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课程名称：微生物学检验技术
授课专业：医学检验
学时：4学时
实验十三沙门菌属和变形杆菌属检验
( Salmonella test and Proteus test)
一、实验目的
1.通过模拟临床标本，模拟临床情景，培养学生应用知识和技能，独立思考，学会发现问题、分析问题和解决问题，培养学生的综合能力。

2.掌握沙门菌属、变形杆菌属的生物学特性、检验程序及鉴定方法。

二、实验设计及安排
㈠模拟标本：血液(正常血液中分别加入3种沙门菌和大肠杆菌，并编成1、2、3、4号。

㈡实验分组：2人为一组，每组鉴定一种标本，让学生自己进行实验。

㈢实验教学过程：
第一天
1.布置任务（检验程序设计、增菌培养、看书、查找相关沙门菌检验、血培养的资料）
2.发标本
3.教师需提供的材料：增菌液
第二天：增菌结果观察，涂片染色镜检、分离培养
1.教师需提供的实验材料：
培养基：SS，EMB
试剂： 0.5%美蓝水溶液，2%伊红水溶液，20%乳糖水溶液等
其他：无菌平板， 1ml无菌吸管，5ml无菌吸管，吸头若干，革兰染液，玻片，显微镜，镜油，擦镜纸，电吹风等
2.教师提示：细菌生长的现象；取菌操作需严格无菌。

第三天：分离培养结果观察、涂片染色镜检、初步生化反应。

1.教师需提供的材料
培养基： KIA,MIU，半固体，蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，枸盐酸盐琼脂斜面培养基，硝酸盐等
试剂：20%尿素水溶液，0.4%酚红水溶液，1%溴麝香草酚兰酒精溶液，20%葡萄糖水溶液等
其他：无菌中号试管，无菌小号试管，1ml无菌吸管，5ml无菌吸管，吸头若干，斜面板，革兰染液，玻片，显微镜，镜油，擦镜纸，电吹风等
2.学生最容易出现的问题：不能分析选择培养基上出现不同的菌落；染色结果不正确。

3.教师提示：SS、EMB的结果分析结合这两种培养基的原理来解释
第四天：生化反应结果观察，最终鉴定
1.教师需提供的材料
靛基质试剂，甲基红试剂，VP试剂（40%KOH肌酸溶液）
沙门菌属诊断血清
2.学生最容易出现的问题：各项生化反应的结果判断；进行血清学诊断的方法及步骤;根据片面的实验结果做最终结论。

3.教师提示：生化反应结果要结合培养基的成分、原理进行分析、判断；细菌的最终鉴定要综合形态染色、菌落性状、生化反应和血清凝集的各项实验结果。

三、实验报告：
1.写出检验程序；
2.详细描述实验结果并分析；
3. 结果报告；注意列出各种细菌的鉴定依据。

四、实验小结：
㈠实验准备
1.标本1：伤寒沙门菌+大肠杆菌
标本2：甲型副伤寒沙门菌+大肠杆菌
标本3：乙型副伤寒沙门菌+大肠杆菌
标本4：变形杆菌+大肠杆菌
2.培养基：
SS,EMB,KIA,MIU，半固体，蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，枸盐酸
盐琼脂斜面培养基，硝酸盐等
3.试剂：
20%尿素水溶液，0.4%酚红水溶液，1%溴麝香草酚兰酒精溶液，0.5%
美蓝水溶液，2%伊红水溶液，20%乳糖水溶液，20%葡萄糖水溶液等靛基质试剂甲基红试剂VP试剂（40%KOH肌酸溶液）
沙门菌属诊断血清：
4.其他
无菌平板，无菌中号试管，无菌小号试管，1ml无菌吸管，5ml无菌吸管
吸头若干，斜面板
革兰染液，玻片，显微镜，镜油，擦镜纸，电吹风等
㈡以学生自己实验为主，从程序设计到结果报告，独立完成。

老师可以根据情况给出一些提示和建议。

实验过程中，教师最好是不直接回答学生的提问，应启发学生对结果的分析和思考。

（三）通过对两类细菌的同时检验，教师应指出沙门菌和变形杆菌的异同，帮助学生掌握两属细菌的主要特性。

五、实验结果
㈠菌落观察：
⒈SS平板：
圆形，凸起，边缘整齐，光滑，湿润半透明的无色小菌落
⒉EMB：
圆形，凸起，边缘整齐，光滑，湿润半透明的无色中等大小的菌落
㈡生化反应：
KIA
斜面底层产气硫化氢伤寒杆菌 K A + +（-/+）
甲型副伤寒沙门菌 K A + +（+/-）
乙型副伤寒沙门菌 K A + +（++）
变形杆菌 K A - +/-
鸟AA脱羧酶赖AA脱羧酶 C M VP 伤寒杆菌 - + - + - 甲型副伤寒沙门菌 - + - + - 乙型副伤寒沙门菌 + + + + - 变形杆菌 - - + + -
MIU
M I U
伤寒 / 副甲/副乙 + - -
变形杆菌 + + +
附：氨基酸脱羧酶试验
1.原理:
某些细菌具有特异性脱羧酶,能作用于氨基酸的羧基部位生成碱性的胺类和CO2,使培养基中的溴甲酚紫指示剂变紫色(酸黄碱紫).加石蜡油是为了造成一个厌氧环境,因为只有在厌氧环境下生成的胺才稳定.
2.应用:
主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌属的赖/鸟氨酸脱羧酶均为阳性。

赖氨酸脱羧酶阳性对照株：产气杆菌
精氨酸脱羧酶阴性对照株：产气杆菌
㈢形态观察：
GS：革兰阴性细长直杆菌，多呈单个分散存在
㈣血清学实验：
先用A-F多价血清检查，如凝集，则分别用下述H因子血清检查第一相抗原。

A群： a B群： b
D群：d
注意:如实验时，待检菌与多价血清补凝集，因考虑是否有Vi抗原阻碍凝集的可能，可在玻璃试管内用生理盐水将细菌制成浓悬液，放入沸水中15-30分钟，冷却后再次做凝集试验。

因Vi抗原能阻断O凝集，而煮沸处理能破坏菌体表面Vi抗原，仅出现单相H抗原时，需用位相分离的方法诱导出另一相抗原后再进行检查。