高分辨率溶解曲线HRM
高分辨率溶解曲线简介资料
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
高分辨熔解曲线分析技术临床应用研究进展
多症。李闪等［４］研究发现软骨发育不全与ＦＧＦＲ３
１ 高分辨熔解曲线分析技术概况
基因Ｇｌｙ３８０Ａｒｇ突变有关，软骨发育不良与ＦＧＦＲ３
Ｕｔａｈ大学的Ｗｉｔｔｗｅｒ实验室和Ｉｄａｈｏ公司在 基因Ａｓｎ５４０Ｌｙｓ突变有关，并针对两组基因突变建
１９９７年首次提出ＰＣＲ联合熔解曲线，由荧光信号 立了ＨＲＭ技术的快速筛查方法。角膜炎－鱼鳞病
监测扩增产物熔解曲线变化的新兴核酸分析技 带－３蛋白缺陷，何本进等［３］研究表明高效、准确、
术［１］。高分辨熔解曲线分析技术已经应用到临床的 低成本的分子诊断方法ＨＲＭ可以对ＳＬＣ４Ａ１基因
各个领域，对遗传病、肿瘤的诊断和细菌的鉴定及药 进行突变筛查，从而辅助诊断遗传性球形红细胞增
敏试验、药物的鉴定等发挥了重要作用。
有快速简便、成本低、灵活性高、敏感性高、特异性 关，叶军等［９］证实了ＭＥＤ１２基因突变与子宫肌瘤
高、闭管操作等优点。
有关，这两种基因突变都可以采用ＨＲＭ技术进行
２ 高分辨熔解曲线分析技术临床应用
检测，可用于高危人群的健康筛查和风险评估，为广
２．１ 遗传病
大妇女同志带来福音。ＨＲＭ技术在非小细胞肺癌
变化实时监控ＰＣＲ产物的技术，随后几年此方法不 －耳聋综合征的ＧＪＢ２基因［５］、原发性肥大性骨关
断改进，经历了ＨＲ－１，ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ和Ｒｏｔｏｒ－ 节病的ＨＰＧＤ基因［６］、原发性局限性皮肤淀粉样变
Ｇｅｎｅ６０００等，期间也不断有其他公司研制出用于 的ＯＳＭＲ基因［７］等都可以采用ＨＲＭ作为筛查方
Ｓｙｔｏ９，ＥｖａＧｒｅｅｎｓ等，不同染料对分析结果影响很 产生严重后果，因此肿瘤患者的早期诊断和治疗就
大，有的染料不适用于杂合子变异检测，有的不适用 显得尤为重要。乳腺癌和子宫肌瘤是困扰女性的两
hrm高分辨率溶解曲线实验流程
hrm高分辨率溶解曲线实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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高分辨率熔解HRM简介
高分辨率熔解HRM简介早在上世纪六十年代，双链DNA的熔解靠吸光度监测，数微克的DNA样品以每分钟0.1-1.0℃的速度缓缓加热，待直至数小时后完成熔解。
随后出现的利用荧光检测互补双链DNA是一个更灵敏的方法，这种方法需要先进行PCR富集DNA产物，它的流行得益于1997年问世的实时定量PCR仪Light- Cycler®。
毛细管进样和小样品体积保证了良好的温控效果，使得熔解速率大大加速到每秒钟0.1-1.0℃。
高分辨率熔解分析High Resolution Melting (HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。
可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。
HRM分析技术的神奇之处在于它是基于对核酸双链高温熔解行为的实时监测，仅仅是在普通荧光PCR之后加一步闭管的熔解步骤，操作简便，样品可随着其本身的序列、长度、GC 含量及双链互补程度不同而被区分开。
因此，甚至是单个碱基如SNPs也可轻易被鉴定出。
原则上来说，HRM分析技术的发展得益于三项技术上的进步：1. 1. 发现了新一代的对DNA无抑制作用的饱和染料（如LC Green Plus，Resolight等）；2. 2. 高度精密的荧光监控光学系统的问世；3. 3. 发明了能够对熔解状况进行细致分析的新算法。
高分辨率熔解分析最重要的应用是基因扫描，相比传统基因分型技术，HRM具有许多优势：1. 1. 省钱—相比较测序和Taqman® SNP分型技术，HRM更适合于大规模基因分型项目；2. 2. 快速—能够在更短时间内精确分型；3. 3. 简单—易上手操作，可在高分辨率的荧光PCR仪上方便实现。
由于突变导致的突变样本熔解曲线相对于参考样本的变化是可以明显识别出来的。
高分辨率熔解曲线实验优化建议
High Resolution Melting高分辨率熔解曲线实验优化建议picture placeholderApplication Support Center Roche Applied Science Hotline: 800 820 0577Email: asc.support@饱和双链DNA结合染料减少非特异性产物和引物二聚体引物模板Mg 2+ PCR 程序•引物设计–引物退火温度 Tm~60o C–扩增片段长度 <250bp，通常在100-150bp左右–使用专业的引物设计软件；利用BLAST(/BLAST) 来确保引物与模板DNA结合的特异性•引物纯度–使用HPLC纯化级别的高纯度引物•引物浓度–为了避免引物二聚体的生成，使用较低的引物浓度：例如 200nM each•核酸提取–确保所有样品的提纯方法都是一样的–使用高质量的核酸提纯方法。
