFP-N(C)PECFP-N-5.PECFP-N-3,pEF/myc/cyto/ER/mito/nuc pEF-5Pcdna3.1R/BGH revpEF1(4,6/myc-His) T7/pEF-5Pcdna3.1R/BGH revpEF1(4,6/V5-His) T7/pEF-5Pcdna3.1R/BGH revpEF1(4;6/His_A;_B;_C) T7/Xpressfor Pcdna3.1R/BGH revpEF5/FRT/V5-D(-TOPO) T7/pEF-5Pcdna3.1R/BGH rev pEGFP M13rev EGFP-NrevpEGFP-1 not available EGFP-Nrev/ PEGFP-N-3′pEGFP-C PEGFP-C-5′PEGFP-C-3′pEGFP-C1 EGFP-Cfor SV40-pArevpEGFP-C2 EGFP-Cfor SV40-pArevpEGFP-C3 EGFP-Cfor SV40-pArevpEGFP-F EGFP-Cfor SV40-pArevpEGFP-N PEGFP-N-5′PEGFP-N-3′pEGFP-N1 CMV-Profor EGFP-NrevpEGFP-N2 CMV-Profor EGFP-NrevpEGFP-N3 CMV-Profor EGFP-NrevpENTR M13F M13RpET-11(-a,-b,-c,-d) T7 T7-TerminatorpET-12(-a,-b,-c) T7 T7-TerminatorpET-14b T7 T7-TerminatorpET-15b T7 T7-TerminatorpET-16b T7 T7-TerminatorpET-17b T7 T7-TerminatorpET-17xb T7 T7-TerminatorpET-19b T7 T7-TerminatorpET-20b(+) T7 T7-TerminatorpET-21(-a,-b,-c,-d)(+) T7 T7-TerminatorpET-22b(+) T7 T7-TerminatorpET-23(-a,-b,-c,-d)(+) T7 T7-TerminatorpET-24(-a,-b,-c,-d)(+) T7 T7-TerminatorpET-25b(+) T7 T7-TerminatorpET-26b(+) T7 T7-TerminatorpET-27b(+) T7 T7-TerminatorpET-28a(-b,-c)(+) T7 T7-TerminatorpET-29a(-b,-c)(+)S.tag/T7 T7-TerminatorpET-3(-a,-b,-c,-d) T7 T7-TerminatorpET-30_Ek/LIC T7 T7-TerminatorpET-30_Xa/LIC T7 T7-TerminatorpET-30a(-b,-c)(+)S.tag/T7 T7-TerminatorpET-31b(+) not available T7-TerminatorpET-32_Ek/LIC TRXfor T7-Terminator pET-32_XA/LIC TRXfor T7-Terminator pET-32a(-b,-c)(+)S.tag/TRXfor T7-Terminator pET-33b(+) T7 T7-Terminator pET-34b(+)S.tag T7-Terminator pET-35b(+)S.tag T7-Terminator pET-36b(+)S.tag T7-Terminator pET-37b(+)S.tag T7-Terminator pET-38b(+) not available T7-Terminator pET-39b(+)S.tag T7-Terminator pET-40b(+)S.tag T7-Terminator pET-41_Ek/LIC GST-Cfor T7-Terminator pET-41a(-b,-c)(+) S.tag/pGEX-5 T7-Terminator pET-42a(-b,-c)(+)S.tag/pGEX-5 T7-Terminator pET-43.1a(-b,-c)(+)S.tag coliDOWNpET-43.1a_EK/LIC S.tag not availablepET-44a(-b,-c)(+)S.tag T7-Terminator pET-44a_EK/LIC S.tag not availablepET-45b(+) T7 T7-Terminator pET-46_Ek/LIC T7 T7-Terminator pET-5(-a,-b,-c) T7 T7-Terminator pET-52b(+) T7 T7-Terminator pET-7 T7 T7-Terminator pET-9(-a,-b,-c,-d) T7 T7-Terminator pETcoco-1 T7 T7-Terminator pETDuet-1(MCSI)pETUP1DuetDOWN1 pETDuet-1(MCSII)DuetUp2T7-Terminator pET-T4 T7 T7-Terminator pEYFP-C1pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3' pEYFP-N1pEGFP-N-5’,CMV-Profor pEGFP-N-3’ pFLAG-ATS N26for pTrcHis-rv；C24rev pFLAG-CTC N26for pTrcHis-rv；C24rev pFLAG1N26for pTrcHis-rv；C24rev pFLAG-CMV(-2)CMV-30；CMV-Profor CMV-24pFLAG-CMV1CMV-30CMV-24pGAD424GAL4_ADfor3'ADpGADGH GAL4_ADfor3'ADpGADT7T7/GAL4_ADfor3'ADpGADT7-Rec T7/GAL4_ADfor3'ADpGADT-T T73,BDpGAD10GAL4_ADfor3'ADpGAPZa-A a-FACTOR3'AOXpGBKT7T73,BDpGBT9MATCHMAKER5'DNA-BD/GAL4BD MATCHMAKER3'DNA-BDpGEM-1 T7 SP6pGEM-3 T7 SP6pGEM-3Zf(+)(-) SP6/M13rev T7/M13for pGEM-4 T7 SP6pGEM-4Z T7/M13for SP6/M13rev pGEM-5Zf(+)(-) SP6/M13rev T7/M13for pGEM-7Zf(+)(-) SP6/M13rev T7/M13for pGEM-9Zf(+)(-) T7/M13for SP6/M13rev pGEM-T T7/M13for SP6/M13rev pGEM-T_Easy T7/M13for SP6/M13rev pGene/V5-His_A(_B,_C) pGENE-5 BGH rev,V5rev pGEX-2T pGEX-5 pGEX-3 pGEX-2TK pGEX-5 pGEX-3 pGEX-3X pGEX-5 pGEX-3 pGEX-4T-1(-2,-3) pGEX-5 pGEX-3 pGEX-5X-1(-2,-3) pGEX-5 pGEX-3 pGEX-6P-1(-2,-3) pGEX-5 pGEX-3pGL2GLP1 GLP2pGL3RVP3GLP2(RVP4)(没有特别说明用GLP2)pGL3-Basic(MCSI) RVP3(PGL3+)? GLP2(PGL3-)?pGL3-Basic(MCSII) RVP4, PLXSN-3'?pGL4 pGlow(-TOPO) T7 pGlow-3pGM-T T7SP6pGWC SP6T7pHook-2 T7/CMV-Profor not availablepIND/V5-His_A(_B,_C) not available BGH rev,V5rev PinpointTMVector PinpointPrimer SP6pIRES(MCSI) T7 pIRES-3pIRES(MCSII) not available T3,EBVrevpIRES2-EGFP CMV-Profor,pIRES2-EGFP.P5’ IRESrev,pIRES2-EGFP.P3’pIRES-hrGFP-2a CMV-Profor,T3 pIRES-hrGFP-3 pIRESneo2 T7/CMV-Profor pIRES-3pIVEX(all) T7/pBRrevBam T7-TerminatorpLEXA pLEXA-F pLEXA-RpLNCX pLNCX-F pLNCX-RpLNCX2CMV-Profor pRevTRE-3pLVTHM（H1启动子下游）H1primer SP6pLXSN pLXSN-F pLXSN-RpMALc MalE primer