真核转染稳定筛选标记及原理
细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）
细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：（各种转染方法的比较）除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。
其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。
聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
ura3筛选标记原理
任务名称：ura3筛选标记原理一、引言URA3筛选标记原理是一种常用的基因筛选技术，用于鉴定含有URA3基因的细胞。
URA3基因编码酵母细胞中的一种酶，该酶在合成尿嘧啶的过程中起关键作用。
通过对URA3基因进行标记，可以方便地筛选出带有该基因的细胞。
二、URA3筛选标记原理的基本步骤URA3筛选标记原理的实施主要包括以下几个步骤：2.1 构建URA3筛选标记载体首先需要构建一个包含URA3基因的筛选标记载体。
该载体通常由一个表达系统和一个选择系统组成。
表达系统主要包括启动子、转录终止子和相关调控因子，用于在宿主细胞中驱动URA3基因的表达。
选择系统一般是一个对URA3基因敏感的选择剂，例如尿嘧啶类似物5-氟库啶。
将URA3基因和选择系统构建到载体中，可以方便地检测和筛选带有URA3基因的细胞。
2.2 载体转化宿主细胞将构建好的URA3筛选标记载体转化到宿主细胞中。
转化可以通过多种方法实现，例如电穿孔法、化学法或瞬时转染法。
转化后的宿主细胞将获得URA3筛选标记载体，并在适当条件下表达URA3基因。
2.3 选择剂筛选将转化后的宿主细胞接种于含有选择剂的培养基中。
在这个培养条件下，只有带有URA3基因的细胞才能够生存下来，而没有URA3基因的细胞将被选择剂杀死。
因此，通过选择剂筛选，可以从转化的细胞中筛选出带有URA3基因的细胞。
三、URA3筛选标记原理的应用URA3筛选标记原理在生物学研究中有着广泛的应用。
以下是几个常见的应用领域：3.1 突变体筛选URA3筛选标记原理可以用于筛选突变体。
通过将URA3基因插入到目标基因中，再将该基因导入宿主细胞中，可以通过选择剂筛选出带有突变基因的细胞，从而研究突变基因的功能。
3.2 重组DNA构建URA3筛选标记原理也可以用于重组DNA的构建。
将目标DNA片段与URA3基因连接后，转化到宿主细胞中，利用选择剂可以筛选出含有重组DNA的细胞。
这种方法可以用于构建基因库或进行DNA片段的克隆。
什么是转染实验的原理
什么是转染实验的原理
转染实验是指将外源性的基因导入到受试细胞内,使其获得新的生物学功能的一种重要的分子生物学实验方法。
其基本原理是:1. 选取一个适当的载体载体是携带外源基因进入受试细胞的载体。
常用的有质粒、病毒载体等。
载体需要具备携带基因的能力,同时对细胞也要有一定的亲和力。
2. 构建重组载体将需转入细胞内的目的基因连接到载体上,构建成重组载体。
这需要运用一些基因工程手段,如restriction酶切割、连接酶连接等。
3. 转染载体入细胞有多种方法可以将重组载体送入受试细胞,如阳离子脂质体法、电穿孔法、病毒感染法等。
转染后,细胞会吸收载体。
4. 载体在细胞内表达载体进入细胞后,需要在细胞内正确表达,产生目的蛋白质。
需要载体具有组成可自主复制或整合入细胞基因组的能力。
5. 筛选成功的重组细胞不是所有细胞都会转染成功。
需要设计筛选标记,比如赋予细胞抗生素耐药性,然后用含抗生素的培养基进行筛选。
6. 鉴定转染结果需要用一些手段鉴定转染细胞是否获得了新功能,如PCR、Western blotting等检测新基因或蛋白的表达。
7. 分析转染的生物学效果观察转染基因对细胞生长、形态、功能等产生的影响,分析基因的生物学效应,这是转染实验的最终目的。
转染实验可以改变细胞的遗传特性,是揭示基因功能、发展基因治疗等的重要手段。
但每种细胞和基因都有特异性,需要设计针对性的转染方案,并严格验证转染效果。
cho细胞表达系统及筛选原理
cho细胞表达系统及筛选原理Cho细胞表达系统及筛选原理一、引言Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。
本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。
二、Cho细胞表达系统的原理Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。
Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。
1. 转染将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。
质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。
病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。
2. 选择性筛选为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。
只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。
3. 扩增和表达经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模蛋白质表达。
通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。
4. 蛋白质纯化经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。
三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。
1. 高表达水平Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。
这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。
