肝糖原的提取、鉴定与定量实验实验报告

生物化学实验报告

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实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验

实验日期实验地点

合作者指导老师

评分教师签名批改日期

一、实验目的

1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。

4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。

5．正确掌握溶液转移的操作。

6．正确操作使用分光光度计。

二、实验原理

1、肝糖原的提取与鉴定

糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。

糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中, 依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。

2、肝糖原定量测定

糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先臵于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。

三、材料与方法：以流程图示意

1、材料

(1)样品:鸡肝(2)试剂:95%乙醇、5%(W/V)三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L(50%)NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L(30%)KOH溶液、标准葡萄糖液(50mg/L)、蒽酮显色剂(3)仪器和器材:普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管(2ml、5ml)、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板

2、操作方法

（1）肝糖原提取与鉴定

鸡肝约1.5 g，剪碎

COOH 1 ml

＋5%CCl

3

研磨至乳状

COOH 3 ml

＋5%CCl

3

研磨成肝匀浆

全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min）

沉淀（弃去）上清（取约3 ml）

＋3ml （等量）95%乙醇，混匀，静置10分钟

离心5分钟（4000 r / min）

上清（弃去）沉淀

＋蒸镏水1 ml

沸水浴2分钟，溶解沉淀

白瓷板孔穴中糖原溶液1ml

＋浓HCl 250μl

加碘试剂2滴加碘试剂2滴沸水浴15分钟，冷却

糖原溶液2滴

呈色对比糖原水解液2滴糖原水解液

＋班氏试剂4滴

混匀

沸水浴2分钟，观察变化

（2）肝糖原定量实验

鸡肝0.15 g

＋30%KOH 1.5ml

沸水浴15分钟

冷却，全部转入100 ml容量瓶中

加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液

糖原的测定

取3支试管，按下表操作。

试剂（ml）空白管标准管样品管

蒸馏水 1.0 ——

标准葡萄糖溶液— 1.0 —

糖原提取液—— 1.0

0.2%蒽酮溶液

2.5 2.5 2.5

混匀，沸水浴10分钟，冷却至室温。在分光光度计620 nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。

四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

结果：

1）肝糖原的提取与鉴定

①第一次离心后,肝匀浆分为2层,上层为上清液,不完全澄清,下层为淡褐色沉淀。

图一：肝匀浆第一次离心后

②加入乙醇混匀并静置后,溶液分层,上层为上清液,下层有白色絮状沉淀。

③第二次离心后,溶液分为2层,上层为上清液,试管底部有少量白色沉淀。

图二：第二次离心后上清液与沉淀

④加入蒸馏水并沸水浴后,白色沉淀溶解。

⑤白瓷板上,糖原溶液加碘后变为红棕色,与碘自身的黄色有明显区别，证明有糖原。

图三：呈色对比结果（左为糖原+碘液，右为碘液）

图四：砖红色沉淀

⑥往糖原水解液中加入班氏试剂后,溶液呈蓝色(班氏试剂本身为蓝色)。沸水浴后,溶液变为砖红色(生成砖红色沉淀)，证明有糖原。

2）肝糖原的定量测定

①往鸡肝中加入KOH并沸水浴后,溶液变为红棕色。

图五：第一次沸水浴后

图六：沸水浴前（从左到右依次为：空白管、标准管、样品管）

图七：沸水浴后（从左到右依次为：空白管、标准管、样品管）

②第二次沸水浴前空白管呈黄色，标准管呈绿色，样品管呈黄色；水浴后，空白管无变化,标准管颜色略变深,样品管由黄色变为深绿色

③测得吸光度如下表

次数/吸光度/管号空白管标准管样品管

100.7200.119

200.7180.122

300.7180.128

平均00.7190.123

肝糖原（g/100g肝组织）=A样品/A标准× 0.05 ×（100/肝组织重）×0.1 × 1.11 代入平均值计算得肝糖原含量为0.633g/100g肝组织

讨论

本次实验结果理想，成功提取并鉴定了鸡肝样品中的肝糖原，并计算出了肝糖原的含量。饱食鸡肝的肝糖原含量为2~3g/100g肝组织，实验测得的肝糖原含量为0.633g/100g肝组织，对比可知实验所用鸡肝为非饱食肝。在做用班氏试剂鉴定糖原水解液时，第一次所做试管内并无明显沉淀，后进行了两次重复实验，其中一管比实验操作中所述的加入