随机引物标记探针
高中生物中常见的探针种类及应用
高中生物中常见的探针种类及应用核酸探针分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸及探针。
一、D N A探针D N A探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链D N A 或单链D N A探针。
现已获的D N A探针种类很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞D N A探针，这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。
D N A探针（包括c D N A探针）有三大优点：第一，这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。
其次，D N A探针不易降解（相对R N A而言），一般能有效抑制D N A酶活性。
第三，D N A 探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、P C R标记法等，能用于同位素和非同位素标记。
二、c D N A探针c D N A是指互补于m R N A的D N A分子。
c D N A是由R N A经一种称为逆转录酶的D N A聚合酶催化产生的。
携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后，病毒R N A在逆转录酶的催化下转化成双链c D N A，并进而整合入宿主细胞染色体D N A分子，随宿主细胞D N A复制同时复制，这种整合的病毒基因组称为原病毒。
在静止状态下，可被复制多代，但不被表达，故无毒性，一旦因某种因素刺激而被活化，则该病毒大量复制。
如其带有癌基因，还可能诱发细胞癌变。
三、R N A探针R N A探针是一类很有前途的核酸探针，由于R N A是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。
早期采用的R N A探针是细胞m R N A探针和病毒R N A探针，这些R N A是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受多种因素的制约。
这类R N A探针主要用于研究目的，而不是用于检测。
四、寡核苷酸探针前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。
Fish探针标记方法大全
探针标记方法大全1、DNA的缺口平移法缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。
该技术可以制备序列特异的探针。
当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。
但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。
此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。
2、DNA的随机引物法这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。
这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。
由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。
DNA片段的大小不影响标记的结果。
标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。
标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。
随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。
随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。
3、RNA的体外转录法体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。
这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。
4、RNA的寡脱氧核苷酸法克隆质粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。
这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。
荧光定量PCR—引物与探针caoqiansheng
荧光定量PCR—引物与探针caoqiansheng2020-08-12 00:001.引物设计的基本原则是什么？引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
引物长度一般在15-30碱基之间。
引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72 ℃。
引物3’端要避开密码子的第3位。
引物3’端不能选择A，最好选择T。
碱基要随机分布。
引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物5’端和中间△G值应该相对较高，而3’端△G值较低。
引物的5’端可以修饰，而3’端不可修饰。
扩增产物的单链不能形成二级结构。
引物应具有特异性。
2.Tm值：Tm值的概念：DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，亦即DNA 变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为 DNA 的解链温度(Tm)。
长度为20 mer及以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)。
但这个公式只适用于14~20个碱基的引物，引物的TM值还与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲溶液的离子强度等有关。