例如：商业化的手动核酸提取试剂盒或者全自动核酸提取仪•模板浓度–建议模板起始浓度在5-30ng/20ul，扩增曲线的Cp值<30–用吸光度方法计算待测样品的核酸浓度，调整模板浓度使它们的起始浓度相同167 bp PCR FragmentMgCl2 Titration 1.0 – 4.0 mMPCR Primers: 200 nM each Touchdown PCR Protocol (64 – 54°C)MWMPCR Products (+ NTC 4.0 mM)MWM50 bp4.04.03.53.02.52.01.51.050 bpMgCl 2 ConcentrationAgarose Gel 2%Touchdown PCR•用于：当无法进一步调节引物退火温度时•原理：先在较高的温度退火，保证产物的特异性；在后面的循环中，退火温度逐渐降低，保证有足够的产物总量•局限性：Touchdown PCR 不适用于定量实验Example 1: Touchdown PCR with40 Cycles and 0.5 °C step sizeExample 2:Touchdown PCR with45 Cycles and 1°C step size在 LC Nano中编辑 Touchdown PCR•问题：丰度低的突变基因在PCR扩增中很难被检测到•解决方法：选择性的扩增突变序列•Fast COLD PCR原理：–适用于 G/C → A/T 的突变，Tm(wt)>Tm(mut)–变性温度设在Tm(mut)附近，保证在这个温度下只有突变型发生变性•实验必备条件:–精确的温度控制–孔间温差尽量小，保证样品中突变型扩增的富集程度一致•其他应用：–Fast COLD-PCR：优先扩增 Tm 低于野生型 homoduplexes，适用于 (G/C → A/T, 占突变的84%)–Full COLD-PCR：优先扩增 heteroduplexes, 适用于所有突变–Ice-COLD-PCR：与 Full COLD-PCR 相同, 但使用了 reference sequence(RS) oligo, 提高heteroduplex 的突变检出率HRM优化 - Spiking方法区分纯合子样品•问题：纯合野生型和纯合突变型的Tm接近，分组不清晰•解决方法：向所有样品中加入20%纯合野生型样品–Homozygous WT：组分不变–Homozygous MT：含有20% WT–heterozygous：组分不变，仍然是heterozygousAAA B + AABB + AA AAA BBB20% AA20% AA20% AA内容小结•HRM实验优化建议–引物–模板–Mg2+浓度–PCR程序: Touchdown PCR, COLD PCR •Spiking方法区分纯合子样品We Innovate Healthcare。
高分辨熔解曲线(HRM)
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
高分辨率熔解HRM的应用前景
高分辨率熔解HRM的应用前景星期一, 三月1st, 2010 | HRM技术 | 苏州为真生物| 浏览:118摘要：高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。
它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、基因分型和甲基化分析等多个方面。
凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。
高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。
它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。
凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。
其实双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。
分析需要几微克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。
后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。
样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。
当时使用的染料是SYBR® Green I。
然而，这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。
如果要区分SNP，分辨率还不够。
为什么呢？这里有必要先介绍一下饱和染料和非饱和染料。
SYBR Green I就属于非饱和性染料，由于它对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。
这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降。
于是，饱和染料问世了。
为什么称为饱和染料呢？因为它们即便在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑制PCR。
高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失•特定突变、多态性位点的筛选•外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
高分辨率溶解曲线HRM
软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
25:67–90
