革兰氏染色镜检的操作规程
乳酸菌镜检方法及显微镜使用方法
乳酸菌镜检方法及显微镜使用方法本页仅作为文档页封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March乳酸菌精简方法及显微镜使用方法第一部分：乳酸菌镜检可以采用革兰氏染色方法。
第二部分：使用显微镜的油镜进行镜检，下面是具体的染色方法和镜检方法，请参考。
第一部分：乳酸菌革兰氏染色方法1目的在乳酸菌发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的乳酸菌悬液或乳酸菌样品进行检测，观察乳酸菌乳酸菌在显微镜下的形态。
2原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
3 实验用品准备：灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器4 操作：1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
细菌室操作规程
痰液培养1、痰涂片，根据需要分别做革兰氏染，抗酸染色等。
2、将痰加入盛有15-20ml灭菌生理盐水的试管中，剧烈振荡5-10秒，然用接种环将沉淀于管底的脓痰小片沾出，再放入另一试管内，以同样的方法反复二次，最后剩余的脓痰接种在培养基上。
3、对可疑病原菌，应做涂片镜检，鉴定及药物敏感试验。
4、检出致病菌时，应报告：草绿色链球菌（+～++++）、奈瑟菌（+～++++）、致病菌名称：×××5、未检出致病菌时，应报告：正常菌群。
尿液培养1、用5-25μl加样器，加消毒后的无菌吸咀，吸尿液5μl滴注在血平板上，用接种环涂抹，待表面干燥后，35℃培养过夜，计数生长菌落数，结果乘以200，求出每ml的细菌总数(cfu/ml)。
2、对革兰氏阴性杆菌菌落计数小于105 cfu/ml，革兰氏阳性球菌计数小于104 cfu/ml，结果报告：细菌培养阴性。
3、对革兰氏阴性杆菌菌落计数大于105cfu/ml,革兰氏阳性球菌计数大于104 cfu/ml有诊断意义,,应对细菌进行鉴定及药敏试验。
血液及骨髓培养1、无菌操作静脉取血5ml，0.5ml注入L型培养管，混匀后置烛缸内孵育；剩余血液注入普通培养瓶，置35℃温箱孵育。
2、血培养瓶和培养管经48小时35℃孵育后，在血平板或巧克力平板上盲目传种一次。
3、盲目传种后，培养瓶和培养管继续孵育至7天每日早晨取出检查有无生长，并摇匀培养液继续孵育。
4、肉眼见有细菌生长时应取生长物移种血平板，巧克力平板进行分离以获得纯培养，同时取生长物做革兰氏染色，将革兰氏染色结果，电话通知临床医师。
标本经平板分离纯培养后，做鉴定和药敏试验。
正式报告细菌名称和药敏结果。
粪便标本培养1、按需要进行涂片，做不同的镜检和染色2、接种SS平板及麦康凯或伊红美兰平板，3、未发现沙门菌或志贺菌的可疑菌落，可报告：未检出志贺菌和沙门氏菌。
4、对疑似该两种细菌的菌落且同志贺菌诊断血清之一发生明显凝集者，可报告：“检出XX志贺菌”并报出药敏结果；与沙门菌多价群因子诊断血清发生明显凝集者可报告：“检出XX群沙门菌”并报出药敏结果。
(完整)细菌革兰氏染色作业指导书
革兰氏染色一、目的更好的观察细菌形态，并可按染色反应加以分类鉴别.二、原理1、化学学说:碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内的核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合，此结合物不易被95%乙醇脱掉，呈革兰氏染色阳性。
因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被乙醇脱色，而呈革兰氏染色阴性。
2、等电点学说:革兰氏阳性菌的等电点在PH2-3，比阴性菌（PH4—5）更低。
加之碘为弱氧化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，使两类菌的等电点差异扩大.因此，阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。
3、渗透性学说:阳性菌含粘肽多、糖多,酒精使其脱水而致细胞壁间隙缩小,通透性降低，在菌体内保留了染料—碘复合物，故呈紫色。
阴性菌胞壁含粘肽少，通透性不受影响，菌体内染料—碘复合物较易透出，失去紫色,被复染成为红色。
三、标本痰涂片、分泌物涂片、细菌涂片等。
四、染液第一液：结晶紫乙醇饱和液(2g结晶紫溶于95％乙醇20ml内）+10g/l草酸铵水溶液80ml混匀。
第二液:碘1g，碘化钾2g,加少许蒸馏水，充分振摇，溶解后加蒸馏水至300ml。
第三液：95％乙醇或乙醇、丙酮(7：3）混合液。
第四液：稀释碳酸复红或沙黄溶液（2。
