第八章 发酵过程控制1-2

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发挥菌种的最大生产潜力考虑之点
菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、
营养要求（酶系统）、代谢速率
➢菌代谢与环境的相关性 温度、pH、渗
透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等
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微生物代谢是一个复杂的系统，它的 代谢呈网络形式
比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的
前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副
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一 发酵过程主要分析的项目
目前发酵过程主要分析项目如下
1、pH
pH与微生物的生命活动密切相关—— 酶催化活 性 pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映—— 基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供 氧状况
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2、排气氧、排气CO2和呼吸熵
排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还 剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，
前体利用率 产物量（P） 比生产率（υ） 其他需要计算的值参数 功率、功率准数 雷诺数 细胞量 生物热 碳平衡 能量平衡
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直接参数又可分为在线检测参数和离线检 测参数
在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上
安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；
离线检测参数指取出样后测定得到的参数，
如残糖、NH2-N、菌体浓度。
对于这种工艺，后期的补料控制是关键。过程中
发现，在补糖开始时，不但CER、OUR大幅度提高，连
RQ也提高约10％，表明通过补糖不但提供了更 多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提 高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。
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3、糖含量
微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。
糖的消耗：
反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力
化学参数
成熟
不成熟
温度
积累消耗量
压力
基质
功率输入
酸
通气流量
碱
泡沫水平
诮泡剂
加料速率
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细胞量
基质
气泡含量
前体
气泡表面积
诱导物
表面张力
培养液重量
培养液体积
生物热
培养液表观
粘度
pH 氧化还原电位 溶解氧浓度 溶解 CO2 浓度 排气 O2 分压 排气 CO2 分压 其他排气成分
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成分浓度 糖 氮 前体 诱导物 产物
菌形态 显微镜观察
菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量 的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。
补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合
与否的一个参数。
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菌浓测定方法 测粘度 压缩体积法（离心） 静置沉降体积法 光密度测定法 OD600~660 适合于细菌、酵母
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7、产物浓度
产物，而这些前体有可能流向不同的反应 方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方
向进行。
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因此对发酵过程的了解不能机械的，割 裂的去认识，而要从分子水平、细胞代 谢水平和反应工程水平全面的认识
微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现 在菌体量的大小影响产物量的多少，而
且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期 代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更 具有复杂性
第七章 发酵过程的代谢控制
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发酵过程控制是发酵 的重要部分
控制难点：过程的不确定性和参数的非
线性
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同样的菌种，同样的培养基在不同工厂， 不同批次会得到不同的结果
可见发酵过程的影响因 素是复杂的
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比如设备的差别、水的差别、培养基
灭菌的差别，菌种保藏时间的长短， 发酵过程的细微差别都会引起微生物 代谢的不同。
发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，
否则影响提取过程
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5、磷含量
微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为
主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。
磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组
成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中 具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷 措施。
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6、菌浓度和菌形态
菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。
菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖 含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来 调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵 不正常。
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糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。
如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。
还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指
的是葡萄糖。
了解和掌握分析发酵过程的一
般方法对于控制代谢是十分必要的
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第一节 发酵过程工艺控制的 目的、研究的方法和层次
一 发酵过程的种类
分批培养
补料分批培养
半连续培养 连续培养
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二 发酵过程工艺控制的目的
有一个好的菌种以后要有一个配 合菌种生长的最佳条件，使菌种 的潜能发挥出来 目标是得到最大的比生产速率和 最大的生产率
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代谢参数按性质分可分三类：
物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、
溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等
化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产
物浓度、、核酸量等
生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、
呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等
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发酵过程参数
直接参数: 通过传感器把非电量变化直接转化为电量变
通过计算可以求得摄氧率（OUR）。
排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，
因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的， 有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此 消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的 有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大 于消耗的氧。
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CER表示单位体积发酵液单位时 间内释放的二氧化碳的量
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（3）测压法 产物特定反应放出或摄入气体，使系统
有压力变化，可以通过测定压力变化得知产 物量。
谷氨酸 谷 氨酸脱 氢酶 γ－氨基丁酸＋CO2
2、物理法 许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光 性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生 素的含量。
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化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于 过程分析
单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试
验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验
优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较
快时间内得到的结果。
缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长
