碱性磷酸酶的动力学分析
生物化学实验4.碱性磷酸酶的动力学分析.本科
2、温度对酶促反应速度的影响
双重影响
酶 2.0
最适温度 ：
活
性 1.5
酶促反应速度最快时的
环境温度。
1.0
低温条件下酶不失活，
高温条件下失活，这与pH 0.5 对酶的影响不同:过高或
者过低pH都可导致酶失活。
0 10 20 30 40 50 60
温度 ºC
图2 温度对酶促反应速度的影响
3、底物浓度对反应速度的影响
4、抑制剂对反应速度的影响
1、取试管5只，按照下表加入试剂。
试剂
1
2
3
4
5
10mmol/L底物
0.1
0.2
0.4
0.8
-
溶液
蒸馏水
0.9
0.8
0.6
0.2
1.0
磷酸氢二钠
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
碳酸缓冲液
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
37℃水浴保温5min
酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
各管混匀后，水浴保温15min后取出，立 即加入NaOH溶液1.0mL，终止反应。
最适pH
酶催化活性最 酶 高时反应体系的pH 活 称为酶促反应的最 性
适pH值。
胃蛋白酶
淀粉酶
胆碱酯酶
甘氨酸缓冲液： pH8.0、9.0、10
8 10pH
图1 pH对酶促反应速度的影响
pH影响 (1)酶分子解离状态、 构象; (2)影响底物的解离， 从而影响酶与底物的
结合; (3)极度pH的条件引 起酶蛋白的变性。
0.9
碱性磷酸酶km值测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
碱性磷酸酶活力测定
诊断常用血清酶
血清酶
鸟氨酸氨基甲酰转移酶 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 谷氨酸脱氢酶 山梨醇脱氢酶 丙氨酸氨基转移酶 异柠檬酸脱氢酶
-谷氨酰转肽酶 5ˊ-核苷酸酶 单胺氧化酶 天门冬氨酸氨基转移酶 肌酸激酶 乳酸脱氢酶 碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 淀粉酶 脂肪酶
符号 5ˊ
来源
肝 肝 肝
肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法） • 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底
物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 • 连续监测法： （速率法） • 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量
•
在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、胆碱酯酶（）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶
等。
•
它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功
能试验的一部分。
•
血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
•
在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。
• • 临床上测定活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊断。
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍 ，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。
碱性磷酸酶作用原理
碱性磷酸酶作用原理碱性磷酸酶是一种重要的酶类，在生物体内起着至关重要的作用。
它主要存在于细胞膜、内质网和高尔基体等细胞器中，是一种广泛分布的磷酸酶。
碱性磷酸酶在生物体内具有多种生物学功能，包括参与细胞的信号转导、细胞凋亡、细胞增殖和分化等重要生理过程。
本文将详细介绍碱性磷酸酶的作用原理。
首先，碱性磷酸酶的作用原理主要是通过水解底物的磷酸酯键来发挥其生物学功能。
磷酸酶是一类催化水解磷酸酯键的酶，而碱性磷酸酶则是在碱性条件下能够催化磷酸酯键水解的一类磷酸酶。
其催化作用是通过将底物的磷酸酯键水解成磷酸和相应的醇或酚，从而释放出磷酸根离子和底物的降解产物。
这种催化作用是碱性磷酸酶发挥生物学功能的基础。
其次，碱性磷酸酶的作用原理还涉及到其在细胞信号转导中的作用。
在细胞内，许多信号分子通过磷酸化和去磷酸化来传递信号，而碱性磷酸酶则是参与细胞信号转导的关键酶之一。
通过调控信号分子的磷酸化状态，碱性磷酸酶可以影响细胞内信号通路的传递，从而调节细胞的生理功能。
这种作用原理使得碱性磷酸酶在细胞信号转导中发挥着重要的调节作用。