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 0.41(% of GC) – 675/L + 81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量；% of GC = GC个数/引物总碱基数3.常见引物修饰修饰说明磷酸化Phosphorylation5'磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。
3'磷酸化可抗3'外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。
生物素Biotin引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。
地高新Digoxigenin地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置，杂交的地高新探针可以由抗地高新抗体来检测。
地高新标记的探针可用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂交（Southern blotting）、DNA-RNA杂交（Northern blotting）、斑点杂交（Dot blotting）、克隆杂交、原位杂交以及酶联免疫分析（ELISA）。
PCR和随机引物标记探针的方法比较
） Ｓｙ基 因保 守 区进 行 地 高辛 标 记 ， 探 讨 了它们 的 ｒ 并
的优 缺点 ， 旨在 用 非 放 射性 标 记 的 探 针 取 代 放 射 性 标
记 的探针 进行 Ｓｕｈ ｒ 交研 究 。 ｏ ｔｅｎ杂
ｌ 材 料
１ １ 实 验材 料 ．
昆 明小 白 鼠、 欧洲 田 鼠 （ ｃ ｔ ｌ 一 Ｍｉ ｏｕ ａｖ ｒ ｓ ａ
ＨＭＧ—ｂ ｘ中 ２ ２ ｐ大小 的片 段 。引物 碱基 序 列 如下 ： ｏ ０ｂ Ｐ（ ｕ ） 向 弓 物 ： ｌ５ Ｍ ｓ正 ｆ Ｐ ～Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ
Ａ ＴＧ Ａ Ｔ 一 反 向引物 ： ２５ －Ａ Ｔ３＂ Ｇ ３＂ Ａ Ｃ ３， Ｐ ， Ｇ Ｇ Ｇ ＴＡ ｑ ｑ
２ ２ Ｐ Ｒ扩 增 Ｓｙ基 因并 测序 ． Ｃ ｒ Ｐ Ｒ反应体 系 为 １ Ｃ ｕｆ Ｃ ０ｘ Ｒ ｂ ｆ ｒ Ｌ；Ｎ Ｐ ； Ｐ ｅ ５ ｄ Ｔ ｓ Ｌ ５ 正 、 向引物 各 ０ ５ ； 因组 Ｄ Ａ ５ ； ａ Ｎ 聚 反 ． Ｌ 基 Ｎ Ｌ Ｔ ｑＤ Ａ 合 酶 １ 去 离 子 水 补 足 至 ５ Ｉ 。Ｔ Ｕ； ０ｘ Ｌ ｄ—Ｐ Ｒ 参 数 为 ： Ｃ ９ ℃预 变性 ５ ｉ ，４ 变性 １ ｉ ，５—４ ℃ 复性 １ ｉ ， ４ ｍｎ９ ℃ ｍｎ５ ６ ｍ ｎ ７ ℃延伸 ｌ ｉ ，０次 循 环 （ 性 温度 每 次 循 环 过 后 降 ２ ｍｎ３ 复 低 ０３ ， ３ ． ℃ 经 ０次循 环后 复性 温度 由 ５ ℃ 降至 ４ ℃ ） ５ ６ ； ９ ℃ 变ｍ ｎ ７ ℃延 伸 １ ｉ ，０次循 ｍｎ １ 环 ；２Ｃ 伸 １ ｉ。 １５ 琼脂 糖 凝胶 电泳检 测 扩 增 ７ ￣延 ０ｍｎ ． ％
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引物探针区别_国际标准_解释说明以及概述
引物探针区别国际标准解释说明以及概述1. 引言1.1 概述引物和探针在生物学和分子生物学研究中起着至关重要的作用。
它们是使用特定序列来检测或扩增DNA或RNA分子的小片段。
通常情况下，引物和探针被设计成与目标DNA或RNA序列互补。
1.2 文章结构本文将详细介绍引物和探针的定义及其作用，并对它们之间的区别进行阐述。
同时，我们还将解释国际标准对于引物和探针的规范并对相关条款进行说明。
最后，我们将总结引物和探针的区别以及它们在不同应用场景中的作用，并提出对国际标准的评价与建议。
1.3 目的本文旨在帮助读者更好地理解引物和探针的概念、作用以及它们之间的区别。
此外，通过解释国际标准对于引物和探针的规范要求，了解如何正确地设计和使用这些分子工具。
通过阐明引物和探针在科学研究中的重要性，可以提高读者对于这些技术应用的认识水平，并为进一步开展相关研究提供基础知识。
2. 引物和探针的定义及作用2.1 引物的含义和作用引物是指在DNA分子复制、扩增以及序列测定等实验中，用于特异性识别并结合到目标DNA序列上的短链寡核苷酸。
引物通常由20-30个碱基组成，其序列应与目标DNA序列互补或部分互补，在实验过程中起到引导扩增反应、选择性检测目标序列等作用。
引物在聚合酶链反应（PCR）中起特异性识别某一目标基因片段的作用，通过与目标DNA序列互补配对形成稳定的引物-模板复合体，为DNA聚合酶提供一个起始点进行扩增。
引物的设计需要考虑多个因素，包括GC含量、长度、配对形式和温度等参数，以确保引物能够高效地结合目标序列而不与其他非特异性序列杂交。
2.2 探针的含义和作用探针是指在基因组学研究、荧光原位杂交等实验中使用的一类带有特定报告信号（如荧光染料或放射性同位素）的核酸分子。
探针通常由20-30个碱基组成，可以与目标DNA或RNA序列特异性结合，并通过检测信号来定位和识别目标序列。
探针的设计需要依据具体实验需求确定，可以是荧光探针、原位杂交探针、Northern分析中使用的RNA探针等。
探针标记
核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
第四节非放射性标记的核酸探针放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。
目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。
酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。
化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA 或RNA分子上。
随机引物标记探针的原理
随机引物标记探针的原理
随机引物标记探针的原理是利用引物（通常是随机序列）与待标记的探针的序列进行杂交反应，将引物与探针序列互相结合，并用标记物（如荧光染料或放射性同位素）对引物进行标记。