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：∙检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁∙鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变∙基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失∙特定突变、多态性位点的筛选∙外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：∙灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution Melting，简称HRM）是一种基于PCR技术的高灵敏度、快速检测和基因分型等应用的新兴方法。
它通过对PCR产物进行高温梯度退火，利用DNA序列中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）或突变等，可以对不同的DNA样本进行鉴别和分类。
HRM技术的原理是利用DNA双链在高温梯度环境下的失配特性。
在PCR反应中，经过一定的循环扩增过程，得到目标序列的大量复制品。
然后，通过控制扩增产物的温度、缓慢升温，逐渐增加其中的失配碱基数目，最终使DNA双链断裂解离。
同时，加入一种特定的DNA染料（例如SYBR Green），该染料能够与双链DNA结合并发光。
当溶解曲线进行扫描时，溶解温度越高，样品中的双链DNA越容易解离，染料释放的荧光信号越强。
而当双链DNA中存在SNP或突变时，会引起其中某一个区域的碱基配对发生改变，导致产物的熔解曲线发生改变。
根据熔解曲线的形状、峰型、峰面积等特征，可以判断样品中的SNP型态或突变类型，并进行分类鉴别。
HRM技术具有多个优点。
首先，HRM技术不需要引入特异性的探针或标记物，减少了实验操作的复杂性和成本。
其次，HRM技术具有高度灵敏性和准确性，能够鉴别并区分出少量变异的DNA样品，并且对于SNP的鉴定准确度高。
此外，HRM技术具有高通量、快速、操作简单等特点，适用于大规模基因分型和突变检测等实验。
HRM技术在药物研发、医学诊断和遗传学研究等领域有着广泛的应用。
例如，在药物研发中，可以通过HRM技术对候选靶点进行筛选，评估药物的安全性和有效性。
在医学诊断中，HRM技术可以应用于肿瘤的分型和突变检测，早期发现和预测疾病的风险。
在遗传学研究中，HRM技术可以用于亲子鉴定、人群遗传学调查和基因组学研究等方面。
尽管HRM技术具有许多优点和应用前景，但也存在一些局限性。
高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用
高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用朱岩芳;张炜;胡晋;朱丽伟;关亚静;王建成【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2013(032)010【摘要】饱和荧光染料、未标记探针与实时荧光PCR结合产生的高分辨率熔解曲线分析(HRM)是一种新的实时定量技术,在核苷酸差异检测速度、灵敏度和准确性上具有突出的优点,近几年来在突变检测、遗传作图和基因分型等研究中发展迅速.本文对高分辨率熔解曲线分析的原理、特点及其在植物种质资源鉴定中的应用进行了综述.【总页数】4页(P57-60)【作者】朱岩芳;张炜;胡晋;朱丽伟;关亚静;王建成【作者单位】浙江大学农业与生物技术学院种子科学中心,杭州310058;浙江大学农业与生物技术学院种子科学中心,杭州310058;浙江大学农业与生物技术学院种子科学中心,杭州310058;浙江大学农业与生物技术学院种子科学中心,杭州310058;浙江大学农业与生物技术学院种子科学中心,杭州310058;浙江大学农业与生物技术学院种子科学中心,杭州310058【正文语种】中文【中图分类】S330【相关文献】1.核rDNA ITS序列在植物种质资源鉴定中的应用 [J], 赵玥;赵文军;朱水芳;吕国忠2.近红外漫反射光谱分析技术在作物种质资源品质性状鉴定中的应用 [J], 朱志华;王文真;刘三才;李为喜;张晓芳;刘方;李燕3.关联分析在植物种质资源研究中的应用 [J], 张华;王秀全;何丹;庞启华;税红霞;卢庭启;蒋晓芳4.DNA分子标记技术在植物种质资源鉴定中的应用 [J], 岳建萍5.AFLP在植物种质资源鉴定与遗传多样性分析中的应用 [J], 王姗姗; 刘小娇; 靳玉龙; 白婷; 朱明霞; 王波; 张文会; 张玉红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲线)同许多荧光PCR技术一样，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA双链小沟中（PCR产物）的特性，通过实时监测升温过程中dsDNA解链，荧光染料脱落，荧光信号减弱或消失的过程，高分辨记录熔解曲线，从而对样品进行检测。
HRM技术利用dsDNA的物理性质，准确反映DNA序列碱基配对特异性与解链温度变化的情况，无需使用特异性标记探针，不受突变种类和突变位点的限制，具有高灵敏度和特异性、高通量、操作简单灵活、成本低等优点。
实验室检测证明，在PCR反应前或反应后加入饱和dsDNA染料，对HRM分析，效果相同。
在PCR后加入，可闭管进行HRM分析，无需凝胶电泳。
