GUS 组织化学染色-拟南芥

幼苗GUS染色实验

GUS洗液配方：

0.1 M PBS, pH 7.0

10mM EDTA

2mM 亚铁氰化钾potassium ferrocyanide

2mM 六氰合铁酸钾potassium ferricyanide

300mL中加0.254 g亚铁氰化钾，0.198 g六氰合铁酸钾，EDTA 6 mL（10 mM）

GUS染色液(1mM)就是把5 mg X-Glus（5 mg加100µL DMSO助溶，X-Glus用前离心3min）加到5 mL洗液里即成染色液。一次配5 mL染色液，1.5 mL离心管每管分装200 µL，锡纸包住-20℃保存。

步骤：

一般5d幼苗可进行试验，早上做以方便白天随时观察幼苗着色情况。

1.90%丙酮固定20min；

(丙酮(acetone)渗透力很强，能使蛋白质沉淀凝固，但不影响蛋白质的功能基团而保存酶的活性，用于固定磷酸酶和氧化酶效果较好，因此可用于GUS染色前的固定，可防止GUS信号的扩散。缺点是固定快、渗透力强，易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。一般4℃下20分钟为宜)

2. 加1 mL GUS洗液洗去丙酮，洗2遍；

3. 加GUS染色液，冰上抽真空15-20 min；

4. 37℃放置，隔一阵观察一下，染上色了就进行下面步骤；

5. 吸出染色液，加入1 mL 70%乙醇，停止染色反应及脱色；

6. 更换几次乙醇直到脱色完全；

7. 解剖镜及显微镜拍照观察

载玻片上加适量HCG透明液，用镊子取出幼苗在透明液中铺平，盖上盖玻片，解剖镜观察整株，显微镜观察细节并拍照。

实验原理：

GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，相当稳定而不易降解。根据GUS基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高）。其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了解gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。