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课程名称：微生物学检验技术

授课专业：医学检验

学时：4学时

实验十三沙门菌属和变形杆菌属检验

( Salmonella test and Proteus test)

一、实验目的

1.通过模拟临床标本，模拟临床情景，培养学生应用知识和技能，独立思考，学会发现问题、分析问题和解决问题，培养学生的综合能力。

2.掌握沙门菌属、变形杆菌属的生物学特性、检验程序及鉴定方法。

二、实验设计及安排

㈠模拟标本：血液(正常血液中分别加入3种沙门菌和大肠杆菌，并编成1、2、3、4号。

㈡实验分组：2人为一组，每组鉴定一种标本，让学生自己进行实验。

㈢实验教学过程：

第一天

1.布置任务（检验程序设计、增菌培养、看书、查找相关沙门菌检验、血培养的资料）

2.发标本

3.教师需提供的材料：增菌液

第二天：增菌结果观察，涂片染色镜检、分离培养

1.教师需提供的实验材料：

培养基：SS，EMB

试剂： 0.5%美蓝水溶液，2%伊红水溶液，20%乳糖水溶液等

其他：无菌平板， 1ml无菌吸管，5ml无菌吸管，吸头若干，革兰染液，玻片，显微镜，镜油，擦镜纸，电吹风等

2.教师提示：细菌生长的现象；取菌操作需严格无菌。

第三天：分离培养结果观察、涂片染色镜检、初步生化反应。

1.教师需提供的材料

培养基： KIA,MIU，半固体，蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，枸盐酸盐琼脂斜面培养基，硝酸盐等

试剂：20%尿素水溶液，0.4%酚红水溶液，1%溴麝香草酚兰酒精溶液，20%葡萄糖水溶液等

其他：无菌中号试管，无菌小号试管，1ml无菌吸管，5ml无菌吸管，吸头若干，斜面板，革兰染液，玻片，显微镜，镜油，擦镜纸，电吹风等

2.学生最容易出现的问题：不能分析选择培养基上出现不同的菌落；染色结果不正确。

3.教师提示：SS、EMB的结果分析结合这两种培养基的原理来解释

第四天：生化反应结果观察，最终鉴定

1.教师需提供的材料

靛基质试剂，甲基红试剂，VP试剂（40%KOH肌酸溶液）

沙门菌属诊断血清

2.学生最容易出现的问题：各项生化反应的结果判断；进行血清学诊断的方法及步骤;根据片面的实验结果做最终结论。

3.教师提示：生化反应结果要结合培养基的成分、原理进行分析、判断；细菌的最终鉴定要综合形态染色、菌落性状、生化反应和血清凝集的各项实验结果。

三、实验报告：

1.写出检验程序；

2.详细描述实验结果并分析；

3. 结果报告；注意列出各种细菌的鉴定依据。

四、实验小结：

㈠实验准备

1.标本1：伤寒沙门菌+大肠杆菌

标本2：甲型副伤寒沙门菌+大肠杆菌

标本3：乙型副伤寒沙门菌+大肠杆菌

标本4：变形杆菌+大肠杆菌

2.培养基：

SS,EMB,KIA,MIU，半固体，蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，枸盐酸

盐琼脂斜面培养基，硝酸盐等

3.试剂：

20%尿素水溶液，0.4%酚红水溶液，1%溴麝香草酚兰酒精溶液，0.5%

美蓝水溶液，2%伊红水溶液，20%乳糖水溶液，20%葡萄糖水溶液等靛基质试剂甲基红试剂VP试剂（40%KOH肌酸溶液）

沙门菌属诊断血清：

4.其他

无菌平板，无菌中号试管，无菌小号试管，1ml无菌吸管，5ml无菌吸管

吸头若干，斜面板

革兰染液，玻片，显微镜，镜油，擦镜纸，电吹风等

㈡以学生自己实验为主，从程序设计到结果报告，独立完成。老师可以根据情况给出一些提示和建议。实验过程中，教师最好是不直接回答学生的提问，应启发学生对结果的分析和思考。

（三）通过对两类细菌的同时检验，教师应指出沙门菌和变形杆菌的异同，帮助学生掌握两属细菌的主要特性。

五、实验结果

㈠菌落观察：

⒈SS平板：

圆形，凸起，边缘整齐，光滑，湿润半透明的无色小菌落

⒉EMB：

圆形，凸起，边缘整齐，光滑，湿润半透明的无色中等大小的菌落

㈡生化反应：

KIA

斜面底层产气硫化氢伤寒杆菌 K A + +（-/+）

甲型副伤寒沙门菌 K A + +（+/-）

乙型副伤寒沙门菌 K A + +（++）

变形杆菌 K A - +/-

鸟AA脱羧酶赖AA脱羧酶 C M VP 伤寒杆菌 - + - + - 甲型副伤寒沙门菌 - + - + - 乙型副伤寒沙门菌 + + + + - 变形杆菌 - - + + -

MIU

M I U

伤寒 / 副甲/副乙 + - -

变形杆菌 + + +

附：氨基酸脱羧酶试验

1.原理:

某些细菌具有特异性脱羧酶,能作用于氨基酸的羧基部位生成碱性的胺类和CO2,使培养基中的溴甲酚紫指示剂变紫色(酸黄碱紫).加石蜡油是为了造成一个厌氧环境,因为只有在厌氧环境下生成的胺才稳定.

2.应用:

主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌属的赖/鸟氨酸脱羧酶均为阳性。

赖氨酸脱羧酶阳性对照株：产气杆菌

精氨酸脱羧酶阴性对照株：产气杆菌

㈢形态观察：

GS：革兰阴性细长直杆菌，多呈单个分散存在

㈣血清学实验：

先用A-F多价血清检查，如凝集，则分别用下述H因子血清检查第一相抗原。

A群： a B群： b

D群：d

注意:如实验时，待检菌与多价血清补凝集，因考虑是否有Vi抗原阻碍凝集的可能，可在玻璃试管内用生理盐水将细菌制成浓悬液，放入沸水中15-30分钟，冷却后再次做凝集试验。因Vi抗原能阻断O凝集，而煮沸处理能破坏菌体表面Vi抗原，仅出现单相H抗原时，需用位相分离的方法诱导出另一相抗原后再进行检查。