5％沙黄乙醇液10ml加蒸馏水90ml 混匀)（碱性复红8g溶于95%酒精100ml中制成饱和液,取10ml加入5％碳酸水溶液90ml混匀)用时用蒸馏水稀释10倍即可。
五、质量控制措施每周做一次革兰氏阴、阳性质控菌株染色对照（金葡菌、大肠杆菌）.六、操作步骤1、已固定的细菌(或其它）涂片,滴加第一液染1分钟水洗。
2、冲去残水滴加第二液，媒染1分钟，水洗。
3、去残水,用95％酒精脱色，至无明显紫色液渗出为止，水洗。
4、用第四液复染10-30秒钟，水洗，干后镜检。
七、结果可报区间革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
八、实验室解释1、染色关键在于涂片和脱色，故涂片要厚薄适宜。
脱色时若涂片上有水分，则脱色力强，易形成假阴性。
革兰氏染色实验注意事项
革兰氏染色实验注意事项1.实验前准备：-准备好所需的试剂和设备，包括水洗瓶、稀释盘、热源、革兰染色各液、镜片、显微镜等。
-检查试剂的保存期限，确保试剂的有效性。
-按要求进行无菌操作，保证实验环境的清洁。
2.样品处理：-选择新鲜细菌培养物作为样品，确保细菌的新鲜度。
-为了避免脏染色，应在菌培养基上挑选单纯菌落。
-对于液体培养物，可以通过离心法将菌细胞沉淀下来，然后进行革兰氏染色。
3.实验步骤：-充分清洗玻璃片，以免杂质对实验结果产生干扰。
-均匀涂取菌液于干燥的玻璃片上，切勿用手触摸菌液，以免污染样品。
-确保菌液均匀涂满玻璃片，避免过多或过少，以防染色效果不理想。
-染色时间要控制好，过长或过短都会导致结果错误，通常为30秒至1分钟不等。
-染色液要均匀地覆盖于菌液上，并避免气泡的产生。
-完成染色后，将玻璃片轻轻漂洗，去除多余染色液。
4.镜检操作：-将染色后的玻璃片置于显微镜载物架上进行观察。
-根据细菌形态、染色性质以及结构特征进行初步鉴定。
-鉴定时要注意放大倍数的选择，以保证观察到细菌的细节。
-观察时要仔细观察细菌的形态、大小、排列方式等信息，并进行记录。
5.清洁工作：-实验结束后，应及时清洗试管、显微镜载架、显微镜物镜等设备，防止细菌的交叉污染。
-废液和废弃物应按规定处理，避免对环境和人员健康造成危害。
6.安全操作：-在进行实验时，应遵守实验室的安全操作规程，佩戴好个人防护用品，如实验服、手套和护目镜等。
-对于有毒性或刺激性的试剂，应注意避免直接接触。
-实验中注意火源和电源的使用安全，防止发生火灾或电击事故。
总之，进行革兰氏染色实验时，除了掌握正确的操作步骤外，还要注意实验前的准备和实验过程中的清洁工作，确保实验结果准确无误，并保证实验过程的安全进行。
革兰氏染色及镜检sop
革兰氏染色及镜检SOP1. 目的规范革兰氏染色及镜检的标准操作规程，确保试验的准确性。
2. 范围本标准适用于革兰氏染色及镜检的操作。
3. 定义3.1.革兰氏阳性菌（G+）：G+的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成。
在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。
3.2.革兰氏阴性菌（G-）：G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高。
当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
4. 职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。
4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。
4.3.质量总监负责本规程的批准。
4.4.QA负责本规程执行的监督。
5.引用标准无6. 材料6.1.仪器、实验用具：显微镜、载玻片、酒精灯、接种环。
6.2.试剂与配制革兰氏染色液、95%乙醇、香柏油、二甲苯和0.9%氯化钠溶液。
结晶紫溶液：称量2g结晶紫于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入100ml烧杯中，量取95%乙醇20ml 将其溶解；草酸铵溶液：称量0.8g草酸铵于200ml烧杯中，量取80ml纯化水将其溶解；结晶紫染色液：将配好的结晶紫溶液倒入草酸铵溶液中，混匀，静置24h后过滤即成结晶紫染色液；此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。
碘化钾溶液：称量2gKI粉末，转移至200ml烧杯中，量取100ml的纯化水将其充分溶解；碘溶液：称量1g碘颗粒于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入500ml烧杯中，量取200ml纯化水倒入并碘染液：将配好的碘化钾溶液倒入碘溶液中，混匀即成。
