生物膜特征指标测定方法

第2章生物膜特征指标测定方法

选择合适的生物膜指标进行测定和评价非常重要。本研究课题主要的生物膜指标包括：生物膜量、生物膜胞外聚合物的量、活性生物量和生物膜的活性。下面分别介绍它们的测定方法。

2.1 生物膜量

2.1.1 生物膜的剥落

生物膜固定在载体的表面，很难直接测量生物膜干重。因此，评价载体生物膜量前，必须首先把生物膜从载体表面剥落下来。生物膜的剥落方法很多，其中，有效剥落方法主要有机械剥落、超声剥落和超声加化学剥落。在生物膜剥落在生物膜的多项分析中起关键作用，剥落回收率的高低直接影响其他分析的精确度。

（1）机械剥落。对生物膜载体使用简单的机械方法，使生物膜脱离载体的表面。这种剥落方法，简单、易于操作。但该法却不适用于表面具有孔隙或表面粗糙度较大的载体。生物膜机械剥落方法在生物膜反应器中得到广泛应用。

（2）超声剥落。利用超声波冲击剥落生物膜。可根据具体情况，选择合适的超声波工作功率。

（3）超声加化学剥落。考虑到生物膜胞外聚合物对生物膜的胶联特性，若单纯使用超声波进行生物膜剥落，一般需要超声波的功率较高，作用时间较长。Liu（1994）提出可将生物载体首先置于1M 的碱液中，并水浴30 分钟，温度控制在60～80℃。经处理后，生物膜与载体表面的胶联度大大降低。这时，再经过超声波处理，可在较低功率及较短时间作用就可得到非常好的剥落效果。

2.1.2 评价生物膜量的指标

（1）生物膜干重。生物膜剥落后，含有生物膜的溶液经事先称重的0.45μm滤膜过滤，把滤膜置于温控105℃的干燥箱内，干燥至恒重，过滤前后的重量之差即为剥落生物膜干重。生物膜干重是生物膜参数中最为常用的指标。

（2）生物膜挥发性干重（VSS）。生物膜干重反映的是生物膜总量。生物膜的生物化学活性只与活性生物量相关，而生物膜挥发性干重可以反映生物膜活性生物量。为了获得较准确的活性生物量信息，在生物膜的研究中，常常选用可挥发性生物膜重( Ameziane et al., 2002)。在生物膜干重测量后，将样品置于550℃的马福炉内灼烧至恒重，总干重的失重即为可挥发性生物膜部分。挥发性生物膜重量反映了生物膜中有机组分的含量。

（3）生物膜TOC。细胞的结构骨架主要是有机碳组成。通过测定生物膜总有机碳含量，即TOC，可间接了解生物膜量的变化。特别是对于硝化生物膜等增长缓慢的微生物，其生物膜量一般较少，不便用直接干重法测量。在这种情况下，生物膜TOC 的分析更具有准确性。目前，TOC 的分析已经仪器化。

（4）生物膜COD。生物膜的化学需氧量（COD）可间接描述生物膜量，在生物膜反应器动力学研究中应用较广(Liu et al., 2007)。剥落后的生物膜样品可由传统法测定生物膜COD,也可应用半自动法测定（Jirka et al,1975）。

2.2 生物膜胞外聚合物

生物膜胞外聚合物（EPS）是生物膜中围绕在细菌周围的高度含水的多聚大分子,其组成和物理化学属性决定生物膜的粘附、构型及生物学特性；EPS 由多种有机物组成，包括多糖、蛋白质、核酸、磷脂、褐藻酸、腐质等，主要是多糖和蛋白质(蒲晓芬等, 2005)。在生物膜研究中，常常用生物膜中的胞外聚多糖和蛋白质的量代表生物膜中EPS。