M13F(-47)pMAL-c2E MalE primer M13F(-47)pMAL-C2x Pmal-c2x-F(P5’)Pmal-C2X-R(P3’ ) pMALd MalE primer M13F(-47)pMALe MalE primer M13F(-47)pMAL-P4X MalE primer M13F(-47)pMAL-p2X MalE primer M13F(-47)pMET A/B/C AUG1F AUG1RpMD18-T M13R(-48)ECORI M13F(-47)(HINDⅢ) pMD19-T M13F47M13R48pMD20-T M13F47M13R48 pMOSBlue T7/M13rev M13forpMSCV-puro pLXSNfw pMSCVrevpMT/V5-His_A(_B,_C) Mtfor BGH rev,V5rev pNTAP T3T7pCTAP pCTAP5'primer T7pOTB7 M13rev/T7 M13for/SP6 pOptiVEC-TOPO TA CMV-F/CMV-Profor EMCVIRES reverse pPC86PPC86-F PPC86-RpPC97PBD-GAL4-F PBD-GAL4-RpPIC3.5K5'AOX3'AOXpPic9k(A+,Z+)5’AOX(Ppic9k-f)/a-factor3’AOX(Ppic9k-R) pPICZa5'AOX/PPICZa-F3'AOX pPROEXHTA M13R(-48)无反向引物pProEX-HTa(b,c)M13R48/ Tac-Profor pBADrv/pTrcHis-3 pPD129.36 M13F20/M13FpQE30or40or60(AMP+)PQE30-F PQE-30RpRC/CMV2/CAT CMV/T7 pRECEIVER CMV-F 此载体无反向引物pRECEIVER-M03pRECEIVER-M03F pRECEIVER-M03R pREP4pREP4 forward primer EBV reverse primer pRK5 SP6 pSG5-3pRSET T7/Xpressfor T7terpRSFDuet-1(MCSI)DuetUP1DuetDOWN1 pRSFDuet-1(MCSII)DuetUP2T7TERpSecTac2 T7/CMV-Profor BGH rev/c-mycrev pSG5 pSG5-5,/T7PSG5-R(SV40) pSHlox1 T7 SP6pSHUTTLE-CMV PSHUTTLE-CMV-F PSHUTTLE-CMV-R pSI T7 EBVrevpSilencer1.0-U6 T7 T3pSilencer2.0-U6 T7 M13forpSilencer2.1-U6neo T7 M13forpSilencer3.1-H1hygro M13F(-47) 3.0REVpSilencer4_1-CMVneo pSilener4.1-5' CMV-Profor pSILENCEV2.0-U6T7 2.0REVpSIneo T7 EBVrev,T3Psit T7 T7TpSK01-T M13F M13RpSK-CMV(KAN+)T7 T3pSOS Psos5'Psos3'pSP64 SP6 M13revpSP64/65SP6 此载体无反向引物pSP65 SP6 M13revpSP70 SP6 T7pSP71 SP6 T7pSP72 SP6 T7pSP73 SP6 T7pSport1SP6/M13F(-47)T7/M13R pSPORT1 SP6/M13for T7/M13revpSPT18 SP6 T7pSTBlue T7/M13rev SP6/M13for pSUPER.Basic T7/M13F M13RpSUPER T7T3pSURE-T M13F M13RpSURE-Tsimple M13F-47M13R-48 pSuperCos pBRforEco T7pT3T7 M13rev/T3 M13for/T7pT7-7 T7 not availablepT7Blue®T7 M13F(-47)pT7T3_18U M13rev/T7 M13for/T3pT7T3D-PAC M13rev/T7 M13for/T3pTA2M13F/T7(优先使用M13F）T3/M13RpT-Adv M13rev T7,M13forpTAg T7/M13rev M13for pTARGETTM pTarget.F(在T7前面）/T7 pTarget.RpTG19-T M13F(-47)M13R(-48) pTARGETTM T7/M13F PTARGET-SEQ pThioHisA,B,andC Trx Forward Trx Reverse / M13for pTO-T7T7 T7TERpTRC99A PTRC99A-F pTrcHis-rvpTrc99a-c PTRC99C-F PTRC99C-RpTRC99a-c PTRC99C-F PTRC99C-R pTrcHisB PTrcHisA-F/Xpressfor PTrcHisA-R pTrcHisA PTrcHisA-F PTrcHisA-RpT-REX-DEST30 TREfor T7pTriEx1 T7/TriExup TriExdownpTriEx1.1 T7/TriExup TriExdownpTriEx1.1_Hygro T7/TriExup not availablepTriEx1.1_Neo T7/TriExup IRESrevpTriplEX1 TriplEx-LD-5 T7,TriplEx-LD-3pTriplEX2 TriplEx-LD-5；pTR5‘ T7,TriplEx-LD-3pTWIN-1T7 T7TERpTXB1 T7 MxeInteinrevpTXB2 T7 MxeInteinrevpTXB3 T7 MxeInteinrevpTYB1 T7 InteinrevpTYB2 T7 InteinrevpTYB3 T7 InteinrevpTYB4 T7 InteinrevpTZ_18U T7/M13rev M13forpUB6/V5-His UB-F BGH rev,V5revpUC13 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC18 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC18(19)/118(119)M13F(-47)M13R(-48)/PUC19(HINDⅢ) pUC19 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC57 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC8 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUC9 M13rev/M13rev(-48) M13for/M13for(-49)pUM-T M13F(-20)M13R(-20)pUCm-T(AMP+)M13F/T7M13RpUNI/V5-His not available BGH rev,V5revpVAX1T7 T7/CMV-Profor PCDNA3.1R/BGHRpVP22/mycHis VP22-Cfor BGH rev,c-mycrevpVP22/mycHis2 T7/CMV-Profor VP22-NrevpWE15 pBRrevHind T7pYES2 T7pYes2.RpYES-DEST52 T7/GAL1-Profor V5rev/CYC1-Terminator pYEX_4T_1 Clontech pYEX_4T-3pYEX_4T_2 pGEX-5 pYEX_4T-4pYEX_4T_3 pGEX-5 pYEX_4T-4pYEX_4T_4 pGEX-5 pYEX_4T-4pZeoSV2+/hu-Tyr T7 not availablepZERO-1 M13rev/SP6 T7/M13forpZERO-2 M13rev/SP6 M13for/T7pZome-1-C Zome-F Zome-RpZome-1-N Zome-F Zome-RYCp50(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBamYEp13(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBamYEp24(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBamYIp5(BamHI-site) PBRforBam PBRrevBam RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-U6ZsGreen U6 菌PCDB T7BGH天为时代TA载体T7T3m13（+）T7？T3？pMSCV-neo pMSCV-5'pMSCV-3'。