配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。
沙黄溶液：称量0.25g沙黄于200ml烧杯中，量取95%乙醇10ml将其溶解；沙皇（番红）复染液：待沙黄溶液完全溶解后加纯化水定容至100ml，混匀即成。
革兰氏染色操作规程
革兰氏染色操作规程革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
1.原理该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色2.步骤（1）涂片：在一片干净的载玻片，滴上一滴蒸馏水。
用接种环挑取可疑菌落，均匀的涂在载玻片上。
（2）晾干：置通风处晾干。
（3）固定：将载玻片在酒精灯火焰上迅速的来回几次。
（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。
（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。
（7）水洗：用水洗去碘液。
（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染5min。
（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。
（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
3.实验完毕后的处理：①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。
b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。
c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。
注意擦镜头时向一个方向擦拭。
②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干。
革兰氏染色法操作规程
革兰氏染色法操作规程编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（革兰氏染色法操作规程）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
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革兰氏染色法操作规程1目的建立革兰氏染色法操作规程，确保革兰氏染色法操作规范化、科学化。
2范围适用于用革兰氏染色法对细菌进行分类和鉴定。
3职责3.1检验员:负责按本规程进行革兰氏染色操作.3。
2 QC主管、质量部经理：负责监督。
4内容4.1仪器与用具酒精灯、洁净的盖玻片、接种环、滴管、生物显微镜.4.2材料4。
2。
1试剂结晶紫、番红、碘化钾、碘、95%乙醇、草酸铵、香柏油。
4。
2.2试液及配制方法4.2。
2。
1 结晶紫染色液：称取结晶紫2g,溶于20ml 95％乙醇中；称取草酸铵0。
8g，溶于80ml水中；将两种溶液混合，静置48h后使用.4.2.2.2碘染色液：称取碘化钾2g，加5～10ml水使充分溶解，加碘1g，待完全溶解后，加水至300ml。
4.2.2.3 番红复染液：称取番红0.25g溶于10ml 95%乙醇中，然后加水100ml。
4。
3操作步骤4。
3.1 样品固片取一干净的载玻片，用接种环挑取一环无菌水于载玻片中,挑取少量菌于生理盐水中涂片或直接滴一滴待检菌在盖玻片中央，自然干燥固定.4。
3.2 初染滴加结晶紫染液于已固定的涂片上，染1min，用水冲洗、甩干。
4。
3。
3 媒染滴加碘染色液，液作用1min，用水冲洗、甩干。
4.3.4 脱色滴加95％乙醇脱色,置白色背景下，侧动盖玻片,直至无紫色脱落为止(约为20—30秒），立即用水冲洗、甩干。
4.3.5 复染滴加番红复染液,染1-2 min，用水冲洗、甩干.4.3.6 镜检置油镜下观察。
革兰氏染色操作规程
革兰氏染色法操作规程预期用途：主要用于细菌标本涂片或菌落涂片的染色。
检验原理：革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。
为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。
现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。
所以染色时的条件要严格控制。
例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。
