真菌学实验指导

本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。

本指导书适用于生物技术和生物科学专业。

1、实验：内生真菌的分离及鉴定

···························································································3 2、实验报告基本内容要求

···························································································7 3、实验报告格式································································8

实验内生真菌的分离及鉴定

实验学时：18

实验类型：综合

实验要求：选修

一、实验目的

1.了解真菌形态的基本特征。

2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。

二、实验内容

采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。

三、实验原理、方法和手段

（一）实验原理

根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。

（二）实验手段和方法

1、内生真菌分离纯化方法

1.1样品的表面消毒及预处理

分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。

老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。

对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：

75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块

将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。

灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻

底。在快到时间之前1-2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。

1.2内生真菌的分离与纯化

将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养5块组织块）于27℃恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。观察菌丝生长情况及污染情况。培养3-4天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上。纯化3-4次以保证所得菌落为纯培养。

2、真菌的形态学鉴定方法

对分离到的内生真菌的分类鉴定主要根据宏观的培养性状（菌落形态），微观的个体形态特征及一些生物学特性进行经典分类研究。

2.1 培养性状（菌落形态）

培养基：查氏培养基（Czapek agar）、沙氏培养基和PDA培养基。

方法：将固体培养基制成平板，以点植法接钟，即用接种针尖沾取少量孢子点植在平板的中心位置，然后于25-28℃培养一定时间（通常为7天或14天）进行观察，观察时可用肉眼或借助放大镜等。

观察的要点：

大小：以菌落的直径（mm）表示。

颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。

菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。

菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。

菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。

菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。

渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。

2.2个体形态

菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑），宽度等

分生孢子梗：分支情况--简单或复杂，轮生或单生等；长短；基部粗糙或光

滑等。

产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互生或成轮生体）

分生孢子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜链或聚集成头）

2.3真菌制片方法——粘片法

胶带粘贴法：选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的胶带。取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75%乙醇固定，乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产孢结构等特征。

2.4显微摄影照片

在Motic数码显微镜下，观察并选取具典型性状特征的视野拍照、直接测量相关数据和进行描述记载。

2.5菌种的鉴定

根据描述的菌种的特征，索引分析相关文献，综合分析对比相关特征的异同，最后确定待定菌株的分类地位。

3、真菌的分子生物学鉴定方法

3.1真菌菌丝的获得

（1）固体培养基培养菌丝体

对于气生菌丝较多的真菌可以选择PDA固体培养基在培养皿上培养，在固体培养基平板上铺一层玻璃纸，27℃培养5-7天。将3-4个用培养皿平行培养的新鲜菌丝小心地刮下，收集在一起，以备进行DNA提取。在刮取菌丝体时，要注意的是不要把培养基一起刮下来，以免对提取DNA造成影响。

（2）液体培养基培养菌丝体

培养基成分与不加琼脂的PDA固体培养基成分相同。将液体培养基以100mL每瓶分装至250mL三角瓶中，用8层纱布封口。121℃，蒸汽灭菌20min。

将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中27℃、120rpm 培养5-7天。用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸馏水冲洗菌丝球5次，避免培养基中的糖类和蛋白对DNA提取的影响。40℃下烘干菌丝，但是不要过于干燥，然后进行DNA的提取。