药用分子生物学考试要点

分子生物学基因治疗：指把目的基因导入人体，通过在特地靶细胞中表达该细胞本来不表达或低表达、或已异常突变而不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。

原癌基因：与癌基因同源、正常细胞内调控生长和分化的基因，变异后成为癌基因。

抑癌基因：一类存在于正常细胞内、调控细胞生长，具有潜在抑癌作用的基因。

癌基因：能使靶细胞发生恶性转化的基因。

细胞周期：指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。

细胞凋亡：指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。

RNA干扰（RNAi）：一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，在此过程中，与双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制该基因的表达。

聚合酶链式反应（PCR）：在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸（dNTP）存在的条件下，由耐热DNA聚合酶在体外反复酶促合成双链DNA的反应。

分子杂交：异源互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子的过程。

基因：指携带有遗传信息的DNA或RNA序列，也称遗传因子，控制性状的基本遗传单位基因组：一个染色体组中所含的全部DNA为一个基因组。

蛋白质组：指在一种细胞内存在的全部蛋白质，包括基因组表达的蛋白质和修饰后的各种形式的蛋白质，是细胞内所有蛋白质的集合体。

基因芯片：将寡核苷酸、基因组DNA或互补DNA等有序地固定在固相载体的表面形成微阵列的生物芯片。

引物：是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。

信号转导：细胞应答环境信号的过程表现为细胞内代谢过程发生相应改变，包括代谢物浓度、代谢速度、细胞生长、分化甚至衰老死亡速度等的改变，这种针对环境信号所发生的细胞应答过程称为信号传导。

探针：已知序列的标记单链DNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。

基因敲除：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的方法。

常用同源重组的方法敲除目的基因，观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。

限制性片段多态：不少DNA多态性发生在限制性酶切酶识别切割位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片段，成为限制性片段长度多态性分析（RLFP）。

限制性内切酶：由细菌产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸链中磷酸二酯键的核酸内切酶，又叫切割酶或限制酶。

（识别并切割特异双链DNA的核酸内切酶）简答题：1.从细胞周期调控的角度论述肿瘤的发生细胞水平——细胞增殖、分化、凋亡发生异常，细胞总数失控，恶性生长造成。

增殖↑分化、凋亡↓生得过度，死亡失缺基因水平------细胞周期（增殖、分化、凋亡）由两大类基因调控：原癌基因和抑癌基因。

原癌基因↑抑癌基因↓•一些原癌基因产物就是Cyclin•一些原癌基因产物诱导Cyclin表达•一些原癌基因产物调节CDK活性•一些原癌基因产物是Cyclin，CDK底物•作为CDKI：p15、p16、p21和p27•通过CDKI抑制细胞周期：p53，Rb•单一的肿瘤组织中往往同时存在多种遗传缺陷，包括原癌基因的易位、扩增/点突变，抑癌基因的缺失、突变或甲基化程度改变。

•原癌基因与抑癌基因协同作用，使细胞发生转化，导致肿瘤发生。

•特征：增殖、分化或凋亡异常•多基因突变，两个以上功能完全独立的癌基因激活或抑癌基因失活才致癌一个是胞核癌蛋白、与细胞永生化相关，如myc一个是胞质癌蛋白使肿瘤表型充分表达，如ras•正调和负调基因突变，癌基因和抑癌基因的协同致恶变——多基因协同假说2.请简要叙述基因工程的概念及其基本步骤基因工程指在基因水平上的遗传工程，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学、细胞生物学及微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

基本步骤：分---目的基因和载体的获得；切----目的基因和载体的限制性酶切；连---目的基因和载体的连解（体外重组）；转----连接产物（重组体）导入宿主细胞；筛----重组体的扩增、筛选；目的基因在细胞的表达、分离、纯化、鉴定等。

3.简述分子（核酸，蛋白质等）杂交印迹技术的种类、用途及特点（优缺点）4.举例说明原癌基因、抑癌基因与细胞周期、细胞凋亡调控基因的关系细胞经过细胞周期完成分裂和增殖，细胞周期调控主要是对细胞周期检验点的调控，有多种因子参与，其中包括Cyclin、CDK和CDKI。

原癌基因表达产物在细胞周期调控中发挥重要作用，他们可能是Cyclin、或是Cyclin-CDK 的底物，也可能是直接诱导合成Cyclin，调节CDK活性，或具有PTK活性。

抑癌基因表达产物在细胞增殖过程中发挥调控作用，他们可能作为CDKI与不同Cyclin-CDK 复合物结合而抑制CDK，从而抑制细胞周期；也可能通过CDKI抑制细胞周期。

简述原癌基因与抑癌基因的特点原癌基因的特点：广泛存在于正常真核细胞基因组中的正常基因，高度保守，属看家基因，在生长分化发育中起重要作用，表达受严格调控和时空限制。

未激活时无致癌活性，对正常细胞无害，在某些因素作用下，发生数量上或结构上的变化时，才引起细胞癌性转化。

抑癌基因的特点：抑制细胞增殖、诱导分化凋亡，对生长起负调控作用；抑制原癌基因的过度激活、表达，突变、缺失可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生，突变后又可成为癌基因5.基因治疗主要策略、基本过程及其存在的问题基因治疗的主要策略：基因修复；基因置换；基因增补；基因干预；免疫基因治疗；耐药基因治疗；基因激活。