此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。
所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。
试剂盒组成：试剂盒组成4*100mlR1：结晶紫染液100mlR2：革兰氏碘液100mlR3：盐酸酒精脱色100mlR4:复染液100ml贮存及效期：10℃─30℃贮存，有效期三年。
操作步骤：1）做一薄涂片，干燥后火焰固定。
2）滴加1液，夏天染1分钟，冬天染2分钟，清水冲去染液。
3）滴加2液，作用1—2分钟。
流水洗，并倒掉多余的水分。
4）加3液脱色，不时摇动（约左右摇动10—15次），至无紫色脱落为止，流水冲洗。
5）加4液复燃，10秒内流水冲洗。
革兰氏染色法步骤及注意事项
1. 准备细菌涂片：将待染菌株取一小滴放在玻璃片上，用铅笔头部画成细 线，形成细菌涂片。
2. 固定：将细菌涂片在火焰上反面向上加热，使细菌附着在玻璃片上。 3. 染色： a. 涂上紫晶液：将细菌涂片浸入紫晶液中，静置 1 分钟。 b. 冲
1. 操作环境应保持干净，并采取无菌操作，以避免外界细菌污染。 2. 手套、眼镜和实验室外套是必需的个人防护装备。
3. 严格遵守安全操作规程，如避免将染料接触到皮肤或进入口鼻。
4. 使用优质的试剂和试验器材，以确保结果的准确性。
5. 注意控制染Βιβλιοθήκη 时间和冲洗时间，过长或过短都可能影响染色效果。
6. 在观察细菌涂片时，使用适当的显微镜镜头和光源，以获得清晰的图 像。
洗：用蒸馏水或脱离水轻轻冲洗玻璃片，以去除多余的紫晶液。 c. 酒 精洗涤：滴加酒精洗涤玻璃片，使其被酒精覆盖，持续洗涤 15-30 秒。 d. 再次冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除酒精。 e. 涂上碘液： 滴加碘液覆盖细菌涂片，静置 1 分钟。 f. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃 片，以去除多余的碘液。 g. 酒精洗涤：滴加酒精洗涤玻璃片，使其被 酒精覆盖，持续洗涤 15-30 秒。 h. 再次冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃 片，以去除酒精。 i. 涂上脱色剂：滴加脱色剂覆盖细菌涂片，持续涂覆 15-30 秒。 j. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除脱色剂。 4. 染色：将细菌涂片滴上红色染料（如苏丹三染料）覆盖细菌，静置 1 分 钟。 5. 冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻璃片，以去除多余的染料。 6. 干燥：将细菌涂片放在通风处晾干，或用吹风机低温吹干。 7. 观察：将干燥的细菌涂片放在显微镜下观察，细菌将呈现出紫色或蓝色 的革兰氏阳性颜色，而其他微生物将呈现出红色的革兰氏阴性颜色。 注意事项：
革兰氏染色法的过程及原理
革兰氏染色法的过程及原理一，过程1 ．涂片将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2 ．染色( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。
( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。
( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
二，原理革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
青霉素作用机制干扰细菌细胞壁的合成。
青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。
大肠菌群革兰氏染色具体方法
大肠菌群革兰氏染色具体方法在微生物学领域，大肠菌群的革兰氏染色法是一种常用的方法，它可以帮助我们区分细菌的种类和特性。
具体操作步骤如下：首先，取适量的大肠菌群样品，将其放入95%的乙醇中，然后搅拌均匀，静置10分钟。
这一步的目的是让细菌固定在样本中，便于后续的染色操作。
接下来，从乙醇固定的菌液中取一滴，滴加革兰氏染液。
革兰氏染液是由结晶紫染液和碘溶液混合而成的，它可以将细菌染色，使其在显微镜下更容易观察。
在滴加革兰氏染液后，轻轻搅拌均匀，然后静置1分钟，让染色充分进行。
第三步，用滤纸过滤染液，弃去初滤液，留下次滤液。
这一步的目的是去除多余的染料，以便进行下一步的操作。
在第四步中，取一滴次滤液，滴加95%的乙醇，轻轻混匀后静置10秒钟。
乙醇的作用是脱色，使细菌染色后的颜色更加清晰。