此外，碱性磷酸酶的作用原理还与细胞凋亡和细胞增殖有关。
在细胞凋亡过程中，碱性磷酸酶可以调节凋亡相关蛋白的磷酸化状态，从而影响细胞凋亡的进行。
而在细胞增殖和分化过程中，碱性磷酸酶也可以调节细胞周期蛋白的磷酸化状态，从而影响细胞的增殖和分化。
这些作用原理使得碱性磷酸酶在细胞生理过程中发挥着重要的调节作用。
综上所述，碱性磷酸酶作用原理主要是通过水解底物的磷酸酯键来发挥其生物学功能，参与细胞的信号转导、细胞凋亡、细胞增殖和分化等重要生理过程。
它在细胞内具有多种生物学功能，对维持细胞内稳态和调节细胞生理功能起着至关重要的作用。
因此，对碱性磷酸酶的作用原理进行深入研究，有助于更好地理解其在细胞生理过程中的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论基础和临床指导。
碱性磷酸酶动力学参数的测定
题目：碱性磷酸酶动力学参数的测定（创新实践活动论文）2015年4月24日·北京不同缓冲液对碱性磷酸酶动力学参数的影响摘要酶促反应动力学主要研究酶催化的反应速率以及影响反应速率的各种因素，为了更好的发挥酶的高效性，就必须准确把握酶促反应的条件。
本文重点研究不同缓冲液所配制的酶液对酶促反应的影响。
实验利用碱性磷酸酶溶解在TRIS，碳酸钠，去离子水等缓冲液中为酶液，磷酸苯二钠为基质，进行实验，得到去离子水为最适缓冲液的结果，表明以去离子水为缓冲液所配制的酶液能使酶发挥最好的效果，具有研究意义。
关键词：碱性磷酸酶；缓冲液；动力学参数；本试验以碱性磷酸酶为催化剂，磷酸苯二钠为底物，在一定温度、pH及酶量的条件下，碱性磷酸酶催化磷酸苯二钠转化为苯酚；利用分光光度计测定在不同底物浓度下苯酚的生成量。
通过实验可以加深对有关酶促反应动力学基本知识的理解和记忆；并熟记利用双倒数法测定酶Km值的原理，熟悉试验方法。
1 实验材料、试剂与仪器1.1 材料与试剂实验中使用的主要试剂有磷酸苯二钠:国药集团化学试剂有限公司分析纯醋酸镁：天津市永大化学试剂开发中心分析纯醋酸：北京化工厂分析纯碱性磷酸酶：北京化工厂分析纯4-氨基安替比林：天津市永大化学试剂有限公司分析纯铁氰化钾：北京化工厂分析纯硼酸：北京化工厂分析纯苯酚：天津市福晨化学试剂厂分析纯三羟甲基氨基甲烷（Tris）：北京化学试剂公司分析纯NaOH：北京化工厂分析纯碳酸钠：天津光复科技发展有限公司分析纯碳酸氢钠：天津市福晨化学试剂厂分析纯实验中使用的主要溶液有（1）0.1 mol/L碳酸盐缓冲溶液（pH=10）：碳酸钠1.5875 g，碳酸氢钠0.84 g，蒸馏水溶解至250 mL。
（2）0.04 mol/L基质溶液：磷酸苯二钠0.436 g（无结晶水），用煮沸冷却的蒸馏水溶解至50 mL，盛于棕色瓶，冰箱内保存。
（3）0.1 mol/L醋酸镁溶液:醋酸镁1.0725 g，蒸馏水溶解至50 mL。
碱性磷酸酶的动力学分析
抑制剂与底物浓度的相对比例，增加底物浓 度可减低或解除抑制作用 动力学变化：Vmax不变、Km值变大
5.酶活性的测定
酶活性：是指酶催化化学反应的能力，衡 量标准是酶促反应速度的大小。 酶促反应的速度（V）：通常用单位时间， 底物的消耗量或产物的生成量来表示，而一 般测定时都是以产物的生成量为准。
特点： （1）V下降，发生抑制 （2）Vmax不变 （3）Km增大，亲和力下降
非竞争性抑制曲线图
抑制剂与酶活性中心以外的必需基团结合,不影响酶与底 物的结合,底物与抑制剂之间没有竞争关系。但酶-底物-抑制 剂复合物不能进一步释放出产物。 特点： （1）V下降，发生抑制 （2）Vmax减小 （3）Km不变
温度对淀粉酶活性的影响
2.pH对酶促反应速度的影响
酶促反应的最适pH pH通过改变酶与底
pH 对某些酶活性的影响
物分子解离状态影 响反应速率 最适pH不是酶的特 征性常数，它受底 物浓度、缓冲液种 类与浓度、及酶纯 度等因素的影响。
3.底物浓度对酶促反应速度的影响
当底物浓度较低 时,V随[S]的增大而 急剧上升,两者成正 比关系。 随着底物浓度继续 增加,反应速度增加, 而幅度不断下降。 若继续加大[S]，反 应速度就不再增加, 达到一个极限值 Vmax。
H3C-N
H3C-C
C=O C-NH2
+
OH
K3Fe(CN)6
OH-
N
H3C-N
H3C-C
C=O C-N=
O
4-氨基安替比林
醌衍生物
醌衍生物为红色,根据红色深浅测出光密度值,计算不同 底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）。
Lambert-Beer定律：
酶促反应动力学实验
A、B 、 管加好 后，置 于水浴 锅中预 温5min
预温后 将A、 、 B管混合 管混合 并开始 计时， 计时， 准 确反应 13min
显色 向每个试 管 中各加入 2ml
0.03175g /L碘液， 碘液， 碘液 观 察现象
（一） 操 实验器材 作 方 法
冰箱 试管架 管
恒温水浴锅 移液枪及枪头 胶头滴管 吸量管架
试管 吸量 烧杯
（一） 操 实验试剂 作 方 法
PH6.8的缓冲液 PH6.8的缓冲液 0．03175g/L碘液 03175g/L碘液