标记后的引物可以用于检测和定量待标记探针的存在和数量。
具体步骤如下：
1. 设计引物：引物通常为短序列的寡聚核苷酸，可以是完全随机的或部分随机的，以提高杂交反应的特异性。
2. 合成引物：根据设计的引物序列，合成相应的引物。
3. 标记引物：将引物与标记物（如荧光染料）进行化学修饰，将标记物连接到引物上。
4. 杂交反应：在杂交反应体系中，将标记的引物与待标记的探针序列进行杂交，使引物与探针互相结合。
5. 检测：利用标记物的性质（如荧光）对标记的引物进行检测和定量，从而间接检测和定量待标记的探针序列的存在和数量。
随机引物标记探针的优点是简单、快速，适用于大规模的探针标记，并且具有较高的特异性和敏感性。
然而，随机引物的选择可能会引入一定的非特异性杂交信号，在实验设计和数据分析时需要注意控制和纠正这些影响。
探针的标记及产物的纯化
1 mM CY-dUTP
2μl
共十五页
反转录 标记 (zhuǎn lù)
• 5. 混匀上述试剂后，于37℃保温5min 或26℃保温10min
• 6. 42℃保温60min • 7. 补加反转录(zhuǎn lù)酶0.75μl，然后
继续于42℃保温30min • 8. 取出PCR反应管，-20℃避光保存
• 5. 加1μl大肠杆菌DNA聚合酶I大片 段；
• 6. 37℃温浴1-2 hr，然后加5μl 0.5M EDTA （pH8.0）来终止(zhōngzhǐ)反应
共十五页
Microcon 30 filter纯化(chún huà)
（Amicon/Millipore）
• 1. 向已终止的标记体系(tǐxì)中加入 450μl（pH7.4）TE
共十五页
随机 引物标记 (suí jī)
• 3. 加5μl 10×dNTP混合物
– 10×dNTP混合物: 1.2mM dATP – dGTP – dTTP 0.6mM dCTP 10 mM Tris （pH8.0） 1 mM EDTA
共十五页
随机 引物标记 (suí jī)
• 4. 加3μl CY5-dCTP或CY3-dCTP （Amersham，浓度为1 mM）；
150μl 100%乙醇(yǐ chún)
-20℃ ，30min
13000 r/min离心 • 2. 75%乙醇洗涤3次，干燥备用
共十五页
内容(nèiróng)总结
探针的标记和标记产物的纯化(chún huà)。探针的标记和标记产物的纯 化(chún huà)。9. 用双蒸水调整探针混合物，使体积为12μl，然后加入 2.55μl 20×SSC（使终浓度为3.4×）和0.45μl 10%SDS（使终浓度为 0.3%） 。比较基因组杂交中基因组DNA可用Gibco/BRL的BioPrime DNA标记试剂 盒中简单的随机引物标记。13000 r/min离心
核酸标记各种标记物及标记方法
1．核素标记物放射性核素是目前应用最多的一类探针标记物。
放射性核素的灵敏度极高，可以检测到10-14～10-18克的物质，在最适条件下可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。
常用标记核酸探针的核素有32P、3H、35S，在Southern印迹杂交中以“P最常用。
还应根据标记方法的不同选择相应标记方位的核素，一般情况下，大多数标记方法需要的是a—32P，而5，末端标记必须是r-32P。
2．非放射性标记物多年来，科学家们致力于寻找一些安全、可靠、灵敏度高的物质代替放射性核素用于核酸分子杂交，并取得了一定的进展，部分非放射性标记物已在国内外逐步推广使用。
其优点是无放射性污染，可以较长时间存放，从而更便于临床诊断等方面的应用。
但此类非放射性标记物的缺点是灵敏度及特异性都不太高。
根据其检测方法，非核素标记物可分为以下4类。
(1)半抗原：生物素(biotin)和地高辛(DIG)都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫学检测，根据显色反应检测杂交信号。
这两种物质是目前使用较普遍的非核素标记物。
(2)配体：生物素不仅是半抗原，故可用生物素与亲和素反应进行杂交信号的检测。
(3)荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以发出紫荧光进行观察，主要适用于细胞原位杂交。
(4)化学发光探针：一些标记物可与某种物质反应产生化学发光现象，通过化学发光可以像核素一样直接使X线胶片上的乳胶颗粒感光。
化学发光探针可能是今后非核素标记物研究的主要方向。
三、标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上酶促标记法(一)切口平移法(nick translation)1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将旧链从5′末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP 连接到切口的3′末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA 链中(二) 随机引物法其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5′→3′方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。
杂交技术
注意：Southern印迹后的滤膜仍需进行固定处理， 对NC膜可用80℃真空烘烤2小时，对尼龙膜还可 用短波紫外线(波长254nm)照射几分钟。
4、Southern印迹的操作过程
(1) 酶切DNA,，电泳分离，使DNA原位变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(NC膜)上。 (3) 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性
3.2.2 杂交
blot一词，有不同翻译，有人叫“印迹 法”，也有人翻译为“斑渍法”，更为 普通的是直接称为Southern blot)
一、种类
杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。 固相杂交技术目前较为常用，先将待测 核酸结合到一定的固相支持物上，再与 液相中的标记探针进行杂交。固相支持 物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或尼龙膜(nylon membrane)。
Western 印迹法又称蛋白质印迹技术，它是70年 代末，80年代初发展起来的一种蛋白质检测新 技术。其基本过程
2、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western
Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白 质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例 如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸 附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学 活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特 异性目的基因表达的蛋白成分。 该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（二）、Southern印迹(Southern blot)
一、核酸分子探针的标记
一、核酸分子探针的标记
(labeling of probe)
（一）概述
在化学及生物学意义上的探针(probe)，是 指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分 子，并可以被特殊的方法所探测。
例如抗体—抗原、生物素—抗生物素蛋白、 激素—受体等的相互作用都可以看作是探针与 靶分子的相互作用。
所谓核酸分子探针则是指特定的已知 核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交， 然后用特定的方法进行杂交信号的检测。从 而可以用于待测核酸样品中特定基因序列 的探测。
以下介绍最常用的几种固相支持物。
(1)硝酸纤维素滤膜(nitrocellulose filter membrane)： 优点： ➢杂交信号本底较低; ➢非特异性地吸附蛋白质的作用较弱，因此特别适合
于那些涉及蛋白质作用(如抗体和酶等)的非放射性 标记探针的杂交体系。
缺点：
因为硝酸纤维素膜是依靠疏水性相互作用结合DNA的， 这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜的进程， DNA会慢慢脱离硝酸纤维素膜，特别是高温情况下， 从而使杂交效率下降。因此不太适宜于在同一膜上重 复进行杂交。再者，硝酸纤维素膜质地较脆，特别是 经烘烤后，操作不方便，须特别小心。
（五）探针的非放射性标记法
按照标记方法的不同，现有的非放射性标记物主要有 两种类型： 1.标记物预先已连接在NTP或dNTP上，因此可像放射 性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到核酸 探针上，如生物素、地高辛等； 2.标记物直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上。 此后一类标记物标记过程更为简单，可能是今后研究 发展的主流。
Hale Waihona Puke 杂交的双方是待测核酸序列及探针。 待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也 可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。 将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与 探针杂交(膜上印迹杂交)，也可直接在细 胞内进行(细胞原位杂交)。
随机引物标记探针
分子杂交及相关技术
分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的 靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种 分子的过程 。 分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交 及蛋白杂交等。 分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定 复杂的靶DNA中同源的DNA片段。
1
双链probe或DNA解链，主要取决于： 1．链的长度：链越长，需要的 能量多才 能解链； 2．碱基成分：GC含量高，较难变性； 3．化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰 胺，尿素破坏双链
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随机引物标记探针
DNA
32p-dNTP,Bio-Dntp 6bp primer
Klenow,dNTP 变性-复姓
3` 5` 5`
5` 3`
13
一、DNA杂交常用的方法
（一）.Southern blቤተ መጻሕፍቲ ባይዱt
1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因 分析方法。
10
Nick Translation
DNA 32P-dNTP Bio-dNTP
OH
dNTP ，DNA酶I， DNA聚合酶I p
OH+
P
P
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2、随机引物法（6核苷酸引物标记法）
原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的 Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。 Klenow具有5’→ 3’聚合酶活性。 被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模 板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为 起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。反 应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的 DNA链中，探针即被标记。