各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确 性
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数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析
实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、 均匀设计、响应面设计。
优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过
数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确， 大大提高了实验效率。
但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最 佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在 较大的误差就会得出错误的结果。
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2、研究的层次
初级层次的研究：
一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生 长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温 度、最适pH等要求。
发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，
它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。
因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要
了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来 判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。
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这些代谢参数又称为状态参数，因
为它们反映发酵过程中菌的生理代 谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾 气二氧化碳，粘度，菌浓度等
摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试
验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的 优化有较高的效率。
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代谢及工程参数层次研究：
一般在小型反应器规模进行试验。
在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上
无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养 成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一 些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和
柠檬酸可以用NaOH滴定来计算柠檬酸产量
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（2）比色法 产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与 产物浓度成正比，可以用比色法测定。
链 霉 O ,加 H H 热 2 O 素 ， 麦 － 芽 F 2 e 蓝 酚 色
淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加 入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3， 5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生 颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活 力成正比。
效价表示方法：重量折算法 重量单位 类似重量单位 特殊单位
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重量折算单位：以最低抑菌浓度为 一个单位，如青霉素0.6微克＝1U
重量单位：规定某些抗 生素活性部分1μg=1u 如链霉素、卡那霉素、 红霉素等定义活性部分 1μg＝1u
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类似重量单位：规定抗生素的某 种盐1mg=1000u如金霉素、四环 素的盐酸盐定一为1μg＝1u
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4、氨基氮和氨氮
氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是 mg/100ml。如
氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。
氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。
氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情
况。
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但是氮源太多会促使菌体大量生长。有
些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此 必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的 分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。
在培养过程中，产生菌的合成能力和产物 积累情况都要通过产物量的测定来了解
产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重
要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生 产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成 的影响。
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二 产物量的测定
（一） 产物量的特殊表示法 1、抗生素效价的表示 抗生素效价表示抗生素的有效成分的 多少，效价大小用单位（U）来表示
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发酵过程受到多因素又相互交叉的 影响如菌本身的遗传特性、物质运 输、能量平衡、工程因素、环境因 素等等。因此发酵过程的控制具有 不确定性和复杂性。
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为了全面的认识发酵过程，本章 首先要告诉大家分析发酵过程的 基本方面，在此基础上再举一些 例子，说明如何综合分析发酵过 程及进行优化放大。
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三 发酵过程研究的方法和层次 1、研究方法
中间代谢物 金属离子 脱氢酶活力 各种酶活力 细胞内成分 蛋白质 DNA RNA
间接参数
摄氧率（OUR） 二氧化碳生成率（CER） 呼吸商（RQ） 总氧利用 体积氧传递系数（KLa） 细胞浓度（X） 细胞生长速率（Rx） 比生长速率（μ） 细胞得率（YX/S） 糖利用率 氧利用率 比基质消耗率（u）
呼吸熵＝ RQ CER
OUR
呼吸熵反映了氧的利用状况
RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同， 生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以 了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导 补料
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一般在发酵中后期为保证产生次级代
谢产物，有意使菌体处于半饥饿状 态，在营养限制的条件下，维持产生
次级代谢产物的速率在较高水平。
特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位 制霉菌素 1mg=3700u 多粘菌素B 1mg=10000u
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2、酶活力的表示法
酶活力用单位来表示。由于酶通常不是 很纯，不能用重量来表示酶的量。同一 种酶用不同的方法测定会有不同的酶活 单位，容易造成混乱，为此国际上作了 统一规定，规定在250C下，以最适的底 物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及 最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微 克分子底物的酶定量为一个活性单位。
化，实时地送计算机数据采集。 物理参数、化学参数、生物量参数 就地测量（in line）、在线测量
（on line）
间接参数: 由一些直接参数计算得到的各种反映过程特
性的参数。 反映菌体代谢活性、反应器工程特
性、反应器操作特性…等。
手工参数: 取样后实验室手工测量参数，离线输入。
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物理参数
直接参数
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（二） 产物量的测定
1、化学法
（1）滴定法 产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的 可用滴定法 如青霉素在碱性条件下加入过量的I2，反应生 成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘， 可计算出青霉素的单位
青霉 O H ,素 过 I2量 青霉噻 N 2S 唑 A 2O 3 滴 定 酸 I2 多 计 碘 余 算青
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生产规模放大：
在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐 的优化条件在大型反应器上得以实 现,达到产业化的实现。
一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率
是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶 解度、空气停留时间和分布不同， 剪切力不同，灭菌时营养成分破坏 程度不同所致。
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第二节 发酵过程的中间分析
方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的， 所以得到的代谢情况比较可信。
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全参数发酵罐
除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧、 pH电极，得到发酵全过程的这些参数外，还有 罐体称重，补料计量装置和尾气采 集分析系统，更重要的是，有一套独特的数 据处理软件，可以得到14个发酵过程参数，
并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过 程的分析起到了重要的作用