Na0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液 0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液 淀粉的0.5%
实验步骤
一、制管
管号 PH6.8的 缓冲液 （ml） A 含NaCl的 0.5%淀粉 液（ml） 稀释100 倍的唾液 （ml） 1（0℃） 2（室温） 3（37℃） 4（50℃） 5（70℃） 6（室温） 2 2 2 2 2 2 用2ml的 蒸馏水代 替
2
2
2
2
2
B
1
1
1
1
1
1
实验步骤
预温 混合反应并计时
酶促反应动力学实验
1 底物浓度对酶活性的影响 ——碱性磷酸酶Km值的测定 碱性磷酸酶Km ——碱性磷酸酶Km值的测定
酶促反应动力学实验
2.1 温度对酶活性的影响
实验原理
每种酶都有其最适温度， 每种酶都有其最适温度， 高于或低于此温度酶的活性都 降低。一般而言， 降低。一般而言，若酶处于过 高的温度环境中， 高的温度环境中，会使酶活性 永久丧失； 永久丧失；而若处于极低温度 的环境中只会使酶活性受到抑 一旦温度适宜， 制，一旦温度适宜，酶又会全 部或部分的恢复其活性。 部或部分的恢复其活性。
碱性磷酸酶实验报告
实验日期：2023年10月25日实验地点：生化实验室实验目的：1. 了解碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化原理和方法。
2. 掌握碱性磷酸酶活性测定的原理和方法。
3. 通过实验验证碱性磷酸酶的动力学特性，计算其米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种非特异性磷酸单酯酶，主要存在于动物和微生物体内，具有磷酸基团转移活性。
在碱性条件下，AKP能水解多种磷酸单酯化合物，生成相应的醇和磷酸盐。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP，并通过比色法测定其活性。
实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 丙酮3. 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）4. 磷酸苯二钠5. 4-氨基安替比林6. 铁氰化钾7. 移液管、移液枪、试管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计实验步骤：1. 碱性磷酸酶提取：- 将兔肝匀浆液与丙酮以体积比1:1混合，室温下静置过夜。
- 4,000 rpm离心10分钟，弃去上清液。
- 将沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解，得到碱性磷酸酶粗提液。
2. 碱性磷酸酶活性测定：- 取6支试管，分别加入0.02 mol/L磷酸苯二钠溶液、0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）、4-氨基安替比林溶液和铁氰化钾溶液。
- 在上述溶液中加入不同浓度的碱性磷酸酶粗提液，混匀后置于恒温水浴箱中反应10分钟。
- 在510 nm波长下测定吸光度，以酶活力单位（U）表示。
3. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）计算：- 以酶活力单位（U）为纵坐标，底物浓度（mol/L）为横坐标，绘制酶活力曲线。
- 利用双倒数法（Lineweaver-Burk plot）计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验结果：1. 碱性磷酸酶活性曲线：- 随着底物浓度的增加，酶活力逐渐增加，但在一定浓度后趋于稳定。
2. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）：- 米氏常数（Km）为0.05 mol/L，最大反应速度（Vmax）为150 U/min。
碱性磷酸酶生化实验报告
一、实验目的1. 熟悉碱性磷酸酶（ALP）的生化特性；2. 掌握ALP的分离纯化方法；3. 学习ALP比活性测定和动力学分析；4. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理碱性磷酸酶（ALP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有磷酸基团转移活性，在碱性条件下能水解多种磷酸单酯化合物。
ALP在生物体内具有重要的生理功能，如参与骨骼生长发育、肝脏解毒、钙磷代谢等过程。
本实验旨在通过分离纯化ALP，测定其比活性和动力学参数，为进一步研究ALP的生物学功能提供实验基础。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：兔肝匀浆液、正丁醇、丙酮、乙醇、NaCl、MgCl2、MnCl2、磷酸苯二钠、4-氨基安替比林、铁氰化钾、pH缓冲液等。
2. 实验仪器：恒温水浴箱、离心机、分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验方法1. ALP的分离纯化（1）将兔肝匀浆液与等体积的正丁醇混合，充分振荡，静置，取上层滤液。
