GUS 组织化学染色-拟南芥
实验八GUS组织化学定位
报告基因GUS的表达的检测
材料：拟南芥AK12-pro 试剂： GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚 铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml， 4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc， 再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备 用。 组织化学染色检测 -- GUS染色 1. 取2支1.5ml离心管，各加入0.5ml 1mol/L GUS染色液； 2. 用镊子夹取 转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心 管中； 3. 37℃浸泡2-5h（或过夜）；（晚上继续下面的脱色和照相步骤） 4. 倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色； 肉眼下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现 蓝色。
实验报告
转基因作物的检测
新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性）
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter GUS NOS-ter LB
p动子 nopaline synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶
考核
成绩计算方法（百分制）：
期末考试: 50分（考试内容包括平时操作和涉及实
验的理论基础）
平时成绩: 50分 (共5份实验报告,每份10分)
基 因 工 程 的 基 本 路 线
质粒DNA提 取和酶切
PCR
连接
转化
• 基因的组织特异性表达
原 理
GUS基因就是转β-葡萄糖醛酸酶基因 ，它存在于 E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯 类物质为底物，其分解产物呈蓝色。 由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背 景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的 研究中（作为报告基因）。根据gus基因检测所用 的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学 法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检 测法最高），其中最为常用的是组织化学法。
GUS组织化学染色
GUS组织化学染色GUS组织化学染色GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
2．实验材料1）转基因烟草叶片或试管苗2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）3．药品试剂1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100L，保存于-20℃。
2) 底物溶液（染色液）：3) 1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM EDTA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-100 4．实验器材小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器5．实验步骤1) 将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2) 37℃培养箱中温育1小时至过夜；3) 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。
6．结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。
先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+***** X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML Gus staining1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassiumphosphate buffer (pH7.0) for 3 times.GUS组织化学染色2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g ---200mlKH2PO4: 27.2g----200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4---- 300ml 1M potassium phosphate buffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide82mg0.5mMPotassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use.Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2GUS组织化学染色共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*）0.2 mol/L Na3PO4缓冲液(62 mL 0.2 mol/L Na2HPO4;38 mL 0.2 mol/L NaH2PO4)，pH 7.0；0.1 mol/L K3［Fe(CN)6］;0.1 mol/L K4［Fe(CN)6］.