载体及其上下游引物
BGH rev/c-mycrev
pcDNA3.1/V5-His(_A,_B,_C)
T7/CMV-Profor
BGH rev/V5rev
pcDNA3.1/Hygro(+,-)
T7/CMV-Profor
BGH rev/V5rev
pcDNA3.1/Zeo(+.-)
T7
BGHrev
pCAMBIA1301(1300)
pCAMBIA1301-5'(ECORI)/M13R
pCAMBIA1301-3'(HindIII)
pCAMBIA1304
pCAMBIA1301-5'(ECORI)
pCAMBIA1301-3'(HindIII)
pCAMBIA2300
M13R(-48)
M13F(-47)/M13F(-49)
pACT2
GAL4 ADfor
pGAL4-ADrv
pACT2
p17110
p12584
pACYC184(BamHI-site)
PBRforBam
PBRrevBam
pACYCDuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pACYCDuet-1(MCSII)
DuetUp2
T7-Terminator
pDEST26
TREfor/CMV-Profor
T7/M13for
pDisplay
T7/CMV-Profor
c-mycrev
pDNR-LIB(MCS_A)
M13for,T7
pSG5-3,M13R
pDonar
M13F
3个水稻RNAi载体的构建与应用
3个水稻RNAi载体的构建与应用柯建浩;廖耀平;王骆艺;穆虹【摘要】利用RNAi(RNA interference)干扰技术,构建了启动子和干涉区域不同的3种水稻干涉载体,通过农杆菌介导转化水稻粳稻品种中花11.表型和分子分析表明,3种载体都能有效降解靶基因OsUGP2,暗示pRNAi-ubi-UGP2载体能同时沉默OsUGP2家族基因,pRNAi-ubi-UGP2PRO载体能特异沉默OsUGP2,pRNAi-IP-UGP2载体对OsUGP2基因的沉默不具特异性,但其沉默具有人为可调控性.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)009【总页数】4页(P1-3,封2)【关键词】水稻;RNAi;载体构建;OsUGP2【作者】柯建浩;廖耀平;王骆艺;穆虹【作者单位】广东省农科院水稻研究所,广东广州510640;华南农业大学生命科学学院,广东广州510640;广东省农科院水稻研究所,广东广州510640;广东省农科院水稻研究所,广东广州510640;华南农业大学生命科学学院,广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】S511;Q785水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球一半以上的人口以稻米为主食。
水稻是我国最重要的粮食作物，总面积、总产量及单位面积产量均居全国粮食作物首位。
同时，水稻也是单子叶植物研究的模式植物，其基因组在禾谷类作物中是最小的，约由4.3亿个碱基对组成[1-2]。
目前，水稻全基因组测序已基本完成，对其基因进行功能分析已成为世界研究热点。
对基因功能进行分析可采取正向遗传学和反向遗传学两种策略[3-4]。
其中，RNAi 作为反向遗传学策略的一种方法，已成为揭示水稻基因功能的一件重要利器。
植物中常用的 RNAi技术包括转录后基因沉默技术（posttranscriptional gene silencing，PTGS）和转录基因沉默技术（transcriptional gene silencing，TGS）[5]。
常用载体测序引物列表
常用载体测序引物列表常用载体测序引物列表载体名称正向引物反向引物pACT T7 T3pACT2 GAL4 AD(5’AD) 3'AD/pACT2-R PACYCDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TERpAD/pl-DEST CMV-FpAD-Track pAD-Track-F 无pAS2-1 5’BD M13-26/48 PB42AD PB42ADF PB42ADR PBAD PBAD-F PBAD-R pBABE pBABE5’ pBABE3’ PBACPAK8 BAC1 BAC2 pBK-CMV T7/M13-20 T3/M13-26 PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7T3/M13R pBV220 PBV220F PBV220R pBI121需根据酶切位点确认需根据酶切位点确认 pCAMBIA 1301(1300) 需根据酶切位点确认需根据酶切位点确认pCAMBIA 2300 需根据酶切位点确认需根据酶切位点确认PCANTB5E S1/M13R S6pCAT3-enhancer pGL3+pcDNA3.0 pEGFP-N5/T7 SP6/BGHpcDNA3.1 pEGFP-N5/T7 BGHpcDNA4 T7/pEGFP-N5 BGHpcDNA6 T7/pEGFP-N5 BGHpcDNAII T7SP6 pCE2.1 M13FM13R pCEP4 pCMV5R/PCEP-F pEGFP-N5/EBV-R pCF-T M13FM13R pCIT7（17Base ） pCMV5R pCI-neo T7（17Base ） T3pCMS-EGFP T7T3 pCMV-3Tag-4A T3 /pFlag-CMV-F T7pCMV5 pCMV5F pCMV5R pCMV5-Flag pCMV5FpCMV5R pCMV-MYC/NUC pCMV5FpCMV5R PCMV-HA pCMV5FpCMV5R pCMV-SportSP6/M13RpCMV-Tag T3T7 pCMV-TNT T7/SP6pCMV5R pCR2.1-TOPO M13F/T7M13R pCR3.1 T7BGH pCS2 SP6T7PDNR-LIB M13F M13RpDonar M13F M13R pDONR201 pDONR-F pDONR-R pDONR221 M13F M13RpDrive T7 SP6 pDRIveR T7 SP6pDsRED1-C1 pDsRED-C1-F pECFP-C-3 pDsRed1-N1 pEGFP-N-5 RFP-NrevpDsRed-Monomer-N1 pEGFP-N-5 pDsRed1-NpDsRED2-C1 pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’pEGFP-N-5 pDsRed1-N pDSRED2-N1pDSRED-N1 pEGFP-N-5’ PDSRED-N-R pEASY-BLUNT M13F/T7 M13RTerpEASY-E1 T7 T7pEASY-T1 M13F/T7 M13RpEASY-T3 M13F/T7 M13R/SP6 pECFP-C pEGFP-C-5’ pECFP-C-3' pECFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEF/myc/ER pEF-F pCDNA3.1R pEGFP-C pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3' pEGFP-N pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’ pENTR/D-TOPO M13F M13RTerpET-*(His) T7 T7pET22(a,b,c) T7 T7TerTerpET28,30,24,49 T7 T7TerpET32(a,b,c) T7/S.tag T7pET-42a (-b, -c)(+) Stag T7 TerpET50 T7/s.tag T7TERpET44 T7/s.tag T7Ter pEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’ PETBlue M13-20 PETBlueDOWN PETDUET-1(MCSI) PBRrevBam DuetDOMN1 PETDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TERpEYFP-C1 pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3' pEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’ pFastBac pFastBac-F pFastBac-R pFastBac HT_A,B,C