（2）向滤液中加入1/10体积的MgCl2、MnCl2溶液，混匀。
（3）加入等体积的丙酮或乙醇，静置，离心（3000r/min，10min），取沉淀。
（4）沉淀用少量pH7.0的磷酸缓冲液溶解，再次离心，取上清液。
2. ALP比活性测定采用磷酸苯二钠为底物，在pH10的碳酸缓冲液中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸盐。
苯酚与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌类衍生物，通过测定吸光度变化计算ALP的比活性。
3. ALP动力学分析采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，测定不同底物浓度下的酶活性，计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
五、实验结果1. ALP的分离纯化通过有机溶剂沉淀法，从兔肝匀浆液中成功提取纯化ALP。
SDS-PAGE结果显示，纯化后的ALP蛋白呈单一条带。
2. ALP比活性测定通过测定不同底物浓度下的酶活性，计算出ALP的比活性为1.5U/mg。
3. ALP动力学分析采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算出ALP的米氏常数（Km）为0.01mmol/L，最大反应速度（Vmax）为200U/min。
碱性磷酸酶
碱性磷酸的提取分离纯化及其性质的研究李小旭，赵彦彦，周晓倩，张林顺，伍红，林亚秋摘要：从新鲜兔肝中提取碱性磷酸酶，进行分离纯化得到纯度较好的碱性磷酸酶，然后测定其km，对最适温度及其热稳定性、最适pH及酸碱温度性的研究，最后用KH2PO4进行抑制剂类型鉴别。
关键词：温度、pH、酶、Km、抑制剂前言：酶是具有生物催化功能的大分子，在一定的条件下，酶可催化各种生化反应。
酶的催化作用具有催化效率高，专一性强和作用条件温和等显著特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、环保、能源和生物工程等领域应用广泛。
应用之前要先对酶的性质等进行研究，进行酶活力测定，研究抑制剂对酶活性的影响等等。
在抑制剂的的作用下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能。
抑制剂有可逆抑制剂和不可逆抑制剂之分。
不可逆抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难以除去，酶活性不能恢复。
可逆抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。
根据可逆抑制剂作用的机制不同，酶的可逆抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。
酶活力测定的方法多种多样，有化学测定法、光学测定法、气体测定法等。
对酶活力测定的要求是快速、简便、准确。
酶活力测定通常包括连个阶段，首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。
而酶的活力高低，是以酶的单位数来表示的。
1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定，在特定条件下（温度可采用25℃，PH等条件均采用最适条件），每1min催化0.001mol的底物转化为产物的酶量定义为一个酶活力单位，这个称为国际单位。
由于这个规定没有法律效力所以在现实使用的酶活力单位多种多样。
国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（kat）。
在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）。
1 材料与方法1.1材料1.11碱性磷酸酶的分离纯化实验本实验使用的原料是新鲜兔肝，仪器有：离心机、搏力匀浆器等，试剂有：（1）0.5mol/L醋酸镁溶液（107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml）、（2）0.1mol/L醋酸钠溶液（8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml）、（3）0.01mol/L 醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液（准确吸取20ml 0.5mol/L醋酸镁溶液及100ml 0.14mol/L醋酸钠溶液，混匀后定容至1000ml、（4）Tris-HCl pH8.8缓冲液（称取三羟甲基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/L Trls溶液。