HRM分析，不损伤PCR产物，用于HRM分析的PCR产物仍可用于电泳、胶回收、测序等一系列后续操作。
HRM可应用于核酸突变扫描、基因分型、甲基化检测、短串联重复序列分析、序列匹配和RNA编辑等多方面研究，已越来越受到国内外核酸分子实验室的欢迎和重视。
对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。
在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。
HRM技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR反应体系中加入双链DNA饱和荧光染料，在PCR反应之后再花15 分钟，就可以完成96或384个样品的DNA变异扫描。
采用这种方法，当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。
一、HRM分析条件1. 设备PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列，序列中如有一个碱基发生突变，都会改变dsDNA的解链温度。
但是这种变化差异极小，只有零点几摄氏度，HRM技术需要区分Tm值差异极小的样品，以鉴别单个碱基的差异，因此，对温度分辨率的要求相当高，如果仪器的分辨率不高，是无法检测的。
高分辨溶解(HRM)分析
一、原理
PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏 度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高 分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐 解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧 光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高， 随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下 降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个 过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 基因的突变扫描： 前后重复、杂合子缺失。 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法
高分辨溶解（ 第二课 高分辨溶解（HRM）分析 ）
hnxide@
高分辨率熔解（High-resolution melting，简 称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面
高分辨率溶解曲线和TEAL-TIME PCR
目前，有不少人把高分辨率熔解曲线(HRM)和Real-time的熔解曲线混为一谈，只要一听到熔解曲线4个字就和荧光定量联系在一起了，再加上现在市面上有些仪器兼具荧光定量和HRM的功能，使一些同行更加迷惑。
今天去给大家讲一下两者之间的区别。
（一）.两者的原理HRM：不同核酸分子的片段长短、GC 含量、GC 分布等是不同的，因此任何双链DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。
Real-time：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）.两者的采集过程HRM：高分辨率熔解曲线（HRM）是在PCR反应之后，对PCR产物进行升温变性，采集荧光信号的变化，绘制成不同形状的曲线。
Real-time：是在PCR过程中采集荧光信号。
（三）.两者的应用HRM：筛查未知突变和针对已知位点进行基因分型。
基因分型的方法为非标记探针法和小片段法。
Real-time：定量及基因分型。
基因分型的方法是：Taqman探针，水解探针等。
（四）.基因分型方法的费用HRM基因分型方法的费用远低于Taqman探针和水解探针。
（五）.两者所用的染料HRM：LC Green饱和染料，能与DNA双链的碱基紧密结合，不抑制PCR反应，在PCR反应过程中是过饱和的状态。
Real-time：SYBR Green不饱和染料，不能与DNA双链的碱基紧密结合，浓度高时会抑制PCR反应，只能少量加入。
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hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution melting curve）是一种广泛应用于基因分型、突变检测和SNP分析等领域的检测技术。
其基本原理是利用荧光染料与DNA双链结合，随着温度的升高，DNA双链会逐渐解旋，导致荧光强度的变化。
通过检测荧光信号的变化，可以获得一条关于温度的曲线，称为溶解曲线。
高分辨率溶解曲线分析的优势在于其高灵敏度和高分辨率。
它可以快速、准确地检测出不同DNA序列之间的差异，甚至能够区分相似度达到99.99%的DNA序列。
这使得高分辨率溶解曲线成为一种非常重要的基因分型和突变检测技术。
高分辨率溶解曲线的操作相对简单，通常包括以下几个步骤：1.样品准备：从生物样本中提取DNA，并进行纯化和扩增，以获得足够的DNA量。