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc.1000mlx-gluc 1000mg （20ml dmso）Na2HPO4: 620*0.2*M=0.620*0.2*358（12H2O）=44NaH2PO4: 380*0.2*M=0.358*0.2*156（2H2O）=11K3［Fe(CN)6:1000*0.01*M=329．26*0.01=3.3K4［Fe(CN)6]:1000*0.01*M=422．39（3H2O）*0.01=4.2Triton 1MLNa2EPTA:1000*0.1*M=372.24(2H2O)=371. 取 5 mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide)溶於100 l DMSO於中.2. 加入10 ml reaction buffer (10 mM Na2EDTA, 100 mM NaH2PO4H2O, 0.1% Triton, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, pH 7.0).3. 混合均匀后分装於eppendorf tube中,保存於-20℃冰箱内.100ml x-gluc染液配制x-gluc 50mg加入溶入1ml dmso1ml triton 100Na2EDTA (20mM) 10mM 5ml ; K3Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml K4Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml ; Na2HPO4 (0.2M) 100mM 3.1ml。
拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化
拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【摘要】PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应.试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株.获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS 标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况.%PDF1.2 gene plays an important role in plant defense systems,the plant defensins encoded by PDF1.2 gene participates in plant defensive response against to adversity stress such as fungal invasion,viral infection and adverse environment conditions.The promoter of PDF1.2 gene that amplified and cloned by PCR from Arabidopsis was used to construct the expression vector of GUS reporter gene in this experiment,then the expression reporter gene was transformed into Arabidopsis through agrobacterium tumefaciens transformation method and the transformed plants was obtained by screening.The main results were showed as follows:1.The promoter of Arabidopsis PDF1.2 gene was successfully cloned and fused with the vector carrying GUS report gene to obtain a recombinant fusion vector;2.The reconstructive vector wastransferred into Arabidopsis thaliana and the transgenic plants were screened successfully;3.The expression of the promoter of PDF1.2 gene in transgenic plants was detected by GUS staining.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2018(032)002【总页数】4页(P131-134)【关键词】载体构建;PDF1.2基因;克隆;转化【作者】刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q785PDF1.2基因是一个广泛存在于植物中与抗逆相关的基因［1～4］。
【实验】β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS) 组织化学染色检测转基因植物
材料呈白色。 4．肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为
GUS表达位点。 5．组织可在70%乙醇中保存数日。
整理课件
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用GUS进行这些实验有如下优点：1）大多数植物组织中GUS活 性的本底低；2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累； 3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然， 也存在一些缺点：1）虽然非致死检测的研究取得了一些进展，但 这一检测对于活体组织仍然不太合适；2）由于酶和产物非常稳定， 因而不能真实地反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；3） 在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象， 但是这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾 或者二者都加来使这种渗减至最少；4）同所有的组织化学方法