随后，用滤纸过滤，弃去初滤液和次滤液，留下脱色后的细菌悬液。
在第五步中，取一滴脱色后的细菌悬液，滴加番红复染液（稀），轻轻搅拌均匀，静置1分钟。
番红复染液可以使细菌重新着色，同时增强细菌的对比度，便于观察。
第六步，用滤纸过滤，弃去初滤液和次滤液，留下复染后的细菌悬液。
此时，细菌已经完成了革兰氏染色，呈现出鲜明的紫色。
最后，在第七步中，取一滴复染后的细菌悬液，涂抹在载玻片上，然后加盖盖玻片。
这样，我们就得到了一个革兰氏染色后的样本。
最后一步是进行镜检，通过显微镜观察染色后的细菌形态和结构，从而进行进一步的分析和研究。
革兰氏染色法在微生物学领域具有广泛的应用，其主要优点如下：1.染色效果鲜明：革兰氏染色法能使大肠杆菌呈现出鲜明的紫色，便于观察和区分。
2.染色步骤简单：革兰氏染色法的操作步骤相对简单，容易掌握，适用于各种实验条件。
3.染色时间短：整个革兰氏染色过程仅需数分钟，有利于提高实验效率。
4.适用范围广泛：革兰氏染色法不仅适用于大肠杆菌的染色，还可用于其他类型细菌的染色。
革兰氏染色法在微生物学领域的应用主要包括：1.临床检测：革兰氏染色法可用于临床样本中细菌的检测，如痰液、尿液、血液等，有助于临床医生诊断感染性疾病。
革兰氏染色操作规程
1 目的
建立微生物实验室细菌形态和主要构造检验方法，以鉴定菌种。
2 范围
本规程适用于我司革兰氏染色测试实验。
3 职责
质量部微生物实验员负责按此规程进行革兰氏染色测试。
4 染液的配制
4.1 0.5%结晶紫染色液
称取1g结晶紫，放入250ml试剂瓶中，加95%乙醇2ml,溶解后加入200ml蒸馏水摇匀即可。
4.2 革兰氏碘液
分别称取碘 1g和碘化钾2g放入蒸馏水300ml中，溶解摇匀即可。
4.3 脱色剂
95%乙醇
4.4 复染液（番红染液）
称取番红0.25g，加入10ml 95%乙醇内，然后用90ml蒸馏水稀释，摇匀即可。
5 革兰氏染色程序
5.1 涂片
用纱布擦净载玻片，以无菌接种环取一小滴无菌生理盐水，然后用无菌接种环挑取少数菌苔（菌落）或液体培养物（不必加生理盐水），在玻璃片中央涂成一薄膜。
5.2 干燥
涂片后放室温中自然干燥。
5.3 固定
将载玻片迅速通过火焰三次（其目的是杀死细菌），使菌体与载玻片粘附牢固，以及改变对染料的通透性。
5.4 初染
滴加结晶紫染液于已固定的载玻片上，染1min，水洗。
04-细菌的革兰氏染色观察
一、实验目的：
1、学习微生物涂片、染色的操作技 术，掌握细菌单染色法、革兰氏染色的 方法；
2、学习并掌握油镜的原理和使用方 法。
二、原理：
（一）油镜： 显微镜的分辨力是指显 微镜能够辨别两点之间最 小距离的能力。 显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示： 能辨别两点之间最小距离D=λ/（2NA） 式中 λ=光波波长 NA=物镜的数值孔径 物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，显微镜的 分辨力越大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区 别出。 我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55µm。
细胞壁 厚度与强度 肽聚糖数量、含量
脂类含量 磷壁酸（垣酸） 脂多糖、磷脂、脂蛋白
革兰氏阳性菌 (G+)
革兰氏阴性菌 (G-)
厚、致密、坚韧
薄、疏松
多层、含量高、占细胞 干重40—90%
少、占细胞干重1-4%
单层、含量低、占细胞 干重5—10%
多、占细胞干重11-22%
+
-
-
+
磷壁酸 肽聚糖 脂蛋白
2、革兰氏染色：涂片 → 干燥 、固定→ 结晶紫染色2分钟→细水冲洗→碘液媒染1 分钟 →细水冲洗→95%酒精脱色 15秒→ 水 洗 →蕃红溶液复染 1-2分钟 → 水洗 →干 燥→镜检。
染色操作步骤—涂片固定
取菌液一环
涂片
干燥 干燥
滴生理盐水
挑取菌苔一环
涂片
热固定
取菌涂片的无菌操作图解
细水冲洗
此法简便，适用于菌体一般形态的观察，但不能鉴别 细菌，它是染色的基础，可以观察细菌的大小。
（三）革兰氏染色 革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用
至今的经典染色法。 经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两大类。
革兰氏染色试验步骤
×25 （或16 ） ×104×稀释倍数
三、试验器材
1、菌种：红酵母菌（Rhodotorala sP）。
2、试剂：无菌生理盐水。 3、器具：显微镜、血细胞计数板、吹风机、盖
玻片、无菌滴瓶（内装玻璃珠）、无菌毛细管、 擦镜纸、吸水纸等。
四、试验环节