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg••pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm 处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
酶促反应动力学实验
酶动力学综合实验实验(一)一一碱性磷酸酶值的测定【目的要求】1.了解底物浓度对酶促反响速度的影响2.了解米氏方程、值的物理意义及双倒数作图求值的方法。
【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其屮以肝脏为最多。
其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。
但它不是单一的酶，而是一组同功酶。
本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌屮提取的。
2、米氏方程：在研究底物浓度与酶促反响速度的定量关系时，导出了酶促反响动力学的根本公式，即：V二卩机0卅[S]—K池十⑸(1)式屮：V表示酶促反响速度，也丈表示酶促反响最大速度,[S]表示底物浓度，心表示米氏常数。
3、心值的测定主要采用图解法，有以下四种：①双曲线作图法（图1-1, a）根据公式（1〕，以v对［s］作图，此时1/2$^时的底物浓度［s］值即为值，以克分子浓度W表示。
这种方法实际上很少采用, 因为在实验条件下的底物浓度很难使酶到达饱和。
实测是一个近似值，因而1/21^不准确。
此外由于v对［S］的关系呈双曲线, 实验数据要求较多，且不易绘制。
②作图法双倒数作图法（图1-1, b）实际工作屮，常将米氏方程（式（1）〕作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、准确得多。
其中之一即取（1〕式的倒数, 变换为方程式：丄=旦*丄+亠v Vmax ［S］ Vmax（2）以決堆1作图，即为形式。
此时斜率为怦，纵截距为产。
把直线U U V E*V EX外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为一亡。
③作图法（略）把（2）式等号两边乘以V max,得：輕V+1v = —Km * 占 + V max（3）以V对着作图，这时斜率为-心，纵截距叽,横截距为-兽。
［AJ④作图法(略)把(2)式等号两边乘以［S］,得:以旦对［s］作图，这时斜率为宀，纵截距为严。
I? V mar(b)本实验主要以双倒数法，即作图法来测定碱性磷酸酶值。
具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下(10.0,和60°C),准确反响13分钟。
碱性磷酸酶(AKP)的特性分析研究
碱性磷酸酶（AKP）的特性分析研究摘要：碱性磷酸酶（akp）是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，并且在较高温度下仍具有活性。
本实验由含pet21a-akp表达质粒的大肠杆菌制备碱性磷酸酶，通过一系列分离纯化的实验提纯了碱性磷酸酶。
本实验通过对纯化之后的akp进行酶促反应速率曲线的测定、测定激活剂和抑制剂对akp活性的影响、测定抑制剂对酶的动力学参数的影响、测定akp的最适温度和ph以及akp的变性和复性等实验来研究akp的特性。
关键词：碱性磷酸酶（akp）；反应速率曲线；激活剂；抑制剂；变性；复性；酶活力大肠杆菌碱性磷酸酶（ ec. 3. 1. 3. 1），是同二聚体金属酶，能催化非特异性磷酸单酯水解，分子量是56 kda。
它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3 个金属原子，即两个锌原子和一个镁原子。
大肠杆菌碱性磷酸酶被phoa 基因编码，和其他分泌蛋白质一样，以在氨基末端带有一个信号肽的前体合成，转录后穿过细胞膜进入细胞质，信号肽被除去，两个成熟的单体二聚化。
碱性磷酸酶即akp来源广泛，可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。
akp广泛存在于各种生物体内，参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶。
akp能催化除去dna、rna、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5’磷酸基团；去除线状dna两端的5’磷酸可以最大限度地减少质粒dna的自身环化；蛋白质的去磷酸化。
大肠杆菌碱性磷酸酶是一种有用的工具酶，在免疫学研究中常用作酶联试剂，将akp 与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。
akp作为一种工具酶在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用，在临床上作为同工酶，疾病诊断，研究磷的代谢等。
本实验对碱性磷酸酶的特性研究主要是通过对酶活力的测定来分析的。