pFastBac-PH pECFP-C-3 pFastBac1 pFastBac-PH pECFP-C-3 pFastBac Dual (MCSI) pFastBac-PH pECFP-C-3 pFLAG-CMV CMV30/pFLAG-CMV-F CMV-24/pFLAG-CMV-Rp3xFlag-CMV-7.1 CMV-F/CMV24 CMV30pGAD424 5’AD 3'ADpGADGH 5’AD 3'ADpGADT7-Rec 5’AD/T7 3'ADpGAPZa-A/B/C a-FACTOR 3'AOXforward 3'AOXpGAPZ-A/B/C pGAPpGBKT7 T7 3'BDpGEM-T(-Easy) M13F/T7 SP6/M13RpGEX-(*)T pGEX-5’ pGEX-3’pGL2 pCMV5R PGL3-Pgl3-BASIC pGL3+ PGL3-pGL3-Enhancer pGL3+ PGL3-PinPoint TM PinPoint Primer SP6pIRES PIRES-F/T7 T3/PIRES-RpIRES2-EGFP pIRES2-EGFP.P5’pIRES2-EGFP.P3’ pLenti6/v5-Dest pEGFP-N-5’PLEXA PLEXA-F PLEXA-R PLNCX PLNCX-F PLNCX-R pLXSN pLXSN-F pLXSN-RPjc1-tac T7pJet.1.21.Blunt T7primer M13F(-47) pMAL-c2E MalEP3/PMAL-C2X-R pMAL-C2x P5/PMAL-C2X-Fprimer M13F(-47) pMAL-p2X MalEPMD18-T M13R(-48) M13F(-47) PMD19-T M13F(-47) M13R(-48) pMIR-report M13FPPC86 PPC86-F PPC86-R3’AOXpPIC9K 5’AOX/a-factor3'AOX pPICZa 5'AOX/PPICZa-FpPROEXHTA M13R(-48)pQE30or40 pQE30+ pQE30- pRECEIVER CMV-FpRSET T7 T7TER PRSFDUET-1(MCSI) DuetUP1 DuetDOWN1 PRSFDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TERpShuttle-CMV pShuttle-CMV-F pShuttle-CMV-R PSILENCE-1.0-U6 T7 T3pSilencer3.1-H1 hygro M13F(-47) 3.0revpSILENCEV2.0-U6 T7 2.0revpSK01-T M13F M13RpSK-CMV T7 T3Psos H1PSP64/65 SP6pSP72 T7 SP6T7/M13RpSport1 SP6/M13F(-47)pSTBlue-1 T7 SP6pSUPER T7 T3pT7Blue(R) T7 M13F(-47)pTA2 M13F/T7 T3/M13R/T7 M13RpT-Adv M13FpTARGET TM pTarget-F/T7 arget-R PTHIOHISA,B,C TRX-FORWARD TRX-REVERSEpTO-T7 T7 T7TERPBV220-/PTRC99C-R pTRC99a-c PQE30+/PTRC99C-F pTriPLEx2 PT5/5'TriplEx2 T7pTz57r/t M13+ M13-pTWIN-1 T7 T7TERpUC18(19)/118(119) M13F(-47) M13R(-48)M13F(-47)/M13F pUC57 M13R(-48)/M13RpUCm-T M13F/T7 M13RpVAX1 T7 BGHT3/M13R/M13R(-48) pWSK29 T7/M13F/M13F(-47) pXT7 T7 SP6pYES2 T7 pYes2.R。
载体与引物表(完全)
SP6 PYES2.R
M13R T3
载体抗性 Amp+
Amp+ Amp+ Amp+ Amp+ Amp+ Amp+ Amp+ Amp+
Amp+ Amp+ Amp+ Amp+
共3第3页
PM
PM-F
pMAL-c2E
MalE primer
pMAL-C2x
P5’
pMAL-p2X
MalE primer
pMD18-T
PQE30F/M13R(-48)/RV-M
Pmep4
pMEP4-F
pPIC9K(A+,Z+)
5’AOX(pPIC9K-F)
PPICZa pPROEXHTA
5'AOX/PPICZa-F M13R(-48)
pcDNA3.1R BGH
Amp+
M13F
M13R
pCEP-F pCI-F2/ T7(17base)
EBV-R (此载体没有反向引物)EBR
pCI-F2/ T7(19/17base)
T3
Amp+
T7 2G
T3
pCMV-F
pCMV-R
T3 /PFLAG-CMV-F
T7
Pcmv5f
Pcmv5r
Amp+
Pcmv5f
PDC316.R Primer(R)
载体抗性
pDonar
M13F
M13R
pDONR207
FORWARD
REVERSE
Pdonr221
M13F
利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体
利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体【摘要】目的：本研究以构建存活素增强型绿色荧光蛋白(survivin ＆efp)融合基因慢病毒表达载体（pcfusurvivin）为例来探讨infusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值。
方法：根据infusion技术原理，克隆引物设计时，在survivin 同源序列的两侧分别引入经ae i线性化的载体pcfu两端各15个碱基，将以此引物扩增的聚合酶链式反应（pcr）产物与线性化pcfu用infusion交换酶在室温下作用30min，使survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换，取2μl交换液进行转化，挑取阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。
将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293t 细胞，观察survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。
结果：每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数，阳性率达90%以上，瞬时转染pcfusurvivin可获得survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。
结论：该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费。
关键词】基因；克隆细胞；基因，病毒value of infusion clonin techhique on routine vector construction lin chao ui fan lin chen lian londepartment of cardioloy，union hospital，fujianmedical university，fuzhou，fujian，350001，abstract：objective:to introduce a simple method for the clonin of pcr products.methods:the infusion clonin technique was described by constructin a rebinant lentivirus vector (pcfu) with survivin ＆efp fusion ene as a sample.the survivin cdna was amplified with survivin ene specific primers with 15 bp extensions homoloous to the pcfu ends.by the action of the infusion enzyme at room temperature for 30 minutes，the sinlestranded pcr frament and vector ends were fused due to the 15 bp homoloy.finally，clones derived from transformation were chosen