3．X-gluc母液：称取10mg X-gluc，溶于100μl的N，N-二甲基甲酰胺 （DMF，C3H7NO），得到80㎎/ ml 的 X-gluc母液，-20℃保存。
4．X-gluc反应液：取6.5μl X-gluc母液于500μl buffer中 5．70% 乙醇
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实验步骤
1．将阴性对照材料和转GUS基因或带有可表达的GUS基 因的烟草叶片切成小块，浸入盛有100μl染色液的 0.5ml的离心管中。
1．50mmol/l 磷酸钠缓冲液 A液：称NaH2PO4.2H2O 3.12g，定容100 ml 水中。 B液：称 Na2HPO4.12 H2O 7.17g，定容100 ml 水中。 取39 ml A液、61ml B液混匀
2．缓冲液：50mmol/l 磷酸钠缓冲液中含有0.1 mmol/l K3[Fe(CN)6]、 0.1 mmol/l K4[Fe(CN)6].3H2O、1mmol/L EDTA
实验农杆菌转化烟草和拟南芥
操作要点
侵染烟草叶片无菌操作注意事项 抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验 新鲜的叶片转化效率高 侵染前去除拟南芥已开花和果荚 侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长 侵染后共培养一般为暗培养，1~2d，使农杆菌繁殖迅速，提高转化效率。
实验报告
实验目的 实验原理（简略写） 实验方法 实验结果及分析（最重要） 思考题（最后一次课给）
Silwet L-77
拟南芥、油菜等转化必须试剂之一，原产地为美国GE公司， Silwet-L77高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水 的表面张力为72.4mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有机硅溶液的表面张 力约为21mN/m),这使Silwet-L77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类 的叶面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面.同时，SilwetL77有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet-L77是拟南芥 及其它作物常用的转基因用表面活性剂。
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。 插入位点特点： T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点 T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对 植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复 等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
植物瞬时表达系统
当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表达 （transientexpression）和稳定表达（stable expression）两种。
在瞬时表达状态的基因转移中，引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体 DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达， 并持续约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中，导入宿主细胞的DNA 整合到细胞染色体DNA上，以永久形式存在，并可传给后代，形成稳定的转 化细胞。
拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析
拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，广泛用于研究植物的生长发育和胁迫响应机制。
拟南芥rd29A启动子是一个重要的胁迫响应启动子，在胁迫条件下可以激活rd29A基因的转录，进而产生rd29A蛋白来应对植物的胁迫。
为了研究rd29A启动子在不同胁迫下的响应情况，我们进行了GUS活性分析。
GUS活性分析是通过测量GUS基因编码的β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性来反映启动子的转录水平。
本文将详细介绍我们的实验设计和结果分析。
我们构建了一个含有rd29A启动子和GUS基因的表达载体。
然后，将该载体转化到拟南芥中，得到转基因植株。
接下来，我们将转基因植株经过不同的胁迫处理，包括高盐、干旱、低温和激素处理。
在高盐胁迫下，我们观察到rd29A启动子的GUS活性显著增加。
这表明rd29A启动子在高盐条件下能够被激活，从而产生更多的rd29A蛋白来应对盐胁迫。
我们进行了激素处理实验，包括ABA（脱落酸）和SA（水杨酸）。
结果显示，rd29A 启动子在ABA和SA处理下的GUS活性均显著增加，说明rd29A在激素信号通路中的调控作用。
我们通过GUS活性分析研究了拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下的响应情况。
实验结果表明，rd29A启动子在高盐、干旱、低温和激素处理下均能被激活，从而进一步证实了该启动子在植物胁迫响应中的重要性。
这为进一步探究rd29A启动子的调控机制和应对胁迫的分子机制提供了重要线索。
2019年电大《细胞生物学》作业题目及答案
1、属于脂溶性信号分子的是（）。