菌悬液制备：以计数室内每小格5-10酵母菌为宜。 清洗计数板：自来水冲洗计数板后用吹风机吹干。
霉菌形态观察措施（直接制片法）
载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液。 从霉菌菌落边沿挑取少许已产孢子旳霉菌菌丝。 置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落旳孢子。 放到载玻片旳染液中，用解剖针将菌丝分散开。 盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。
注意事项
1、镜检时请尤其注意放线菌旳基内菌丝、气生 菌丝旳粗细和色泽差别。 2、染液不宜过多或过少，不然，在盖上盖片时， 染液过多会溢出，过少会出现大量气泡而影响观 察。 3、制片时，用镊子或解剖针小心将菌丝分开， 要尽量保持霉菌自然生长状态和完整性。
试验一 显微镜（油镜）旳使用和细菌 旳三种基本形态观察
一、试验目旳
1、学习并掌握油镜旳基本原理和使用措施。
2、观察和辨认细菌旳三种基本形态。
二、基本原理
1 、增长照明强度
在油镜与载玻片之间加入与玻片旳折射率相仿旳 镜油，使进入物镜旳光线不会由折射或反射造成损失， 基本上全进入镜头，成果提升了照明强度，使图像愈 加清楚。
氏阳性菌。 经典放线菌旳菌丝体分化产生多种形 态特征：
基内丝菌（较细、透明）
菌丝体 气生菌丝（较粗颜色较深）有无气生菌丝
孢子丝（直、波曲、多种螺旋或轮生）等，是分类鉴定旳主要根据 孢子：分生孢子（球形，椭圆，杆状或柱状）、孢囊孢子、游动孢子
革兰氏染色无菌安全要求
革兰氏染色无菌安全要求
革兰氏染色是常用的细菌分离和鉴定的方法，该方法通过染色区分出细菌的不
同形态和性质，然后观察细菌的生长和代谢等特征进行鉴定和分类。
革兰氏染色操作需要注意一些无菌和安全要求，以确保实验结果的准确性和人员的安全。
无菌要求
1.实验室必须保持无菌状态，经常进行清洁和消毒工作。
2.实验室内使用的器材和试剂必须为无菌状态，必要时进行灭菌处理。
3.实验室内必须有无菌操作区，操作人员必须穿戴相关无菌装备，如无
菌手套、帽子、口罩等，并进行手部消毒。
4.操作染色时必须使用无菌培养基，并进行无菌操作。
染色过程中不能
离开培养基，操作过程中尽量减少外界干扰和空气污染。
安全要求
1.严格遵守实验室安全操作规程，正确使用实验室器材和试剂，遵循操
作步骤和安全要求。
2.禁止在实验室内食用、饮水、吸烟等无关活动，保持环境清洁和整洁。
3.操作过程中要保持安全距离，防止溅洒物质伤害到自身或他人。
4.实验室中应配备急救箱等急救设备，以应对紧急情况，一旦发生意外
要及时报告并进行处理。
5.每次操作结束后，必须彻底清洁器材和工作区域，防止交叉污染和细
菌滋生。
总之，革兰氏染色操作需要遵循无菌和安全要求，以确保实验的准确性和人员
的安全。
实验操作人员应认真学习和了解相关知识，并遵循操作步骤和规程。
革兰氏染色法操作规程
革兰氏染色法操作规程一、实验准备1.工作台、培养瓶、试管、移液器等必需设备材料的清洁和消毒。
2.需要的培养基、试剂和染色剂的准备。
3.微生物实验室内的操作区域消毒。
4.需要检测的细菌样本，应是新鲜培养的活菌。
二、实验步骤1.将培养的细菌接种物涂布于平板培养基上，培养时间一般为16小时到24小时，以获得足够数量的活菌。
2.取一到两个细菌菌落，用无菌吸铬钢线将菌落挑取，加入到新鲜制备的无菌蒸馏水中制备细菌悬浮液。
3.将细菌悬浮液分装到无菌试管中，并对其进行标记以便辨别。
4. 将试管放入无菌离心机进行离心处理，离心速度一般为3000rpm，离心时间约为5分钟。
5.取出离心后的试管，将离心液倾倒掉，保留细菌沉淀。
6.用无菌注射器吸取一定量的蒸馏水，在细菌沉淀中做三次洗涤，每次洗涤后进行离心处理。
7.吸尽洗涤液后，用吸水纸吸去残余水分，使细菌沉淀尽量干燥。
8.用火焰消毒的铅笔划定干净试验玻片两侧的带标记区域。
9.取少量细菌沉淀用铅笔将其在试验玻片上涂成条状。
10.将涂有菌液的玻片放置在火焰中加热烘干，将菌液固定在玻片上。
11.将固定好的玻片依次进行以下操作：(1)滴加革兰氏碘液，静置1分钟。
(2)用蒸馏水清洗草绿色的碘液，盖过玻片的边缘。
(3)滴加酒精洗涤剂(80%)，使玻片浸泡在酒精中，30秒内亮紫色的溢出。
(4)用蒸馏水冲洗玻片，直至玻片溢出无色为止。
(5)滴加索式葡萄染料，使玻片完全覆盖，静置30秒。
(6)用蒸馏水冲洗玻片，直至落出少量菌落。
12.用吸水纸将玻片表面水分吸干，然后放置在通风处晾干。
13.晾干后的玻片放到显微镜下，用油镜检测。
14.观察和记录细菌的形态特征，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的结构差异。