randomly and identified.results:about 103 positive clones for inserts were obtained after transformation with 2 μl of exchanin products，and the ratio of the positive colonies was more than 90%.after 24 h the pcfusurvivin was transfected into 293t eukaryotic cells，the expression of the survivin ＆efp fusion ene can be confirmed with fluorescence microscope.conclusion:the liation independent property makes the infusion pcr clonin technique rapid，reliable and hiher costeffective，avoidin the need for multiple sub clonin steps.key words：enes;clone cells;enes,viral传统的聚合酶链式反应（pcr）产物克隆技术包括补平末端克隆、ta克隆以及连接酶依赖性克隆等。
常用载体及相关通用引物
常用载体及相关通用引物默认分类2008-10-06 13:16:31 阅读512 评论0 字号：大中小载体一端另一端pBlueScriptSK(+) M13F(-77)/M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-88)/M13R(-48)/M13R/T3 pcDNA3 H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 BGHpcDNA3.1(+) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.0(+)/myc-His C/A/B H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 BGHpcDNA3.1(+)/myc-His C/A/B H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1(+)/myc-His/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/His C/A/B H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/His/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Hygro(-) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Hygro(+) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Hygro/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/V5-His C/A/B H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/V5-His/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/V5-His-TOPO H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/V5-His-TOPO/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Zeo(-) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Zeo(+) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Zeo/CAT H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpColdI DNA p-GEX3’pColdII DNA p-GEX3’pColdIII DNA p-GEX3’pColdIV DNA p-GEX3’pDream2.1 H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 SP6pEGFP-N1,2,3 H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5 pEGFP-N-3’/pEGFP-C-5’/pEGFP-C-3' pET15b T7 T7terpET20b T7 T7terpET22b T7 T7terpET28a T7 T7terpET28b T7 T7terpET30b T7 T7terpFastBac Dual pEGFP-C-3'pFastBac HT A,B,C pEGFP-C-3'pFastBac1 pEGFP-C-3'pGEM-T Easy M13F(-77)/M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-88)/M13R(-48)/M13RpGEX-4T-1/3 p-GEX5’ p-GEX3’pGS-21a p-GEX5’ T7terpLenti6/V5-D-TOPO M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-48)/M13R/T3pLenti6/V5-GW/lacZ M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-48)/M13R/T3pMAL-p2x M13F(-47)/M13F/PBV220R M13R(-48)pMD18-T M13F(-77)/M13F(-47)/M13F M13R(-88)/M13R(-48)/M13RpMD19-T M13F(-77)/M13F(-47)/M13F M13R(-88)/M13R(-48)/M13RpMTBiPV5-His GFP p-GEX3’/ M13F(-47)/M13F M13R(-88)/M13R(-48)/M13R /pEGFP-C-3'/BGH pPCR script M13F(-77)/M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-88)/M13R(-48)/M13R/T3pPIC3.5 5’AOX 3’AOXpPIC9 5’AOX 3’AOXpPICZ C/A/B 5’AOX 3’AOXpPICZalpha C/A/B 5’AOX/α-Factor 3’AOXpSecTag2 A,B,C H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 BGHpTWIN T7 T7terpUC57 M13F(-77)/M13F(-47)/M13F M13R(-88)/M13R(-48)/M13RpUC18 M13F(-47)/M13F M13R(-48)/M13RpUC19 M13F(-47)/M13F M13R(-48)/M13R其他…… ……注：1）排列顺序为：有左到右==（离插入为点）由远到近；2）若有多个引物，红色的为首选引物：3）选择测序通用引物时，以距离插入位点约50碱基为佳；4）同时有T7，T7ter的载体，单反应首选T7ter；5）同时有T7，pCDNA3.1R的载体，单反应首选pCDNA3.1R ；6）同时有T7，BGH的载体，单反应首选BGH；7）同时有pCMV-F，BGH的载体，单反应首选BGH；。
MicroRNA-29a对大鼠心肌细胞Bcl-2和Mcl-1表达的调控作用及其机制