1、原理和步骤:
DNA探针制备作业指导书
DNA探针制备作业指导书实验目的了解双链DNA的缺口平移和随机引物标记法的原理以及掌握其技术。
实验原理在基因分析的杂交方法中几乎都用到同位素或非同位素标记的探针。
制备探针的方法有DNA缺口平移标记、随机引物标记、DNA末端标记、寡核苷酸末端标记、引物延伸法标记、RNA探针标记以及非同位素标记等。
每一种标记方法有各自的特点和适用范围。
缺口平移标记法原理DNA酶I是一种核酸内切酶，它可在DNA两条链上随机酶切形成缺口，缺口的3＇端为3＇-OH。
DNA聚合酶I具有5＇→3＇外切酶活性和依赖引物和模板的5＇→3＇聚合酶活性。
在缺口上DNA聚合酶Ⅰ沿5＇→3＇将缺口端的5＇-单核苷酸切除，同时将游离的dNTP加在缺口的3＇-OH上，结果使缺口沿DNA平移(Nick translation)。
如果添加的dNTP中含一种或几种[α-32P]dNTP，那么双链DNA就带上很高比活度的放射性(108cpm／μg)，掺入效率>65％。
随机引物标记法原理随机引物标记法DNA用量少(25ng)，同位素掺入较高(60％左右)，最高放射比活度超过1×109cpm／μg。
随机引物结合于线性变性单链DNA模板的多个位点，在Klenow酶作用下进行5＇→3＇引物延伸反应，标记同位素的dATP就随此过程掺入，一般可合成250—300 bp的标记探针(模板大于500bp)。
实验内容缺口平移标记法材料DNA酶(DNaseI)、DNA聚合酶I(Promega公司试剂盒提供按一定比例混合的混合物)。
[α-32P]dATP、dGTP，dCTP，dTTP(各300μmol／L)；缺口平移缓冲液(10×)，待标记DNA 1μg，终止液(0．5mol／LEDTA)。
方法(1)混合下列试剂：试剂体积10μldCTP、dGTP、dTTP混合液各30μmol／L缺口平移缓冲液10×5μlDNA 1μg[α-32P]dATP(100mCi/ml) 5μlDNA酶I和DNA聚合酶I混合液5μlddH2O 24μl总计50μl(2)15℃反应60min。
随机引物引导的乙型肝炎病毒DNA探针标记和重复杂交
随机引物引导的乙型肝炎病毒DNA探针标记和重复杂交吕凌;姚集鲁;彭文伟【期刊名称】《中山医科大学学报》【年(卷),期】1992(13)2【摘要】随机引物引导的探针标记足一种比切中移位更为有效的探针标记方法,作者应用这种方法制备^(32)P标记的乙型肝炎病毒(HBV)DNA探针。
经液闪测定,探什比放射性为lxl0^(9)cpm/ug,(32)P掺入率为71.43％,均比切口移位有关参数上限高出数倍。
将这种探针用于尼龙膜载样杂交,在每100cm^(2)的样膜所加探针放射性强度为5 x10^(6)cpm、浓度为20ug/L条件下,放射自显影24小时即可出示清晰结果。
并且检出HBV DNA灵敏度达0.1Pg,检测HBSAg和HBCAg双阳性血清,HBVDNA阳性率达87％(26/30)。
用这种方法还制备地高辛素标记的HBV DNA探针,并在探针浓度为20 ug/L条件下,对^(32)p探针杂交过的样膜重复杂交。
结束检出HBV DNA灵敏度为0.05 Pg,检测HBsAg和HBeAg双阳性血清,HBV DNA阳性率为73％(22/30)。
上述结果表明随机引物引导标记可用于制备高比放同位素探针和高敏感性非同位索探针。
前者对研究微量基因必不可少,后者对基层单位常规开展检测非常重要。
【总页数】4页(P21-24)【关键词】乙肝病毒;DNA探针;重复杂交【作者】吕凌;姚集鲁;彭文伟【作者单位】中山医科大学附属第三医院传染病科【正文语种】中文【中图分类】R373.21【相关文献】1.随机引物引导地高辛素标记乙型肝炎病毒DNA探针 [J], 吕凌;徐林2.应用随机引物法制备32P标记的HBV DNA探针 [J], 吕凌;姚集鲁3.125Ⅰ标记HBV-DNA探针分子杂交检测乙型肝炎病毒DNA [J], 王瑾瑛4.随机引物法标记放射同位素DNA探针及其应用 [J], 王卫民;洪敏5.随机引物引导的乙型肝炎病毒NDA探针标记和重复杂交 [J], 吕凌;姚集鲁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
常用核酸探针标记方法
常用核酸探针标记方法1、切口平移法（nick translation）原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。
利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。
同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。
图1 切口平移法原理示意图特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。
但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。
双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。
2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。
3）DNA模板要用纯化过DNA2、随机引物法（random priming）原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。
当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。
图2 随机引物标记法原理示意图特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。
2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。
3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。