.乙酰胆碱.神经生长因子.表皮生长因子.甲状腺素2、不属于细胞信号分子的共同特点的是（）。
.特异性.水溶性.高效性.可被灭活3、帮助变性或错误折叠的蛋白质重新折叠，形成正确的分子构象的物质是（）。
.热激蛋白.蛋白异构酶.拓扑异构酶.泛素连接酶4、线粒体膜间隙的标志酶是（）。
.单胺氧化酶.腺苷酸激酶.苹果酸脱氢酶.细胞色素氧化酶5、下列关于生物膜结构的叙述，错误的是（）。
.生物膜具有封闭性.蛋白质分子以不同的方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，具有不对称性.生物膜在三维空间上可出现弯曲、折叠、但不能延伸.生物膜可以看成是蛋白质在双层脂分子中的二维溶液，具有流动性6、3. 下列生物中细胞膜不饱和脂肪酸含量最高的是（）。
.非洲原住民.温泉中的生物.沙漠中的仙人掌.南极洲的鱼7、引导细胞质基质中合成蛋白质进入叶绿体的N端氨基酸序列称为（）。
. A. 导肽.靶向序列.转运肽.信号肽8、适合于显微操作的显微镜是（）。
. B. 激光扫描共焦显微镜.微分干涉显微镜.荧光显微镜.相差显微镜9、关于叶绿体ATP合酶的叙述，错误的是（）。
.各亚基基因都为核基因.为质子泵.位于类囊体膜上.利用质子流作为合成ATP的动力10、下列关于细胞共性的描述，不正确的是（）。
.组成细胞的基本元素相同.细胞以一分为二方式增殖.原核细胞和真核细胞有细胞膜，古核细胞没有.细胞内都是以核糖体作为蛋白质翻译的机器11、未经染色的标本适合用（）显微镜观察。
.相差.透射电子.荧光.扫描电子12、对细胞学说提出未作出直接贡献的学者是（）。
. D. 胡克. E. 施旺.施莱登.魏尔肖13、组蛋白的复制在（）。
.G1期 . G2期. S 期.M 期14、既能执行被动运输，又能执行主动运输的膜转运蛋白是（ ）。
. 载体蛋白. 水孔蛋白. 通道蛋白 .孔蛋白15、下列细胞膜上具有脂筏结构的生物是（ ）。
. 仙人掌 . 大肠杆菌. 蛇.玉米16、下列关于细胞凋亡的叙述，错误的是（ ）。
拟南芥侧根——精选推荐
拟南芥侧根的形成和生长受细胞分裂素代谢和信号基因的调控摘要植物根系吸收水分和养分和植物在土壤中的锚定是十分重要的。
横向根(LRs) 在根系统中相当重要。
他们胚胎后期的形成是受激素和环境因素的调控。
拟南芥中细胞分裂素在不同层面上通过干扰细胞分裂和模式形成来影响侧根的形成和生长。
这包括抑制中柱鞘细胞第一分裂和抑制幼小侧根的分支。
突变体分析揭示了细胞分裂素的合成基因IPT3和IPT5和所有的三个细胞分裂素受体基因(AHK3 AHK2,,CRE1 / AHK4)在侧根萌生中是多余的（无用的）。
AHK3 AHK2的突变增加了侧根形成中对生长素的敏感性，证实了生长素、细胞分裂素在侧根形成中的功能相关性。
相反,细胞分裂素受体突变体在侧根生长中对其他激素的应答类似于野生型,它是符合独立应答通路的。
一个显著的例外就是ahk2 ahk3突变体在侧根伸长中对油菜素内酯很敏感，表明细胞分裂素和油菜素内酯的拮抗作用。
调控侧根形成中多级丰余的细胞分裂素系统反映出它在调控环境因素中的作用。
介绍双子叶开花植物的根系统包括主根和侧根(LRs)。
侧根在根系统发展中起到相当大的作用，在锚定植物和摄取微量和大量元素过程中的作用更加大。
与起源于胚胎的主根不同，侧根的形成贯穿于植物的一生。
他们是由毗邻木质部顶端的中柱鞘细胞形成,称为拟南芥中柱鞘细胞。
这些细胞经历了一个清晰的过程，导向细胞分裂和长大形成一个侧根原基。
LRPs通过细胞分裂和生长,然后通过细胞扩张在老根上显现出来。
一旦出现, 侧根原基就会经历了一个激活过程形成一个功能完整的侧根分生组织来指导侧根的生长。
侧根的生长由植物激素和环境信号同时调控。
大量研究表明,生长素在侧根生长中起着主要的作用。
生长素调节侧根生长的几个阶段,最初是使中柱鞘细胞快速分裂建立起庞大的数量，然后使侧根生成。
据报道，为适应侧根的萌发于侧根原基的生长，在最大值处建立了生长素梯度。
在侧根的萌发中，分生细胞中生长素的积累激活了生长素受体SOLITARY ROOT (SLR)/ INDOLE-3-ACETIC ACID (IAA)14, AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF)7–ARF19, and BODENLOS/IAA12–MONOPTEROS/ARF5，开始细胞分裂，引发器官形成。
拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析
拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析拟南芥rd29A是植物中一个重要的抗逆基因，在植物的逆境胁迫下发挥重要作用。
rd29A启动子是调控rd29A基因表达的重要元件，其活性受到外界环境的影响。
本文旨在利用GUS活性分析方法，研究rd29A启动子在不同胁迫条件下的活性变化，以期深入了解rd29A基因在逆境胁迫下的调控机制。
I. 引言II. 材料与方法1. 实验材料：本实验选取拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为研究对象，使用转基因植物含有rd29A启动子与GUS reporter基因的拟南芥植株作为实验材料。
2. 胁迫处理：将转基因植株分别置于干旱、高温、盐碱和低温胁迫条件下，分别处理12小时、24小时、48小时和72小时。
3. GUS活性检测：采用组织破碎液对植株进行离体植物材料的提取，然后利用GUS活性检测试剂盒进行GUS活性的定量检测。
4. 数据分析：对GUS活性数据进行统计分析，绘制图表展示rd29A启动子在不同胁迫条件下的活性变化趋势。
III. 结果经过胁迫处理后，我们检测到rd29A启动子的GUS活性发生了明显的变化。
在干旱胁迫条件下，rd29A启动子的活性在处理12小时后迅速上升，达到峰值后逐渐下降；在高温胁迫条件下，rd29A启动子的活性也在处理12小时后出现上升，并且持续到处理24小时后才开始下降；在盐碱和低温胁迫条件下，rd29A启动子的活性变化趋势与干旱胁迫条件下类似，但幅度和持续时间有所不同。
IV. 讨论通过本次实验，我们发现rd29A启动子在不同胁迫条件下的活性存在显著的变化，这表明rd29A基因的表达受到外界环境的调控。