MicroRNA-29a对大鼠心肌细胞Bcl-2和Mcl-1表达的调控作用及其机制张振辉;尤祥宇;刘少军;刘连;刘世明【摘要】AIM; To investigate the regulatory mechanisms of microRNA -29a (miR -29a) on the expression of Bcl - 2 and Mcl - 1 in rat cardiomyocytes ( CM cells) . METHODS: The CM cells were isolated from the hearts of new-born rats and transfected with miR - 29a mimic ( 100 nmol/L) by Lipofectamine RNAiMAX. The expression of Bcl - 2 and Mcl - 1 at mRNA and protein levels was detected by real - time fluorescence quantitative PCR and Western blotting. The luciferase assay was performed in HEK293T cells and CM cells, which were co - transfected with plasmid DNA and miRNA using Lipofectamine 2000. RESULTS: Transfection of miR - 29a mimics significantly reduced the expression levels of Bcl -2 and Mcl - 1 in CM cells as compared with the control cells (P <0. 05). In addition,HEK293T cells co -transfected with miR - 29a mimic and Bcl - 2 - 3 ' UTR - WT or Mcl - 1 - 3 ' UTR - WT plasmid significantly reduced the luciferase activity as compared with control group (P <0.05). While CM cells transfected with miR -29a inhibitor and Bcl -2-3' UTR - WT or Mcl - 1 - 3 ' UTR - WT plasmid in succession, the luciferase activity was increased inversely ( P < 0. 05 ) . CONCLUSION: miR - 29a may regulate apoptosis by targeting the bcl - 2 and mcl -1 genes.%目的:探讨microRNA-29a(miR-29a)对大鼠心肌细胞(CM细胞)B细胞白血病/淋巴瘤-2(Bcl-2) 和髓样细胞白血病-1(Mcl-1)表达的调控机制.方法:体外培养新生Sprague-Dawley大鼠CM细胞和人胚肾细胞株293T.合成大鼠miR-29a的拟似物(mimic)和抑制剂(inhibitor).用脂质体Lipofectamine RNAiMAX转染miR-29a mimic进入CM细胞,转染 48 h 后分别用实时荧光定量PCR和Western blotting检测Bcl-2和Mcl-1 mRNA和蛋白的表达变化.构建Bcl-2 和Mcl-1 的萤光素酶报告基因载体(DNA质粒),转染293T 细胞(DNA质粒和miRNA共转染)和CM细胞(miRNA和 DNA 质粒先后转染),双萤光素酶报告基因系统检测萤光素酶的表达变化.结果:CM细胞转染miR-29a mimic 48 h后,Bcl-2 和Mcl-1 mRNA和蛋白的水平均下调 (P<0.05).双萤光素酶报告基因系统显示,在293T细胞中,miR-29a可特异抑制带有 bcl-2和mcl-1 3'UTR上野生型识别元件的报告基因表达(P<0.05),在CM细胞中,抑制内源性的miR-29a水平能促进bcl-2和mcl-1 3'UTR上野生型识别元件的报告基因表达.结论:抗凋亡基因bcl-2和mcl-1是miR-29a的靶基因.miR-29a可能通过作用于Bcl-2和Mcl-1实现对心肌细胞凋亡的调控作用,具体效应仍待进一步阐明.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)011【总页数】5页(P1928-1932)【关键词】MicroRNA-29a;细胞凋亡;B细胞白血病/淋巴瘤-2;髓样细胞白血病-1【作者】张振辉;尤祥宇;刘少军;刘连;刘世明【作者单位】广州医学院第二附属医院重症医学科,广东,广州,510260;广州医学院第二附属医院广州心血管疾病研究所,广东,广州,510260;广州医学院第二附属医院广州心血管疾病研究所,广东,广州,510260;广州医学院第二附属医院广州心血管疾病研究所,广东,广州,510260;广州医学院第二附属医院广州心血管疾病研究所,广东,广州,510260;广州医学院第二附属医院心血管内科,广东,广州,510260【正文语种】中文【中图分类】R363微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，它可通过识别靶基因mRNA的3’端非编码区(3’UTR)，并与之结合阻止翻译或导致mRNA降解，从而抑制靶基因的表达[1－3]。
菌液PCR经验
菌液PCR经验总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物4 d i+ b' D9 _4 _. D6 R5 K如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-R9 i' {( P3 O& M2 gpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）- ^5 m5 T8 j" a( t( F挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中* f2 B5 a* q( E$ ~4 p37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上, y9 \& F& Y$ a& P/ N, v. R2 r（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins 甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）J提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉,我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度r5.模板的量：1-2ul, ~6 U. i5 _0 @1 z K# ]' w未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）7 v6 O# l" ~; G+ G1 E4 ^7 v2 ^# ^2 b8 m9 T' r( V" l J: c6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成,T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7 @4 D# s. P0 j' a+ l2 u7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P 出来' x& I2 H; W! L6 B* W# A& h, Q0 F8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步a5 w7 C% _. S2 W% M7 s再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇3 b% u& Z7 P: Q$ I- Q4 Q1 y# V补充说明如下：7 v/ [$ Z% S$ X' D V8 `% k7 k鉴于很多同仁提到的假阳性的问题8 D- e' X5 S' E3 J我补充说明一下) M3 C" D; g! G( q- b1 y0 n* c4 W$ ]& j* @1 h# |0 M1.我需要做菌液PCR的目的是为了选取基因重组中的阳性克隆+ w* |. }0 Q" H5 x% {1 Z如果只是鉴定已获取的阳性质粒或是扩增,则不存在假阳性一说i) n2.我后面也补充说明了) R9 B' q3 \. _4 L* o通过调整合适的插入片段和载体的比例，基本上可以使得每个长出的菌落均为阳性菌落# n6 a$ R6 s( s$ G, _7 u后一组我后来通过浓度梯度做出来的图片# ?: p( G0 q5 T! M# w0 O* g插入片段和载体的mol比分别为4:1，7:1，10:1' j1 H3 N- D- w5 R8 b3种比率中7：1的是阳性连接比率最高的6 [4 B0 N% }6 _ S! j8 q0 c: f, [4：1的空载体最多所以，我想强调的是：通过调整合适的插入片段和载体的mol比例是可以完全做到长出的菌落全部为阳性菌落的另外，在挑取菌落的时候也是有讲究的,对于阳性菌落和无插入片段的载体菌落大小上是有一定区别的我在文章后来提到的通过选择具有一定特征的菌落以达到很高的阳性率也是可以做到的就是这个意思G" {我想通过这些手段也完全可以使菌液PCR显得多余所以我在文章的开头也说了,这篇文章应该是适合各位新手开始做重组时候的方法+ \3 |/ B9 O* i最后还有一个因素就是大家做重组的步骤上或许也有一些原因1 y- Y4 v) ?2 M+ w' h8 Z/ h, f7 P! T我用的是Invitrogen的T4 DNA ligase P$ {, n& X T( Q6 t4 T条件：26°C2-4h （我知道最好是16度过夜，只是苦于我们这里的实验室老师不让我们用PCR仪过夜，其他的设备又不能维持稳定的温度，且还和室温有关）转化：取1-2ul转化20ulTop10感受态细胞最后取150ul涂板，37°C过夜! j中间我也冥思苦想，考虑假阳性的源头最后考虑到的唯一的可能就是来自于未能和载体连接上的插入片段+ z7 M( N0 c1 ^我是直接取的连接产物去做转化2 F# s: B2 X1 r- _+ d* V- J（Invitrogen推荐的是将连接产物稀释至少10倍以上之后取2ul转化）: V- l b* S2 o3 d+ _自然这部分未能连接上的片段也被带入到扩增体系中0 A8 R' w7 u8 y) Y7 ~- ]最后这部分微量的插入片段被PCR仪扩增出来。