酶活性也称为酶活力，按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适ph、温度25℃等）下，1分钟内能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。
碱性磷酸酶作用原理
碱性磷酸酶作用原理碱性磷酸酶是一种重要的酶类，在生物体内起着关键的作用。
它主要存在于细胞质和内质网中，参与多种生物化学过程。
碱性磷酸酶的作用原理是什么呢？首先，我们需要了解碱性磷酸酶的结构。
碱性磷酸酶是一种酶类蛋白质，其分子结构包括催化亚基和非催化亚基。
催化亚基是酶的活性部分，非催化亚基则对酶的稳定性和底物的结合起着重要作用。
碱性磷酸酶的催化亚基含有一个金属离子结合位点，这个金属离子通常是锰离子或镁离子。
这些金属离子能够与底物结合，促进底物的催化反应。
接着，我们来探讨碱性磷酸酶的催化机理。
碱性磷酸酶主要催化底物的磷酸酯键水解反应。
在这个过程中，催化亚基中的金属离子能够与底物的磷酸基团结合，使其处于更容易被水攻击的状态。
水分子进攻磷酸酯键，将其分解成磷酸和底物。
这个过程中，金属离子起着关键的催化作用，促进了底物的水解反应。
此外，碱性磷酸酶还受到底物和抑制剂的调控。
底物结合到酶的活性部分，通过诱导适应和亲和力调控酶的活性。
而抑制剂则能够结合到酶的活性部分，阻碍底物的结合，从而抑制了酶的活性。
这种调控机制使得碱性磷酸酶能够根据细胞内环境的变化，调节其活性，从而参与调控多种生物化学过程。
最后，我们需要强调的是，碱性磷酸酶作为一种重要的酶类，在细胞的代谢和信号传导中起着不可或缺的作用。
它的催化机理和调控机制对于维持细胞内稳态具有重要意义。
因此，对于碱性磷酸酶的作用原理的深入研究，不仅有助于我们更好地理解细胞内生物化学过程，也为相关疾病的治疗提供了重要的理论基础。
综上所述，碱性磷酸酶的作用原理主要包括其结构、催化机理和调控机制。
通过对这些方面的深入了解，我们能够更好地认识到碱性磷酸酶在细胞内的重要作用，为相关领域的研究和应用提供了重要的理论基础。
酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定
米氏常数Km：描述酶与 底物亲和力的常数
底物浓度与反应速率的关 系：底物浓度越高反应速 率越快
酶浓度与反应速率的关系： 酶浓度越高反应速率越快
温度与反应速率的关系： 温度越高反应速率越快
pH值与反应速率的关系： pH值影响酶的活性从而 影响反应速率
Km值的含义与计算方法
Km值：酶促反应中酶的活性与底物浓度的比值表示酶与底物的亲和力 计算方法：通过酶促反应速率与底物浓度的关系曲线利用米氏方程计算得出 Km值的意义：反映酶与底物的亲和力是酶学研究中的重要参数 Km值的应用：在药物设计、酶工程等领域具有重要应用价值
• 实验目的：测定碱性磷酸酶的Km值
• 实验原理：通过酶促反应动力学原理测定酶的活性和底物浓度的关系
• 实验步骤： . 准备实验材料：酶、底物、缓冲液等 b. 设定反应条件：温度、pH值、反应时间等 c. 测定酶活性：通 过酶促反应速率测定酶活性 d. 测定底物浓度：通过酶促反应速率测定底物浓度 e. 计算Km值：通过酶促反应速率和 底物浓度的关系计算Km值
配制反应溶液：按照实 验要求配制反应溶液包 括酶促反应试剂、碱性
磷酸酶、缓冲液等
加入底物：在反应容器 中加入底物并记录底物
浓度
加入酶促反应试剂：在 反应容器中加入酶促反 应试剂并记录酶促反应
试剂浓度
反应开始：在反应容器 中加入碱性磷酸酶并记
录碱性磷酸酶浓度
反应结束：反应进行一 段时间后记录反应时间、
06
实验结论与展望
实验结论总结
实验结果表明碱性 磷酸酶Km值与酶 促反应动力学密切 相关
实验数据表明碱性 磷酸酶Km值在不 同条件下的变化规 律
实验结果对于理解 酶促反应动力学具 有重要意义
实验碱性磷酸酶比活力测定
将测定的数据或计算结果用下表ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录。（此为例子）
步骤 总体 积 mL 400 蛋白 mg/ mL 7.24 总蛋 白 mg
酶活 力 U/mL
总活 力 U
比活 力 U/mg
纯 化 倍 数
得 率 %
匀浆过滤液
20.3
正丁醇处理上清液
0.35饱和(NH4)2SO4上 清液 0.7饱和(NH4)2SO4沉淀 溶解透析上清液 DEAE-32酶液 Sephadex G75酶液 Sephadex G200酶液
管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
加酶时 0.5 m 间 （min）
1m 1.5m 2m
2.5m 3m
3.5m 4m
4.5m 5m
10.5 11 加 NaOH 时间
反应时 间 （min）
11.5
12
12.5
13
13.5 14
14.5
15
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
移液器的使用
• • •
470
440 40.3 9.6 13.2 6.8 3.82 0.49 0.21
33.8
35.3 314.7 1002. 2 451.5 509.3
注意事项
1.
2. 3. 4. 5.