按标准方法得到的标记产物长度一般为200-400bp。
3、末端标记与切口平移法和随机引物法不同，DNA末端标记法并不将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5’或3’端）进行部分标记。
其特点是可得到全长DNA片段，DNA片段并非均匀标记，标记活性不高。
核酸探针的标记与分子杂交
核酸探针的标记与分子杂交一．核酸分子杂交具有高度特异性和灵敏性，被广泛应用于基因克隆的筛选和鉴定、特定基因序列的定性和定量检测、基因突变分析等方面。
类型：根据杂交体系的不同分为Southern杂交膜上印迹杂交Northern杂交斑点杂交染色体原位杂交固-液相杂交原位杂交细胞原位杂交夹心杂交其他亲和捕捉杂交链取代杂交液相杂交二．膜上印迹杂交法（二）选择核酸探针的原则：必须具有高度序列特异性，优先选择基因编码序列，尽量不要含有内含子，特别是高度重复序列。
32P（放射性强，β粒子能量高，适合于各种印迹杂交）35S（放射性较弱，但射线散射作用弱，比较适合于需要高分辨率的放射性核素DNA序列测定等方法）3H（放射性极低，但成影分辨率最高，最适合于细胞原位杂交）还有14C、125I等1.核酸探针标记物半抗原荧光素非放射性标记物配体化学发光物等2.核酸探针标记法很多，其中最重要的是酶促标记法，它大约也有十多种，包括切口平移法、随机引物法、末端标记法、cDNA探针标记法、RNA探针标记法、单链DNA探针标记法（1）切口平移标记法基本原理是：集微量的DNA酶1在DNA双链上随机形成单链缺口，在大肠杆菌DNA聚合酶1的作用下，将旧链从切口处逐步切除，同时合成新链，反应液中含有的放射性核素标记的核苷酸即插入到新合成的DNA链中，经纯化变性后，即得到放射性标记的DNA探针。
在含有1μgDNA 探针溶液中加入5μL 10×切口平移缓冲液（包括0.5mol/L Tris·Cl<pH7.2>, 0.1mol/L MgSO4，1mmol/LDTT, 500μg/mL BSA），加入除标记核苷酸以外的三种dNTP溶液，浓度为20mmol各1μL，在有机玻璃防护瓶保护下，加入100微距放射性核素标记的核苷酸溶液，加入含微量DNA酶1和5单位大肠杆菌DNA聚合酶1溶液，补足水容量为48μL，置14～16℃水浴中保温1～2小时。
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例:PKU产前诊断
Ⅰ 1 Ⅱ 1 2 正常探针 突变探针 2
Ⅱ2进行产前基因诊断 结果分析Ⅱ2为正常个体
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四、Northern blot
是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基 因探针分析基因的转录水平。 1、原理及步骤：提取 T、Cell 总 RNA ↓ 提纯分离mRNA ↓ 琼脂糖凝胶电泳分离RNA ↓ 转移至硝酸纤维素膜 ↓ 杂交检测
第二节
分子杂交及相关技术
分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的 靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种 分子的过程 。 分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交 及蛋白杂交等。 分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定 复杂的靶DNA中同源的DNA片段。
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双链probe或DNA解链，主要取决于： 1．链的长度：链越长，需要的 能量多才 能解链； 2．碱基成分：GC含量高，较难变性； 3．化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰 胺，尿素破坏双链
（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，
AS质已完全明确，可 以合成ASO探针。探针通常为20bp左右，标记后用于杂交 检测。 检测点突变时一般需合成两种探针： 设计：正常探针 5’-AGT-3’ 与正常基因序列杂交 稳定而不与突变基因杂交； 突变探针 5’-AAT-3’ 与突变基因序列杂交 稳定而不与正常基因杂交； PCR技术可结合ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测 扩增后的产物——突变基因检测。
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二、探针的标记
将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。 常用于标记探针的标识物： 同位素：32P , 35S , 3H-dNTP等； 非同位素：地高辛-dNTP ，生物素-dNTP。 常用的标记方法：
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1、缺口平移法 （Nick Translation）
原理及过程： 反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然 后利用DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性，在缺 口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合 酶I有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入 底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随 着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机 掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即 被标记。