常见载体引物与序列
3'AOX 无反向引物 pQE-R: T7TER
3.0REV
2.0REV M13R T3 SP6 T7/M13R T3 T3/M13R M13R pTarget.R T7TER pTRC99C-R T7 T7TER(客户确认再用）
M13R(-48)
M13R BGH T3/M13R/M13R(-48) SP6
pYES2 pLEXA pLNCX pRECEIVER pSHUTTLE-CMV pSP64/65 pSTBlue-1 pT7Blue(R)
T7 pLEXA-F pLNCX-F CMV-F PSHUTTLE-CMV-F SP6 T7 T7
pYes2.R pLEXA-R pLNCX-R 此载体无反向引物 PSHUTTLE-CMV-R 此载体无反向引物 SP6 M13F(-47)
M13F
pCEP4
pCEP-F
pCF-T
M13F
pCI
T7（17Base）
pCI-neo
T7（17Base）
pCMS-EGFP
T7
pCMV-3Tag-4A
T3 /PFLAG-CMV-F
pCMV5
pCMV5F
pCMV5-Flag
pCMV5F
pCMV-MYC/HA
pCMV-F
pCMV-Sport
M13F/T7
GTT CTG AGG TCA TTA CTG G TGA GCG GAT AAC AAT TTC AC TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC TGA AGC GCA TGA ACT CCT TG TCC CAC AAC GAG GAC TAC AC ATT ATA GAG GAC ACC TAG TC TTC CAA AAT GTC GTA ATA AC TGC GTA CTG CGG TGA TCA AC CTG CAA GGC GAT TAA GTT GG ACG CAC AGA ATC TAG CGC TT AAC CAT CTC GCA AAT AAA TA TAA GAG TCA CTT TAA AAT TTG TAT AC CCA GGA TTT TCC CAG TCA C GGC TTT ACA CTT TAT GCT TC ACA TCC ACT TTG CCT TTC TC TCG GTT AGA GCG GAT GTG TCA TCG GAA GAG AGT AG AAG AGT TAC TCA AGA ACA AGA A GGT AGG CGT GTA CGG TGG GCA CTG GAG TGG CAA CTT CTT ACT GAC ATC CAC TTT GC CAC TGC ATT CTA GTT GTG GT CCA GGC TTT ACA CTT TAT GC
载体及通用引物
S1
S6
pCAT3-enhancer
RVP3
此载体无反向引物
pCDFDuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pCDFDuet-1(MCSII)
DuetUP2
T7TER
pcDNA1.1
CMV-Profor,T7
pCDM8-3
pcDNA2.1
M13for/T7
EGFP-Nrev/ PEGFP-N-3′
pEGFP-C
PEGFP-C-5′
PEGFP-C-3′
pEGFP-C1
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pEGFP-C2
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pEGFP-C3
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pEGFP-F
EGFP-Cfor
SV40-pArev
T7
T7-Terminator
pET-25b(+)
T7
T7-Terminator
pET-26b(+)
T7
T7-Terminator
pET-27b(+)
T7
T7-Terminator
pET-28a(-b,-c)(+)
T7
T7-Terminator
pET-29a(-b,-c)(+)
S.tag/T7
T7-Terminator
T7-Terminator
pET-20b(+)
T7
T7-Terminator
pET-21(-a,-b,-c,-d)(+)
T7
常见载体引物表
pMIR-report
M13F
PSI-CHECK2
PSI-CHECK2-F
PSICHECF-2-R1
PLK0.1
LK0.1-5
p3xFlag-CMV-7.1
CMV-F
CMV-F
无
pDSRED-PRESS-C1
pDSRED -C1-F
pDSRED-C1-R
pCR-Blunt
M13R
M13F/T7
pMT/V5-His_A (_B,_C)
MT-Profor
BGHrev
pEASY-T3
T7/M13F
SP6/M13R
PSILENCE-1.0-U6
T7
2.0REV(同P2(pCAMBIA 1301))
T7/S.tag
T7 Ter
pET-42a (-b, -c)(+)
Stag
T7 Ter
pET50(amp+)
T7/s.tag
T7TER
pET44(AMP+)
T7/s.tag
T7 Ter
pEYFP-N1
pEGFP-N-5’
pEGFP-N-3’
PETBlue
PETBlueT7UP(太靠前，在T7前)/ PETBlueUP
常见载体引物表
Vector
Primer(F)
Primer(R)
PBAD
PBAD-F/TRXF
PBAD-R
pACT
T7
T3
pAc5.1/V5-His
Ac5-Profor
BGH
pACT2
GAL4-AD-Cfor
pGAL4-ADrv
pAS2-1
常用载体及相关通用引物
常用载体及相关通用引物默认分类2008-10-06 13:16:31 阅读512 评论0 字号：大中小载体一端另一端pBlueScriptSK(+) M13F(-77)/M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-88)/M13R(-48)/M13R/T3 pcDNA3 H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 BGHpcDNA3.1(+) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.0(+)/myc-His C/A/B H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 BGHpcDNA3.1(+)/myc-His C/A/B H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1(+)/myc-His/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/His C/A/B H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/His/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Hygro(-) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Hygro(+) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Hygro/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/V5-His