2. PCR扩增：选择适当的引物，进行PCR反应，扩增目标DNA片段。
3.荧光染料加入：在PCR反应结束时，将荧光染料加入PCR体系中。
荧光染料可以与双链DNA结合，从而产生荧光信号。
4.温度梯度扫描：利用PCR仪器进行温度梯度扫描。
通过逐渐升高温度，将DNA片段逐渐解旋，并观察荧光信号的变化。
5.数据分析：通过对荧光信号进行分析，可以得到一条溶解曲线。
根据曲线的形状和荧光峰值的位置，可以判断样品中的DNA序列。
高分辨率溶解曲线的分析可以被广泛应用于许多领域，例如基因分型、突变检测、SNP分析等。
在基因分型中，通过对多个基因位点的高分辨率溶解曲线进行分析，可以确定个体的基因型。
在突变检测中，溶解曲线的形状和荧光峰值的位置可以指示是否存在DNA序列的突变。
而SNP分析则是通过溶解曲线的变化来检测单核苷酸多态性。
除了上述应用之外，高分辨率溶解曲线还可以被用于测定DNA的荧光特性和结构特点。
通过观察溶解曲线的形状和荧光峰值的位置，可以获得DNA的熔解温度、熔解曲线宽度等信息，进而了解DNA序列的稳定性和结构特点。
总之，高分辨率溶解曲线是一种重要的基因分型和突变检测技术。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线在战略管理中，高分辨率溶解曲线（High Resolution Melting Curve，HRM）是一项重要的技术，它用于检测DNA样本中的序列变异。
HRM技术通过监测DNA双链解旋和融合的过程中释放的荧光信号，能够快速、准确地分析DNA序列的变异情况。
本文将详细介绍HRM技术的原理、应用以及在人力资源管理中的潜在价值。
一、HRM技术的原理HRM技术基于PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增的基础上，结合特定的荧光染料和曲线分析软件，实现对DNA序列变异的检测和分析。
在PCR扩增过程中，引物与DNA靶标序列结合，通过高温将DNA双链解旋成为两条单链，然后通过降温使引物与DNA靶标序列结合并生成新的双链，这个过程称为融合。
同时，荧光染料会与DNA结合，并放出荧光信号。
在HRM分析中，荧光信号会被连续监测并记录下来。
当DNA序列存在变异时，由于突变的序列结构和碱基成分的改变，其解旋和融合的过程会产生不同的热力学特性，从而导致荧光信号的变化。
通过分析荧光信号曲线的形状、峰值和面积等参数，可以准确地判断DNA序列是否存在变异。
二、HRM技术的应用领域1. 疾病诊断与预测HRM技术可用于检测与疾病相关的基因突变，例如肿瘤标志物、遗传性疾病、感染性疾病等。
与传统的测序方法相比，HRM技术具有快速、高通量、高灵敏度和低成本等优势，因此在疾病诊断与预测方面具有潜在的应用前景。
2. 品种鉴定与遗传分析在农业领域，HRM技术可用于鉴别农作物品种、检测动植物基因突变、分析遗传多样性等。
通过快速、准确地判断DNA序列的差异，可以帮助农业科学家提高品种鉴定的准确性，加速新品种的培育进程。
3. 药物研发与剂量调控HRM技术在药物研发中的应用主要包括药物基因敏感性筛选、药物代谢酶基因多态性检测等。
通过分析患者的基因型和药物反应之间的关系，可以优化药物疗效，减少药物副作用。
高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解曲线（HRM）技术的应用举例HRM应用举例1 突变筛查HRM的特点是高灵敏度和高特异性，检测灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测出已知突变，也能检测出未知突变。
在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法（如dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析（表1）。
表1、突变检测方法的比较研究方法优点缺点直接测序法突变检测金标准，能发现已知和未知突变位点每个位点均需要经PCR扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期特别长，价格昂贵，不适合大样本、少位点的样本检测，容易交叉污染。
Taqman探针法适合已知突变位点、位点数量少、通量高的检测价格昂贵（探针合成费用高），不能同时发现未知突变位点普通PCR方法技术简便，价格便宜，仅适用已知SNP判断，不能确定何种突变，适宜少量样本检测费时费力，速度较慢，灵敏度差；RFLP仅能检测有酶切位点的片断，无酶切位点不能检测；上述方法都需要凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人工假相，使结果出现偏差。
SSCP、DGGE花费时间长、稳定性差、灵敏度有限，难以大规模开展工作。
芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点仅适用于全基因组扫描，不适宜单个或少数基因的突变位点检测，精度低，价格昂贵。
Illumina技术这种方案可以帮助研究人员在得益于起始样品量要求很低优点的同时，还能够检测多个感兴趣的区域，从而检出罕见的基因突变。
高通量检测，在全基因组上扫描分析上有优势，价格昂贵。
MALDI-TOF MS 质谱技术检测速度快，理论上能分开单个碱基变化这种纯物理检测易受到样本因素的多种干扰，如盐离子含量等，适宜于已经优化的特定突变检测，不适宜该服务商未做过或很少做过的新突变检测。