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随机引物标记探针
DNA
32p-dNTP,Bio-Dntp 6bp primer
Klenow,dNTP 变性-复姓
3` 5` 5`
5` 3`
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一、DNA杂交常用的方法
（一）.Southern blot
1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因 分析方法。
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（二）特异探针的来源
1、基因组 探针： 从已建立的 基因组 中筛选和分 离所需的目 的基因。 克隆 扩增 大量的 DNA探针
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DNA 克隆
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2、cDNA probe :从已 构建的cDNA 中筛查 和分离目的基因探针。
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3、寡核苷酸探针
根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段。 一般长约15～50个bp。多数探针的制备都通过分子 克隆的方法获得。 克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个 体、细胞或分子的大量复制品。
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West Blot
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Nick Translation
DNA 32P-dNTP Bio-dNTP
OH
dNTP ，DNA酶I， DNA聚合酶I p
OH+
P
P
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2、随机引物法（6核苷酸引物标记法）
原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的 Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。 Klenow具有5’→ 3’聚合酶活性。 被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模 板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为 起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。反 应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的 DNA链中，探针即被标记。
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一、杂交探针的获得
是指一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的 核苷酸序列。 Probe可以是整个基因，或是基因的一部分， 是DNA，也可以是RNA。
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（一）制备特异性探针所需要的基 本条件
1.被检基因结构清楚； 2.有明确的基因产物; 3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某 一基因对表型的反应。 具备以上条件之一就可以制备特异性基因探 针。
鉴定核酸序列的简便方法。 1、原理及步骤：提取T、Cell DNA ↓ 点样品至膜、干燥、固定 ↓ 探针、DNA变性、杂交 ↓ 洗膜、放射自显影 ↓ 结果分析
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DNA 样品
点样
Probe-32P
检测 2、应用： 1）混合样品DNA鉴定 2）基因缺失检测 3）基因表达分析
A B 1 2 3 4
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Norther Blot
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2、应
用：
（1）.检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁 移率估计）； （2）.mRNA的含量，即基因表达高低。（密 度扫描仪，定量分析）
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五、Western blot
是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。 原理及步骤： T or cell ↓ 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白 （SDS-PAGE ）↓ 转移（印迹）于硝酸纤维素膜 ↓ 加抗体检测某种特异性蛋白质
1、原理和步骤:
提取T 、Cell DNA 限制酶消化 DNA片段 电泳分离 变性转移至尼龙膜 变性、杂交 洗膜、放射自显影、结果分析
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Southern Blot
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2、应
用:
(1)基因组结构分析： 如缺失、插入、倒位等的检测 (2)RFLP连锁分析
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(二).斑点杂交 (dot and slot hybridization)