C/A/B H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/V5-His/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/V5-His-TOPO H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/V5-His-TOPO/LacZ H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Zeo(-) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Zeo(+) H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpcDNA3.1/Zeo/CAT H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 pCDNA3.1R/BGHpColdI DNA p-GEX3’pColdII DNA p-GEX3’pColdIII DNA p-GEX3’pColdIV DNA p-GEX3’pDream2.1 H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 SP6pEGFP-N1,2,3 H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5 pEGFP-N-3’/pEGFP-C-5’/pEGFP-C-3' pET15b T7 T7terpET20b T7 T7terpET22b T7 T7terpET28a T7 T7terpET28b T7 T7terpET30b T7 T7terpFastBac Dual pEGFP-C-3'pFastBac HT A,B,C pEGFP-C-3'pFastBac1 pEGFP-C-3'pGEM-T Easy M13F(-77)/M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-88)/M13R(-48)/M13RpGEX-4T-1/3 p-GEX5’ p-GEX3’pGS-21a p-GEX5’ T7terpLenti6/V5-D-TOPO M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-48)/M13R/T3pLenti6/V5-GW/lacZ M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-48)/M13R/T3pMAL-p2x M13F(-47)/M13F/PBV220R M13R(-48)pMD18-T M13F(-77)/M13F(-47)/M13F M13R(-88)/M13R(-48)/M13RpMD19-T M13F(-77)/M13F(-47)/M13F M13R(-88)/M13R(-48)/M13RpMTBiPV5-His GFP p-GEX3’/ M13F(-47)/M13F M13R(-88)/M13R(-48)/M13R /pEGFP-C-3'/BGH pPCR script M13F(-77)/M13F(-47)/M13F/T7 M13R(-88)/M13R(-48)/M13R/T3pPIC3.5 5’AOX 3’AOXpPIC9 5’AOX 3’AOXpPICZ C/A/B 5’AOX 3’AOXpPICZalpha C/A/B 5’AOX/α-Factor 3’AOXpSecTag2 A,B,C H1.3F/pCMV-F /pEGFP-N-5/T7 BGHpTWIN T7 T7terpUC57 M13F(-77)/M13F(-47)/M13F M13R(-88)/M13R(-48)/M13RpUC18 M13F(-47)/M13F M13R(-48)/M13RpUC19 M13F(-47)/M13F M13R(-48)/M13R其他…… ……注：1）排列顺序为：有左到右==（离插入为点）由远到近；2）若有多个引物，红色的为首选引物：3）选择测序通用引物时，以距离插入位点约50碱基为佳；4）同时有T7，T7ter的载体，单反应首选T7ter；5）同时有T7，pCDNA3.1R的载体，单反应首选pCDNA3.1R ；6）同时有T7，BGH的载体，单反应首选BGH；7）同时有pCMV-F，BGH的载体，单反应首选BGH；。
GA引物载体对照表1
AmpR AmpR
AmpR ZeocinR ZeocinR ZeocinR ZeocinR ZeocinR ZeocinR
KanaR
pGEM-1 pGEM-11z pGEM-3 pGEM-3z pGEM-3Zf(+)(-) pGEM-4 pGEM-4Z pGEM-4z pGEM-5z pGEM-5Zf(+)(-) pGEM-7z pGEM-7Zf(+)(-) pGEM-9z pGEM-9Zf(+)(-) pGEM-T pGEM-T pGEM-T_Easy pGEM-Teasy pGEX-4T-1(-2,-3) pGEX-5X-1(-2,-3) pGEX-6P-1(-2,-3) pGL2 pGL2-Basic pGL3(MCSI,luc+upstream) pGL3(MCSII,luc+downstream) pGL3-Basic(MCSI) pGL3-Basic(MCSII) pGL4(MCSI,luc+upstream) pGL4(MCSII,luc+downstream) pIRES(MCSI) pIRES(MCSII) pIRESneo2 pLVX-IRES-ZsGreen1 pMALc PMAL-C2X pMALd pMALe pMB438 Pmd18/19-T pPIC3.5K pPIC6A pPIC6alphaA pPIC6alphaB pPIC6alphaC
AmpR&KanaR AmpR&KanaR AmpR AmpR AmpR&KanaR AmpR&KanaR AmpR AmpR&KanaR
pET-3(-a,-b,-c,-d) pET-30_Ek/LIC pET-30_Xa/LIC pET-30a(-b,-c)(+) pET-31b(+) pET-32a(-b,-c)(+) pET-33b(+) pET-34b(+) pET-35b(+) pET-36b(+) pET-37b(+) pET-38b(+) pET-39b(+) pET-40b(+) pET-41a(-b,-c)(+) pET-42a(-b,-c)(+) pET-44a(-b,-c)(+) pET-44a_EK/LIC pET-45b(+) pET-46_Ek/LIC pET-5(-a,-b,-c) pET-7 pET-9(-a,-b,-c,-d) pETDuet-1(MCSI) pETDuet-1(MCSII) pFastBac-Dual pFastBacDual(MCSI,PHpromoter) pFastBacDual(MCSII,p10promoter) pFastBac-GT pFastBac-HT PFLAG-CMV4 pGADT7 pGADT7 pGAD-T7 pGAPZA pGAPZalphaA pGAPZalphaB pGAPZalphaC pGAPZB pGAPZC pGBD-T7 pGBKT7 pGBKT7
常见载体引物表
pMIR—report
M13F
PSI-CHECK2
PSI—CHECK2—F
PSICHECF-2—R1
PLK0。1
LK0.1-5
p3xFlag—CMV—7.1
CMV-F
T7/S。tag
T7 Ter
pET—42a (—b, —c)（+）
Stag
T7 Ter
pET50（amp+）
T7/s.tag
T7TER
pET44（AMP+）
T7/s。tag
T7 Ter
pEYFP—N1
pEGFP—N—5’
pEGFP—N-3’
PETBlue
PETBlueT7UP（太靠前，在T7前)/ PETBlueUP
pBACPAK8
BAC1
BAC2
pBK—CMV
T7
T3
PBS（SK/KS)/M13-
M13F/T7
T3/M13R
pBV220
PBV220F
PBV220R
pCAMBIA 1301（1300)
P1
P2（同2.0—rev）
pCAMBIA 2300
M13R（-48)
M13F(—47)
PCANTB5E
S1/M13R
pMSCV
MSCV5’
MSCV—rev
pBABE
pBABE5'
pBABE3’
pFastBac HT_A (_B, _C）
pFastBac—F
pFastBac—R
pFastBac1
PH-Profor/BaculoVfor
pFastBac-R
pACYCDuet—1 (MCS I)