6.
7.
8.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 移液管或微量移液器的使用 比色杯的使用 水浴时试管架可以放进水浴锅中，但要保证水浴锅 的水可以没过试管中样品的位置。 -20oC冻着的样品取出后一定要完全化冻且混匀。
酶促反应动力学实验知识讲解
酶促反应动力学实验酶动力学综合实验实验（一）——碱性磷酸酶值的测定【目的要求】1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响2.了解米氏方程、值的物理意义及双倒数作图求值的方法。
【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。
其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。
但它不是单一的酶，而是一组同功酶。
本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。
2、米氏方程：在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：(1)式中：v表示酶促反应速度，表示酶促反应最大速度，[S]表示底物浓度，表示米氏常数。
3、值的测定主要采用图解法，有以下四种：①双曲线作图法（图1-1，a）根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2时的底物浓度[s]值即为值，以克分子浓度（M）表示。
这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。
实测一个近似值，因而1/2不精确。
此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。
②作图法双倒数作图法（图1-1，b）实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。
其中之一即取（1）式的倒数，变换为方程式：(2)以对作图，即为形式。
此时斜率为，纵截距为。
把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—。
③作图法（略）把（2）式等号两边乘以，得：(3)以v对作图，这时斜率为，纵截距为，横截距为。
④作图法（略）把（2）式等号两边乘以[S],得：(4)以对[s]作图，这时斜率为，纵截距为。
（a）(b)本实验主要以双倒数法，即作图法来测定碱性磷酸酶值。
具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（10.0，和60℃），准确反应13分钟。
在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620比色。
在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。
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酶促反应动力学：研究酶促反应速度及
其影响因素，并加以定量的阐述。
影响因素：酶浓度、底物浓度、pH、
温度、抑制剂、激活剂等。
在研究某种因素对酶促反应速度的影响时，
其余各因素均需保持恒定。
一、实验目的
1.掌握ALP活性测定的原理与方法 2.观察温度、pH、底物浓度、抑制剂对酶促反 应速度的影响。 3.掌握双倒数作图法测定km值的原理与方法。
以1/V对1/[S]作图， 得出一直线。
双倒数作图法
4.抑制剂对酶促反应速度的影响
酶的抑制剂：凡能使酶的催化活性下降而不引 起酶蛋白变性的物质。
竞争性抑制 可逆性 抑制作用种类
非竞争性抑制
反竞争性抑制
不可逆性
竞争性抑制曲线图
竞争性抑制剂与酶的底物结构相似,与底物竞争酶 的活性中心,从而阻碍酶与底物结合成中间产物。
特点： （1）V下降，发生抑制 （2）Vmax不变 （3）Km增大，亲和力下降
非竞争性抑制曲线图
抑制剂与酶活性中心以外的必需基团结合,不影响酶与底 物的结合,底物与抑制剂之间没有竞争关系。但酶-底物-抑制 剂复合物不能进一步释放出产物。 特点： （1）V下降，发生抑制 （2）Vmax减小 （3）Km不变
六、结果绘图
1、绘出pH对反应速度的影响，标出最适pH。 2、绘出温度（T）对反应速度的影响，标出最 适温度。 3、绘出1/[S]对1/[V]的直线图，求出Km和 Vmax。 4、绘出有抑制剂Na2HPO4时1/[S]对1/[V]的直 线图，求出有竞争性抑制剂存在时Km和Vmax 的变化。
[作图]
磷酸苯二钠法测定ALP的活性
本次实验以磷酸苯二钠为底物，碱性磷酸酶
(ALP)为催化剂，磷酸氢二钠作为抑制剂，分 别观察观察温度、pH、底物浓度、抑制剂对 酶促反应速度的影响。
ONa O-P=O ONa 磷酸苯二钠 C6H5 N
ONa
+
H2O