在干旱胁迫条件下，rd29A启动子的活性迅速上升，可能是为了增加rd29A基因的表达以应对干旱胁迫；而在高温、盐碱和低温胁迫条件下，rd29A启动子的活性变化也显示出对应的适应性变化，以维持rd29A基因的适当表达水平。
这表明rd29A启动子在调控rd29A基因表达方面起着重要的作用，并且能够对外界环境做出及时响应。
Gus染色试剂配制及使用方法
Gus染⾊试剂配制及使⽤⽅法●产品简介：gus(β-glucuronidase，β-D- 葡萄糖苷酸酶)基因是⽬前常⽤的⼀种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是⼀种⽔解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的⽔解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-gluc.htm' target=_blank>x-gluc）分解为蓝⾊的物质，其检测⽅法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
因为绝⼤多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因⼴泛⽤作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中⼴泛应⽤。
该试剂盒包含GUS染⾊的全部试剂，使⽤⽅便，只需将染⾊液和缓冲液按照⽐例混合即配成GUS染⾊液。
该试剂盒可以配制50ml GUS染⾊液。
●贮存和效期：X-gluc染⾊液-20℃保存；GUS染⾊缓冲液4℃贮存。
⾃开封之⽇起有效期⼀年。
●使⽤说明：⼀. GUS染⾊液配制：X-gluc染⾊液为50×浓缩液，使⽤前⽤GUS染⾊缓冲液稀释50倍即配成GUS染⾊液。
如0.1 ml X-gluc染⾊液加⼊到5 ml GUS 染⾊缓冲液中，即配成5 ml GUS染⾊溶液。
该染⾊溶液最好现⽤现配，短期贮存可以-20℃保存2-3天。
⼆. GUS染⾊步骤：1.将准备好的材料浸泡在GUS染⾊液中，于25-37℃保温1⼩时⾄过夜。
2.叶⽚等绿⾊材料转⼊70%⼄醇中脱⾊2-3次，⾄阴性对照材料呈⽩⾊。
3.⾁眼或显微镜下观察，⽩⾊背景上的蓝⾊⼩点即为GUS表达位点。
注：⽤于染⾊的植物材料的制备⽅法要因涉及的特定组织和器官的不同⽽异。
例如，拟南芥的根、花和叶⽚以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理⽽直接染⾊。
但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染⾊前切成薄⽚（1-3mm）。
当操作⼤的组织和样品时，可以选⽤真空渗⼊法来帮助底物和酶渗⼊细胞。
GUS能与显⾊底物X-gluc 反应，显现蓝⾊，因⽽可以通过组织化学染⾊定性研究GUS的表达⽔平和表达模式。
拟南芥 CWINV1启动子 GUS 表达载体构建及转基因植株的鉴定
拟南芥 CWINV1启动子 GUS 表达载体构建及转基因植株的鉴定程姣;黄弈;任春梅【摘要】CWINV 是编码细胞壁蔗糖转化酶的基因。
为深入探讨 CWINV 基因的表达调控机理，构建了拟南芥 CW-INV1基因启动子的 GUS 融合表达载体并转入拟南芥，获得了转基因植株。
GUS 染色的结果进一步验证了重组表达载体的正确性和实用性。
%CWINV gene encoding the cell wall invertase.CWINV play an important role in plant growth and development, especially blooming,fruit setting,seed formation and other reproductive development period.But its function has not been e-lucidated in detail.In order to further exploring the mechanism of CWINV gene expression and regulation,the plant expres-sion vectors of CWINV1 gene promoter was constructed with GUS fused report genes,and then transformed into Arabidopsis, transgenic plants were obtained.GUS staining results further verifies the correctness and practicability of the recombinant expression vector.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2016(030)003【总页数】4页(P237-240)【关键词】拟南芥;CWINV1;载体构建;GUS 染色【作者】程姣;黄弈;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128; 作物基因工程湖南省重点实验室，长沙 410128【正文语种】中文【中图分类】Q78蔗糖转化酶是一种最常见的酶，存在于酵母、细菌和植物中，在植物中能够不可逆地催化蔗糖的水解反应，生成葡萄糖和果糖，因此，蔗糖转化酶在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用。
转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测
转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测一、实验目的1、掌握基因GUS的表达的检测方法2、了解GUS基因的应用二、实验原理GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。
β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。
由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。