检测过程需要多点质控，否则精确度很低。
另外，很重要的一点是过程复杂：PCR+电泳+割胶+纯化等，最后才是质谱监测，PCR需要自己做，并不便宜。
(人力资源知识)高通量低成本SNP突变或甲基化检测方法—HRM技术应用
（人力资源知识）高通量低成本 SNP 突变或甲基化检测方法—HRM 技术应用高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM 技术应用HRM 介绍HRM 技术是 high-resolutionmeltinganalysis 即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的壹种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的 PCR 技术，HRM 不受突变碱基位点和类型局限，无需序列特异性探针，于 PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA 配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据 DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均壹性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度 PCR 仪（LightCycler®480和Rotor-Gene6000）和饱和染料（LCGreen、EvaGreen 等）的ft现，HRM 技术的普及使用成为可能。
HRM 应用•SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
•基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
•新突变的筛查。
•甲基化的筛查。
•遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
•HLA 基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
•法医学鉴定、亲子鉴定。
•动植物品质关联多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变和性状关联性研究。
HRM 特点•高通量：1 次可同时检测 10-384 样本，适合大样本、多 SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
•高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到 0.1%的突变样品基因突变，即检测到 1000 个正常细胞中 1 个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的 25%，即100 个正常细胞中至少有 25 个突变细胞，测序仅适用手术组织。
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Class 2 C:A, G:T
Class 4 A:T
1 Probe, 2 SNPs, 1 Amplicon
2 Probes, 2 SNPs, 1 Amplicon- ApoE Amplicon-
2 Probes, 2 SNPs, 2 Amplicons - HFE
Amplicon Scanning – 发现新的突变
在PCR反应前加入 LCGreen 荧光染料 • 时间大约2小时（包含试剂准备） 时间大约2小时（包含试剂准备）
在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析 • 大约需要5 大约需要5-10 分钟
数据分析和处理 • 大约需要5 大约需要5-10 分钟
PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如 需要） • 大约需要30-60分钟 大约需要30-60分钟 30
LightScanner适于 适于SNP分析 适于 分析
1. 速度、通量—LightScanner 5～10分钟完成96/384孔板的PCR产物检测 ， 20000个SNP/天 2. 3. 4. 5. 6. 可检测未知、已知突变，对已知突变进行Genotyping 检测未知及已知突变准确性100%、特异性92.7% （<400bp） 重复性—LightScanner重复性100% 费用—LightScanner检测SNP每个样品的荧光染料成本为1.6RMB 操作—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可， 软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
Bernhard J. HoWnger · Hai-Chun Jing ·Kim E. Hammond-Kosack · Kostya Kanyuka (Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851–865 DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 数据来自英国洛桑农业实验站