2.2.1 胞外聚多糖

聚多糖（Polysaccharide）是细胞增长过程中的一种代谢物质，在细胞固定以及形成生物膜过程中起着重要作用。多聚糖在细胞的分泌、积累与细胞活性及其数量有关，它在生物膜研究中是经常测定的参数之一。多聚糖的测定可根据Dubois 等人（Dubois et al, 1956）提出的苯酚-硫酸比色法，具体方法如下：生物膜经剥落后悬浮于溶液中，将其pH 调到中性，完全混合；取1mL 悬浮样品放入清洁试管内，然后加入1mL50g ·L-1 的苯酚溶液，经10～20s 的振荡混合后，再加入5mL95%的硫酸溶液，让其在黑暗中反应10min.；反应结束后，再振荡10s；最后，置试管于20～30℃水浴中10min.;水浴后，在490nm 处比色分析。苯酚-硫酸比色法在确定生物膜多聚糖研究中已经非常成功（Belkhadir et al, 1988; Liu et al, 1994）。

2.2.2 蛋白质

与生物膜重量概念相比，生物膜中蛋白质最重要的特性在于它反映了生物膜的活性。蛋白质是活性细胞的重要组成部分。一般认为生物膜总的蛋白质的含量不超过生物膜总重的5%（Lazarova et al,1994）。目前，较为常用的细胞总蛋白质的分析方法是Bradford (Bradford,1976) 提出的，又称考马斯亮蓝法；这种方法与其他蛋白质分析方法相比具有简便、省时、准确度高的优点。具体分析方法如下：第一步要准备Bradford 试剂，取100mgBrilliant indocyanin G（考马斯亮蓝G-250）溶于50mL 乙醇中，然后加入100mL85%的磷酸溶液，轻轻震动均匀，最后加入超纯水，并定容至1000mL,然后对其过滤处理，所得到滤液即为

Bradford 试剂。经超声波加碱液剥落的生物膜样品，经加入磷酸把其pH 调到中性。完全混合生物膜悬浮液后，取1mL 样品放入清洁试管中，然后加入5mLBradford 试剂，振荡混合10s 后，让其在黑暗处反应10min.。结束后，在595 处比色分析。Bradford 所提出的细胞蛋白质分析法在好氧异养生物膜、厌氧生物膜、硝化生物膜动力学研究中应用极为广泛（Belkhadiret al,1988; Capdeville et al,1990; Chen et al., 2007）。该法的突出优点是灵敏度高、测定简便快速以及干扰物质少。

2.2.3 本课题测定胞外聚合物的方法

在本课题研究中，聚多糖的测定采用苯酚-硫酸比色法；蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法(Bradford,1976)。

2.3 生物膜的活性

虽然生物膜中的活性物质占生物膜总量的比例很小，但这些活性物质却与生物膜中的生物化学反应密切相关。了解生物膜的活性，对研究和了解生物膜的特性具有很重要的意义（Lazarova et al,1995; 刘雨等，2000）。

在本课题研究中，生物膜微生物的活性通过氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶活性测定法进行。利用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride ，TTC；Shanghai Reagent Co., Ltd, Shanghai, China)的还原性产物TTC-甲瓒(TF)的量，来表示微生物的活性。主要步骤如下：（1）生物膜样品的制备

取10g载体生物膜，用蒸馏水润洗2次，置于锥形瓶中，用玻璃珠剧烈摇动将生物膜打碎，用生理盐水20mL稀释，用玻棒搅动，使成悬液，备用。

（2）主要仪器和试剂

氯化三苯基四氮唑( TTC)-葡萄糖标准溶液:TTC分析纯0.1 g与葡萄糖l g共溶于100 mL 蒸馏水中，棕色试剂瓶保存；甲苯(分析纯)；三氯甲烷(分析纯)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCI 缓冲溶液，pH值为8．6；其它：硫化钠。

（3）标准曲线的制作

在分液漏斗中依次注入l，2，3，4，5，6 mL浓度为l g ·L-1 TTC-葡萄糖标准溶液，2 mL Tris-HCI缓冲溶液及lmL 10％Na2S新配溶液,摇匀；待溶液充分显色后，准确加入甲苯溶液5mL，振摇，完全提取TF。放置片刻；待溶液分层后，取有机溶液层, 移至lcm比色皿中,稳定2 min用752紫外分光光度计在波长485nm处，测对应的吸光度(A)值，对脱氢酶活性作图，以试剂空白作对照，绘制标准曲线。

（4）生物膜脱氢酶活性测定