三、实验注意事项1.所有的试剂和设备都要经过严格消毒处理，防止外部污染。
2.操作过程中要注意无菌操作，避免细菌受到污染。
3.离心过程中要注意离心机的平衡，以免产生震动。
4.细菌沉淀尽量干燥，以便于后续染色步骤。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目得:建立菌种鉴定标准操作规程范围:适用于**＊***鉴定标准操作职责:内容:1整体操作步骤1、１纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应得培养基上（如TＳA)，划线分离,以出现微生物单菌落为止。
1、2挑取纯化后得单菌落，进行革兰染色、镜检,以确定待鉴定菌得革兰属性.1、3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性,则选用API２0NE试剂条进行鉴定;如发酵实验结果为阳性,则在经过细胞色素氧化酶实验后选用ＡＰI20E试剂条进行鉴定．1、4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定,如实验结果为阳性则选用API Stapｈ试剂条进行鉴定．1、5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞,则选用ＡPI 5０ＣHB试剂条进行鉴定;否则,根据运动性实验与过氧化氢酶实验结果选用AＰＩＣoｒｙne或其她试剂条进行鉴定。
１、6选定正确得试剂条以后,根据不同得ＡＰI试剂条得标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码,用API鉴定软件鉴定或查询待检菌得名称均可。
鉴定结果应记录,必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2、１染色剂得配制2、１、１结晶紫染色液：甲液:结晶紫1、０g９5%得酒精２0ml乙液：草酸铵０、８ｇ水8０mｌ将甲液与乙液混合均匀,静置48h使用,置密闭棕色瓶中储存。
２、1、2碘液：碘1、0g碘化钾2、0ｇ水３00ｍl配制时先用３～5ml水将碘化钾溶解,再加入碘,用力摇匀,使之全部溶解后,再加水稀释至30０ml,摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2、1、3稀石碳酸红溶液：碱性品红1、0g石碳酸5、0ｍl95%乙醇１0、0mｌ配制时用乙醇溶解碱性品红,然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml,摇匀。
2、2操作:２、2、１涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水,用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层.2、2、2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干,并在火焰上通过2~3次，以固定涂片.２、2、３染色:在已固定得标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本,染色1分钟。
革兰氏染色实验报告
一、实验目的1.了解革兰氏染色的原理2.掌握革兰氏染色的操作方法二、实验原理根据细菌的细胞壁结构和成分不同，可用革兰氏法将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
阳性菌由于细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能酒精脱色，仍呈紫色；阴性菌由于肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，乙醇将细胞壁脱色，细胞无色，碱性品红复染后呈红色。
三、实验材料及仪器1.实验材料：枯草芽孢杆菌（或大肠芽孢杆菌）、草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、碱性品红染液、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、废水缸、胶头滴管、酒精灯2.仪器：油镜、接种环四、实验步骤1.涂片：挑一环蒸馏水于载玻片中央，再用接种环挑取少量芽孢杆菌与玻片上的水滴均匀混合，并涂成约1cm^2的薄菌膜；2.固定：将涂片在空气中干燥，手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上快速通过3次，以让菌膜更加牢固地贴在玻片上，待冷却后滴加染料；3.染色：（1）初染：手持玻片一端，滴加草酸铵结晶紫染液染色2min后，倾去结晶紫染液，将玻片倾倒一定角度，用细小的水流小心地冲洗，直到玻片上的水流无色，再用吸水纸小心将水吸干；（2）媒染：滴加碘液染色2min后，按照上述步骤用细小水流小心冲洗；（3）脱色：滴加95%乙醇，将玻片稍微摇晃几下后立即倾去乙醇，如此重复2～3次，立即水洗，再用吸水纸吸干，以终止脱色；（4）复染：滴加碱性品红染色3min，水洗后用吸水纸吸干；（5）镜检：先在4倍、10倍、40倍的低倍镜下分别观察细菌，找到最好的视野，再在载玻片上滴加香柏油，转到100倍的高倍镜，使镜头完全浸在油中，观察细菌，使用完毕后用二甲苯擦洗镜头。