SNP及突变研究的最新工具 及突变研究的最新工具 高分辨率熔解曲线（ 高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting） ） 突变筛查和基因分型系统
北京思博全科技有限公司
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting） • 高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
HRM – Lunaprobe genotyping
HRM – Lunaprobe genotyping
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
Class 1 C:T, G:A Class 3 C:G
Mutation Scanning
未知SNP扫描 未知SNP扫描 SNP
M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。
Bernhard等对Barley的eukaryotic translation
initiation factor 4E (eIF4E) gene基因外显子进行突变扫描结果
Rosario Muleo（2009）等用HRM方法对三个品种的SSR DCA4进行分析，DCA4的等位基因有131bp的重复序列，杂 合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个 等位基因只相差2bp。 三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明3种不同的品种。
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
Rosario Muleo等得出结论： HRM是一种快速、重复性 高、成本低，操作简单，且 可以应用于其他物种的SNP 检测及SSR基因分型的方法。
Rosario Muleo,Marir Chiara Colao,Dario Miano at el. 2009 Genome52:252-260
内容提示
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
• HRM仪器
2005 LightScanner 96/384
•96/384 孔板 •~8 分钟 板 分钟/板 •~2-6 秒/样品 样品 •温度均一性：± 0.15oC 温度均一性： 温度均一性 •数据采集速度：大于100pts/秒 数据采集速度：大于 数据采集速度 秒 •升温速度： 0.1oC/秒 升温速度： 升温速度 秒
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
Small Amplicon Genotyping 扩增小片段直接进行基因型鉴定
•使用已知Tm值的双链DNA做温 度内标，低温内标Tm(~61℃) ,高 温内标Tm (~92 ℃) •内标能够实现96/384孔板的温度 均一矫正。 •PCR片段的Tm值范围： 70-88 ℃ •优点：不需要探针，直接利用 PCR产物针对已知突变位点进行 基因分型
LightScanner突变检测原理 突变检测原理 Wild type Tube 1 Homozygote Tube 2 Heterozygote
Tube 3
PCR
Lightscanner高分辨溶解曲线结果 高分辨溶解曲线结果
LC Green plus —— 高分辨溶解曲线专用荧光染料
Saturating dye
High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的 是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的 （ 是基于有序列变化的 之间微弱的 Tm值差异，通过 值差异， 片段熔解曲线的差异进行突变检测， 值差异 通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如： 片段熔解曲线的差异进行突变检测 比如：
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
•HRM 检测 • 60 分钟内完成定量 PCR 和 HRM 检测 • HRM检测升温速度可以在 0.05 ～ 0.90oC/秒之间调 检测升温速度可以在 秒之间调 节 •在升温速度小于 在升温速度小于≤0.3℃/秒时，温度均一性：±0.05oC 秒时， 在升温速度小于 ℃ 秒时 温度均一性： • 数据采集速度：20pts/秒～400pts/秒（与升温速度有 数据采集速度： 秒 秒 关） • 0.3oC/秒 升温速度 67 pts/ ℃ 秒 升温速度= • 0.05oC/秒 升温速度 = 400 pts/ ℃ 秒
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
rr
Mix Rr:rr by 1:1 Rrrr
RR Mix RR:Rr by 1:1 RRRr Rr
David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:67–90
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化