根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。
组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。
将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。
因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。
三、实验材料、试剂拟南芥AK12-pro、GUS工作液四、实验步骤1、取2支1.5ml离心管，各加入0.3ml 1mol/L GUS染色液；2、用镊子夹取转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心管中；3、37℃浸泡过夜。
4、倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色；肉眼下观察染色情况；拍照。
如果有GUS基因表达产物，则出现蓝色。
五、实验结果从上述照片中科一看出，将野生型和转基因型拟南芥用含有底物的缓冲液浸泡，转β-葡糖醛酸酶基因将X-Gluc水解生成蓝色产物，说明组织细胞被转入了GUS基因，并表达出GUS，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性，图中拉瑟比较深，说明Gus活性相对较高。
GUS基因检测实验报告
一、实验原理：1、适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶（GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
二、实验步骤：1、将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加入染色液浸没试材，封好盖子；2、37℃培养箱中温育1小时至过夜；3、将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。
4、观察结果。
三、实验结果：转基因拟南芥野生型拟南芥（上）转基因拟南芥；（下）野生型拟南芥转基因拟南芥（作图上行从左数第一个的放大）四、分析讨论：1、预期结果：转基因植株被染成蓝色，野生型植株不被染色。
实际结果：与预期结果一致，但野生型脱色不完全，有几片叶子的叶绿素未被脱掉。
分析：实验较为成功。
由上图可知，转入的基因在整棵植株都有表达，其中蓝色在叶脉中最深，推测转入的基因在叶脉中表达最多。
在野生型植株中，大部分叶子被乙醇脱去叶绿素而呈现浅黄色。
2、gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。
其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
3、gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。
4、gus基因是一种报告基因，报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。
把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
报告基因是研究基因调控的有力工具，常用于判断试验基因的转化效率以及基因的调控与功能的研究实验中。
不同植物激素诱导拟南芥 SDG8的表达模式
不同植物激素诱导拟南芥 SDG8的表达模式刘玲;金苏;曾文婕;宁凡;阮颖【摘要】与植物激素在植物整个生命周期中起着多重作用类似,基因SDG8对植物生长、发育、代谢、抗性等多个方面也具多效性.对拟南芥Col-0和转pSDG8∷GUS植株分别进行KT、ABA、GA3、IAA、MeJA和MeSA喷洒处理24 h后,用GUS试剂和RT-qPCR研究SDG8基因的表达模式.结果显示,在植物营养生长阶段和使用的激素浓度范围内,这6种激素对SDG8基因的表达调控有4种模式:KT高低浓度都抑制表达;ABA低浓度促进表达,高浓度表达量下降;GA3 低浓度与高浓度促进表达的水平相同;随IAA、MeJA和MeSA浓度增加表达水平提高.这些结果从总体上揭示了植物激素对SDG8的表达趋势的影响,对进一步研究植物激素与SDG8基因相互作用有一定的参考价值.%Plant hormones play multiple roles during the whole life of plant,and SDG8 gene also has pleiotropic effects on plant growth,development,metabolism,resistance and so on,but the crosstalk between plant hormones and SDG8 remains elusive.The expression patterns of SDG8 were investigated by qPCR and GUS assay after the treating of Arabidopsis thali-ana Col-0 and pSDG8∷GUS with KT,ABA,GA3,IAA,JA and SA.The results indicated that there were four SDG8 ex-pression models,lower and higher concentration KT suppressed SDG8 gene expression,lower ABA promoted expression while higher ABA reduced expression,GA3 enhanced expression at the same level under lower and higher concentration,IAA,MeJA and MeSA increased expression with the increment of concentration.These results gave us an overall under-standing the expression trend of plant hormones affected onSDG8,which were worthy for further research on interaction of plant hormones and SDG8 genes.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2015(029)003【总页数】4页(P226-229)【关键词】植物激素;拟南芥;SDG8;表达模式【作者】刘玲;金苏;曾文婕;宁凡;阮颖【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q786;Q946.885表观修饰，如乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、瓜氨酸化、ADP糖基化的调控在参与植物生长、发育和环境应答的过程中起着重要的作用[1～3]。