基因治疗的基本程序：目的基因的选择和制备；靶细胞的选择；基因的导入；转染细胞的筛选和导入基因的鉴定。

基因治疗存在的问题：需要更多的切实有效的目的基因；需要提高基因导入效率；需要提高基因导入的特异性；需要提高目的基因表达的可控性。

知识点：1)转化细胞或肿瘤细胞株的特点：无临界点，永生化；无贴壁依赖性；无生长因子依赖性；无接触抑制；有致癌性。

2)主要DNA肿瘤病毒类型：多瘤病毒；人类乳头瘤病毒HPV；腺病毒。

3)癌蛋白的生理功能：●与生长因子或生长因子受体有关-----erbB●与信号转导途径相关：与酪氨酸蛋白激酶信号转导途径相关---src; 与鸟苷酸结合蛋白（G蛋白）相关---ras/P21●转录因子：myc家族●细胞周期、细胞凋亡调控：bcl-2抑制凋亡基因；bax促进凋亡基因4）几种主要的原癌基因：ras基因:信号转导蛋白中的小G蛋白（H-ras,K-ras,N-ras）rasD癌基因：点突变为主要激活方式肿瘤检出率为10%-15%rasD水解GTP能力下降，处于激活状态不与信号物质结合也传递生长信号myc基因：核转录因子，与DNA结合bcl-2基因：膜蛋白，抑凋亡，与myc协同抑制p53 5）抑癌基因的分类和功能：Rb（视网膜母细胞瘤基因），P53（与肿瘤相关性最高的基因），P16（衰老基因）,APC,DCC,MCC,BRCA（乳腺癌相关基因）,DPC4转录因子，细胞周期调控：Rb，P53细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白：P15，P16细胞黏连：DCCDNA修复：BRCA6）重组DNA导入大肠杆菌：氯化钙法；电穿孔法；病毒感染法/体外包装法。

6.重组DNA导入哺乳动物细胞：脂质体介导法（人工细胞膜）；病毒感染法（腺病毒）；显微注射法（转基因）；磷酸钙共沉法。

7.基因工程中所用到的工具酶：限制性内切酶---识别特异序列，切割DNA；连接酶---催化5’-磷酸与3’-羟基形成磷酸二酯键；DNA聚合酶----以DNA为模板合成DNA；RNA聚合酶（逆转录酶）----以RNA为模板合成DNA；碱性磷酸酶-----切除末端磷酸；T4多聚核苷酸激酶----催化核酸5’-羟基磷酸化；末端脱氧核苷酸转移酶-----催化3’-端合成同聚体尾。

8.基因工程常用的载体：质粒，噬菌体；酵母载体；病毒载体；9.质粒的基本特征：复制起点，启动子，多克隆位点，加尾信号，筛选标记。

10.细胞周期包括间期和有丝分裂期，间期以DNA的合成为标志，Go期（静止状态），G1起（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（合成其它必需的物质）11.细胞周期的内源性调控主要是通过Cyclins（正性调控）—CDKs（核心）—CKIs（负性调控）这一调控网络。

12.第一家族CDK4/6抑制剂包括p16、p15、p18、p19；第二家族包括p21、p27、p57，他们能抑制几乎所有的Cyclin-CDK.13.细胞周期检验点：G1/S检验点；S期检验点；G2/M检验点；纺锤体组装检验点（SAC）14.分子杂交技术：ISH（原位杂交）、Southern blot（DNA）、Northern blot(RNA)、Westernblot(Pr)、eastern blot（Pr）.15.原位杂交包括：菌落原位杂交，组织原位杂交，胚胎原位杂交，斑点/狭缝杂交（检测已知点突变）。

16.探针的基本条件（特点）：带标记物，单链核酸，高特异性，标记物稳定灵敏，检测方便安全。

17.探针标记方法：随机引物法、PCR标记法、切口平移法、末端标记法。

18.基因调控策略：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。

19.基因诊断的方法：核酸分子杂交、聚合酶链式反应技术（PCR）、PCR/单链构象多态性分析（SSCP）、限制性片段长度多态性分析（RLFP）、DNA序列测定、基因芯片。

20.信号传导的基本规律：细胞信号发生和终止；信号转导过程的级联放大效应；信号转导途径的通用性；信号转导途径的特异性；细胞通讯网络的精密性。

21.病毒基因组的结构特征：所含核酸种类和结构不同；所含核酸的分子数不同；基因组的大小差异较大；基因组为单倍体且含单拷贝基因；基因组序列基本上都是编码序列；基因的连续性不同；相关基因丛集成一个功能单位或转录单位；有些病毒基因组在基因重叠现象；有些基因组含有不规则结构基因。

22.原核生物基因组的结构特征：基因组通常由单一闭环双链DNA分子组成；基因组DNA只有一个复制起点；基因组所含基因数量较多，而且形成操纵子结构；基因组编码序列一般不重叠；基因是连续的，无内含子，因而转录后不需要剪接；编码序列约占基因组的50%，比列高于真核生物基因组，但低于病毒基因组；非编码序列主要是一些调控序列23.真核生物DNA多态性：单核苷酸多态性；串联重复序列多态性；限制性片段长度多态性；单链构象多态性；DNA指纹。

24.人类基因组作图：遗传图谱；物理图谱；转录图谱；序列图谱。