ALP
OH
+
HO-P=O ONa
酚
磷酸氢二钠 C6H5
底物浓度对酶促反应速度的影响
[S]与V的关系：米-曼氏方程
Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度
当[S]Km时，
，反应速率与底物浓
度成正比
当[S]Km时，VVmax，反应达到最大速率
Km与Vmax的意义
1. Km值
定义：Km等于酶促反应速度为最大速度一半时的底 物浓度，单位是mol/L。
根据图求 得Km和Vmax, 求出有竞争性 抑制剂存在时 Km和Vmax的变 化。 1/Vmax 1/V
-1/Km
1/[S]
七、注意事项
1.试剂较多，看清楚名称和浓度，认真实验， 取样要准确，加样顺序要一致，不能出错。 2.温度实验要保证温度。 3.作图时,实验点不在同一条直线上时,尽量使 各点平均分布在直线的两侧,两图画在同一坐 标纸上,便于判断。 4.每组做2个实验，数据交换使用。
三、试剂和仪器
pH8.0、9.0、10、11.5甘氨酸缓冲液、 0.04mol/L底物 10mmol/L底物 4-氨基安替比林 0.5%铁氰化钾 酶液 0.5mol/LNaOH pH8.8Tris缓冲液、 0.1mol/LpH10碳酸缓冲液 磷酸氢二钠 蒸馏水
二、实验原理
1.温度对酶促反应速度的影响 2.pH对酶促反应速度的影响 3.底物浓度对酶促反应速度的影响 4.抑制剂对酶促反应速度的影响 5.酶活性的测定
1.温度对酶促反应速度的影响
温度对酶促反应速率
具有双重影响 酶的最适温度 酶的最适温度不是酶 的特征性常数，它与 反应所需时间有关
反竞争性抑制曲线图
抑制剂与酶和底物形成的中间产物结合，使中间产物的量 下降。既减少从中间产物转化为产物的量，也同时减少从中间 产物解离出游离酶和底物的量。
特点: (1) V下降，发生抑制 (2) Vmax减小 (3) Km减小
竞争性抑制作用
竞争性抑制剂与酶的底物结构相似，与底物 竞争酶的活性中心，阻碍酶与底物形成中间 产物，从而抑制酶的活性。
H3C-N
Hห้องสมุดไป่ตู้C-C
C=O C-NH2
+
OH
K3Fe(CN)6
OH-
N
H3C-N
H3C-C
C=O C-N=
O
4-氨基安替比林
醌衍生物
醌衍生物为红色,根据红色深浅测出光密度值,计算不同 底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）。
Lambert-Beer定律：
Ａ =ＫＣＬ
100mL酶液在37℃下保温15min产生1mg酚 为一个酶活性单位 。 从标准曲线查出释放出的酚量（µg）则 可计算出酶活性
竞争性抑制作用
米氏方程
V max[S] v Km(1 [I] / Ki) [S]
[E][I] Ki [EI]
双倒数方程
1 Km [I] 1 1 (1 ) v V max Ki [S] V max
竞争性抑制作用特点：
抑制剂与底物结构相似
两者都与酶的活性中心结合 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及
抑制剂与底物浓度的相对比例，增加底物浓 度可减低或解除抑制作用 动力学变化：Vmax不变、Km值变大
5.酶活性的测定
酶活性：是指酶催化化学反应的能力，衡 量标准是酶促反应速度的大小。 酶促反应的速度（V）：通常用单位时间， 底物的消耗量或产物的生成量来表示，而一 般测定时都是以产物的生成量为准。
四、操作步骤
1.温度对酶促反应速度的影响 2.pH对酶促反应速度的影响 3.底物浓度对酶促反应速度的影响 4.抑制剂对酶促反应速度的影响
五、结果与计算
酶活性的计算：在37℃下保温15min产生1mg 酚为一个酶活性单位，从标准曲线查出释放 出的酚量（µg）则可计算出酶活性。
100ml酶活性 = 释放出的酚量（µg）× 1/0.1 × 100 × 1/1000 = 释放出的酚量（mg）
温度对淀粉酶活性的影响
2.pH对酶促反应速度的影响
酶促反应的最适pH pH通过改变酶与底
pH 对某些酶活性的影响
物分子解离状态影 响反应速率 最适pH不是酶的特 征性常数，它受底 物浓度、缓冲液种 类与浓度、及酶纯 度等因素的影响。
3.底物浓度对酶促反应速度的影响
当底物浓度较低 时,V随[S]的增大而 急剧上升,两者成正 比关系。 随着底物浓度继续 增加,反应速度增加, 而幅度不断下降。 若继续加大[S]，反 应速度就不再增加, 达到一个极限值 Vmax。
意义：a)Km可表示酶与底物的亲和力
b)同一种酶对于不同底物有不同的Km值 c)Km是酶的特征性常数，只与酶的结构、底物和反 应环境（温度、pH、离子强度）有关，与酶浓度无关
2.Vmax值：是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶 浓度成正比。
Km和Vmax值的测定
双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒数，得