五、实验结果细菌呈现紫色，较分散，个别聚集成链状，为革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌）。
革兰氏染色过程
革兰氏染色过程包括以下几步：
1.取一块无菌载玻片，用无菌的针头或火钳将待检测的细菌接种
于载玻片上。
2.将载玻片放在烘箱中烘干，使细菌附着于载玻片上。
3.用无菌的针头或火钳将烘干后的载玻片在火焰中消毒一下。
4.用滴管滴上革兰染色液，让其覆盖整个载玻片，静置1分钟。
5.用自来水将载玻片洗净，直到水变清。
6.滴上碘酒，静置1分钟。
7.用自来水将载玻片洗净，直到水变清。
8.滴上脱色剂，静置20-30秒钟。
9.用自来水将载玻片洗净，直到水变清。
10.用无菌纸巾轻轻擦干载玻片上的水分。
11.在显微镜下观察载玻片上的细菌。
革兰氏染色的原理是，细菌细胞壁的结构不同，革兰氏阳性菌的细胞壁含有大量的脂肪酸和乙醇胺，容易吸附革兰染色液，并在碘酒作用下形成紫色复合物，脱色剂不能将其去除；而革兰氏阴性菌的细胞壁薄，含有少量脂肪酸和乙醇胺，不易吸附革兰染色液，碘酒作用下形成的复合物可以被脱色剂去除。
因此，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
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革兰氏染色镜检的操作规程
1.目的：鉴定G阳性菌.G阴性菌（球菌、杆菌、真菌）。
指导临床用药。
2.原理：
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gtam所创立的，此方法可将所有的细菌分G+和G-两大类，G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染性的颜色。
3.实验器材：载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
4.试剂：
4.1试剂来源：购买，四川迈克。
4.2试剂合组成:
R1结晶紫1χ10ml R2碳酸钠1χ10 ml
R3碱性碘液 1χ10ml R4丙酮酒精1χ20ml
R5碱性复红1χ10ml
5.标本采集与处理：
5.1阴道,子宫等分泌物应由医生采集,收集于无菌试管内送检。
5.2载玻片的预处理:
5.2.1载玻片用前以９５％乙醇擦拭脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片。
5.2.2在玻片背面一端的1/3处注明编号。
5.3涂片：
5.3.1用棉签可直接在玻片上均匀涂抹.
5.3.2菌液涂片时,用接种环沾取菌液,点在玻片上.
,在盐水中涂布。
6.染色方法:
6.1将标本均匀涂布于玻片上,自然干燥,火焰固定。
6.2冷却后加R1、R2各两滴初染30秒后水洗。
6.3用R3媒染30秒.水洗后用R4脱色至无兰色脱落为止(约有5-10秒),水洗。
5.4用R5复染5秒,水洗,待干,镜检。
7.镜检:
7.1取已干燥的涂片,用低倍镜览片,再用高倍,最后用油镜观察,并在已干燥的涂片滴1-2滴香柏油,仔细观察.
7.2判断菌体的革兰氏染色反应性,呈紫色为G+菌,呈红色为G-.
8.报告方式:
检出革兰氏阳性球菌,革兰氏阳性球菌.
检出革兰氏阴性球菌，革兰氏阴性球菌。
9.实验完后的处理:
9.1显微镜头的处理:用擦镜纸将油镜头的油擦去,再用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次,最后用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次.注意向一个方向擦拭.
9.2废弃标本和污物的处理:
9.2.1染色玻片放入5%84消毒液中浸泡30-60分钟,消毒液要每天更换.
9.2.2废弃标本及污物应弃于有盖的污物桶内,由专人收并送焚烧炉内彻底焚化.
10.注意事项:
10.1涂片应均匀,厚薄适度,自然干燥后再加热固定.
10.2脱色要至无兰色脱落为止.
种染液质量,以免发生误差.
11.临床意义.
11.1鉴别细菌
11.2选择药物
12.参考文献:
全国临床检验操作规程(中华人民共和国卫生部医政司)。