设计转基因植物实验报告
一、实验目的本研究旨在通过基因工程技术，将目的基因导入植物细胞中，构建转基因植株，并对其表达情况进行检测和分析，以验证目的基因在植物体内的有效表达。
二、实验材料1. 植物材料：拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子。
2. 基因工程工具：质粒载体（pUC19）、目的基因（GUS基因）、限制性内切酶（EcoRI、BamHI）、T4连接酶、DNA标记物、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
3. 实验试剂：LB培养基、YEB培养基、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）、无水乙醇、氯仿、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、NaCl、SDS、Tris-HCl、EDTA、MgCl2、DNA模板制备试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等。
4. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、超净工作台、离心机、恒温培养箱、电泳仪、紫外分光光度计等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆与鉴定（1）设计引物：根据目的基因序列，设计一对引物，分别包含EcoRI和BamHI酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因的DNA模板为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）酶切与连接：将PCR产物进行EcoRI和BamHI双酶切，回收目的基因片段，与线性化的质粒载体连接。
（4）转化大肠杆菌：将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆进行鉴定。
2. 转基因植株的构建（1）农杆菌转化：将鉴定后的重组质粒转化农杆菌EHA105，挑选阳性克隆进行鉴定。
（2）浸染植物组织：将转化后的农杆菌浸染拟南芥种子，培养获得转基因植株。
3. 转基因植株的分子鉴定（1）DNA提取：提取转基因植株的基因组DNA。
（2）PCR扩增：以转基因植株的基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）电泳检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察目的基因片段的扩增情况。
4. 转基因植株的表型鉴定（1）GUS基因表达检测：提取转基因植株的叶片总蛋白，进行GUS活性检测。
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幼苗GUS染色实验
GUS洗液配方：
0.1 M PBS, pH 7.0
10mM EDTA
2mM 亚铁氰化钾potassium ferrocyanide
2mM 六氰合铁酸钾potassium ferricyanide
300mL中加0.254 g亚铁氰化钾，0.198 g六氰合铁酸钾，EDTA 6 mL（10 mM）
GUS染色液(1mM)就是把5 mg X-Glus（5 mg加100µL DMSO助溶，X-Glus用前离心3min）加到5 mL洗液里即成染色液。
一次配5 mL染色液，1.5 mL离心管每管分装200 µL，锡纸包住-20℃保存。
步骤：
一般5d幼苗可进行试验，早上做以方便白天随时观察幼苗着色情况。
1.90%丙酮固定20min；
(丙酮(acetone)渗透力很强，能使蛋白质沉淀凝固，但不影响蛋白质的功能基团而保存酶的活性，用于固定磷酸酶和氧化酶效果较好，因此可用于GUS染色前的固定，可防止GUS信号的扩散。
缺点是固定快、渗透力强，易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。
一般4℃下20分钟为宜)
2. 加1 mL GUS洗液洗去丙酮，洗2遍；
3. 加GUS染色液，冰上抽真空15-20 min；
4. 37℃放置，隔一阵观察一下，染上色了就进行下面步骤；
5. 吸出染色液，加入1 mL 70%乙醇，停止染色反应及脱色；
6. 更换几次乙醇直到脱色完全；
7. 解剖镜及显微镜拍照观察
载玻片上加适量HCG透明液，用镊子取出幼苗在透明液中铺平，盖上盖玻片，解剖镜观察整株，显微镜观察细节并拍照。
实验原理：
GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，相当稳定而不易降解。
根据GUS基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高）。
其中最为常用的是组织化学法。
组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。
若组织细胞发生了解gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。
这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。
因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。