标准应用方法-水溶性维生素的检测方法(20130319)

饲料添加剂中七种水溶性维生素的检测

1.摘要

应用HALO柱，建立一种用反相高效液相色谱测定饲料添加剂中7种水溶性维生素的分析方法。方法采用HALO C18色谱柱（4.6×50 mm，2.7 μm），以乙腈－磷酸二氢钠缓冲溶液（pH=6.2）为流动相进行梯度洗脱，流速1.5 mL/min，检测波长200 nm，7种水溶性维生素在5 min内完成分离检测。测得维生素的检测限介于0.5×10-9 g/mL~1.0×10-8 g/mL之间(S/N>2)。回收率91%-115%。这一方法操作简便快速、准确可靠，适用于饲料中水溶维生素的测定。

2.关键词

反相高效液相色谱；水溶性维生素；HALO柱。

3.范围

本方法适用于饲料中水溶维生素的检测。

本方法适用于高效液相色谱法分析水溶性维生素。

本方法可测定7种维生素，包括烟酸、叶酸、维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12。

本方法测定各维生素最低检测限不高于1×10-8 g/mL。

4.规范性引用文件

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。

5.定义

5.1维生素

维生素又名维他命，通俗来讲，即维持生命的物质，是维持生物体生命活动必须的一类有机物质，也是保持生物体健康的重要活性物质。维生素在体内的含量很少，但不可或缺。各种维生素的化学结构以及性质不同。

维生素是个庞大的家族，目前所知的维生素就有几十种，大致可分为脂溶性和水溶性两大类。

6.原理

样品经提取后，用反相高效液相色谱进行色谱分析，采用外标法定量。

7.试剂与材料

除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

7.1 乙腈：色谱纯

7.2 磷酸二氢钠：分析纯

7.3 磷酸氢二钠：分析纯

7.4 20 mM磷酸二氢钠缓冲溶液（pH=6.2）：精密称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.6625 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）1.9070 g完全溶于500 mL水，以0.22 um水系滤膜过滤即得。

7.5 标准品：烟酸、叶酸、维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12，纯度均大于等于98%。

7.6 5种维生素标准储备液：分别称取烟酸10.0 mg、维生素B1 50.0 mg、维生素B5 20.0 mg、维生素B6 50.0 mg、维生素B12 100.0 mg标准品，分别置于100 mL棕色容量瓶中，加纯水溶解并定容即为水溶性维生素的标准品储备溶液，低温保存。

7.7 维生素B2标准储备液：称取维生素B2标准品50.0 mg，置于洁净小烧杯中，加500 ul 冰乙酸，补加少量纯水，沸水浴至完全溶解后冷却至室温，移至100 mL棕色容量瓶中。以纯水定容至100 mL即为维生素B2的标准储备溶液，低温保存。

7.8 叶酸标准储备液：称取叶酸标准品10 mg置于洁净小烧杯中，加0.10 mol/L磷酸氢二钠溶液10 ml溶解后移至100 mL棕色容量瓶中，以纯水定容至100 mL即为叶酸标准储备液，低温保存。

7.9 7种维生素混合标准溶液：分别精确量取烟酸标准储备液2.0 mL、叶酸标准储备液2.0 mL、维生素B1标准储备液0.8 mL、维生素B2标准储备液2.0 mL、维生素B5标准储备液2.0 mL、维生素B6标准储备液0.8 mL、维生素B12标准储备液0.4 mL置于10 mL容量瓶中混匀，即为7种维生素标准溶液。

7.9 微孔滤膜：0.22 μm水系

7.10 微孔滤膜：0.22 μm有机系

8.仪器与设备

8.1EasySep TM -1020型高效液相色谱仪（上海通微分析技术有限公司）

8.2FA1004型电子天平：感量0.1 mg

8.3AS5150A型超声波水浴（奥特赛恩斯仪器有限公司）

8.4AP-01型真空抽滤装置（奥特赛恩斯仪器有限公司）

9.高效液相色谱测定

9.1 推荐色谱条件

a)色谱柱：HALO C18，2.7 μm，4.6×50 mm

b)流动相：溶剂A：20mM磷酸二氢钠水溶液（pH=6.2）；

溶剂B：乙腈

c)梯度洗脱：梯度条件见表1

d)流速：1.5 mL/min

e)检测波长：200 nm

f)进样量：20 μL

表1. 梯度条件

表2. 七种维生素的基本分离情况

9.2 标准曲线和检测限

吸取7种维生素混合标准储备液5.0mL、1.0mL、0.5 mL、0.05mL，用纯水定容至10 mL，取各稀释液及储备液原液进行测试。以各维生素标准品浓度与对应维生素色谱峰面积绘制标准曲线。以信噪比S/N>2方法计算维生素的检测限。

表3. 7种水溶性维生素的线性回归方程、相关系数、线性范围和检测限

9.3 精密度实验

吸取7种维生素混合标准储备液5.0mL用纯水定容至10 mL，按照实验条件连续进样6针，计算各维生素的保留时间RSD6和峰面积RSD6。

表4. 7种维生素的精密度实验

备注：由于样品保留时间极短，微弱的保留时间差异也会严重影响保留时间的重现性。

9.4 回收率实验

取某样品处理液三份，分别添加等体积各维生素标准品5ug/ml，作为样品进行分析测试，计算回收率。结果如下：

表5 7种维生素的加样回收率实验结果

备注：各样品回收率介于91%至115%之间。

10 定量测定

按外标法使用标准曲线进行定量测定。以峰面积计算供试样品中各维生素含量。待测样液中各维生素的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。