2. 真核细胞表达与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。
这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。
3. 可选择性筛选通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。
这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。
4. 灵活性Cho细胞表达系统可以应用于多种类型的蛋白质，包括单链抗体、重组蛋白、酶等。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选是一种常用的实验方法，用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
这种方法可以用于基因功能研究、药物筛选和生物制品生产等领域。
本文将介绍稳定细胞株筛选的流程。
第一步：构建表达载体稳定细胞株筛选的第一步是构建表达载体。
表达载体是一种质粒，可以将目的基因导入到细胞中。
常用的表达载体有pCDNA3.1、pEGFP-N1等。
在构建表达载体时，需要将目的基因克隆到载体中，并加入适当的启动子和选择标记。
第二步：转染细胞转染是将表达载体导入到细胞中的过程。
常用的转染方法有热激转染、电穿孔转染和化学转染等。
在转染时，需要选择适当的细胞系和转染剂，并优化转染条件，以提高转染效率。
第三步：筛选稳定细胞株转染后，需要筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
常用的筛选方法有抗生素筛选和流式细胞术筛选等。
在抗生素筛选中，将选择标记加入到表达载体中，转染后加入相应的抗生素，只有表达目的基因的细胞才能存活下来。
在流式细胞术筛选中，将目的基因与荧光蛋白等标记融合，通过流式细胞术筛选出表达目的基因的细胞。
第四步：鉴定稳定细胞株筛选出稳定细胞株后，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法有PCR、Western blot和免疫荧光等。
在PCR中，通过扩增目的基因的特定片段来鉴定细胞株是否表达目的基因。
在Western blot中，通过检测目的基因的蛋白质表达来鉴定细胞株。
在免疫荧光中，通过检测目的基因的荧光信号来鉴定细胞株。
稳定细胞株筛选是一种重要的实验方法，可以用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
在筛选过程中，需要注意选择适当的表达载体、转染方法和筛选方法，并进行鉴定，以确保筛选出的细胞株稳定表达目的基因。
转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤
转染细胞的稳定筛选1、药物筛选前的准备药筛前应确定药物筛选浓度,不同细胞系具有不同的药物敏感度,因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。
药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡,如G418一般需要7天，而puro一般时间很短,只需要3-4天即可。
2、药物筛选注意事项（1)药筛的时间加药时间一般为转染后48h。
但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法,加药时间一般为72h空白对照加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药. (2)换液如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液,以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。
另外,随着细胞的代谢,抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。
3、克隆筛选注意事项若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法,都应该选择带有荧光较强的细胞克隆,因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞,因此最好选择带有荧光较强的细胞.若是转染的质粒不带有荧光,那么只能盲挑.不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证,验证存在不成功的概率.因此,挑克隆时，应尽量多挑几个克隆，20个左右。
4、稳定克隆筛选步骤（1）有限稀释法步骤a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可，若细胞生长很快药筛时可以在10cm的dish中进行）用胰酶消化下来b)对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大,可先稀释后计数）c)计算后,用枪头吸取约200个细胞（其中有部分为死细胞）到10ml培养液中充分混匀,剩下的大部分细胞冻存保种d)然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul，这样有的孔就可能只有一个细胞,过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2-3个96孔板）e)待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔划叉，只有一个细胞的孔划勾,以做好标记,如果只有一个细胞的孔数量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾,但这样克隆就可能不纯。
细胞瞬时转染 稳定转染
细胞转染摘要：真核蛋白表达细胞转染方式有两种：瞬时转染和稳定转染，本文的主要介绍了两者的定义和适用性及细胞转染一般步骤，影响转染效率的因素，帮助我们提高实验的成功率。
在哺乳动物细胞蛋白表达实验，根据不同的实验目的，将质粒导入细胞有两种方法：瞬时转染和稳定转染。
细胞转染是将外源基因导入真核细胞的过程。
质粒、DNA、RNA将这些外源基因导入到真核细胞内并不容易，要跨越细胞膜的屏障进入细胞质。
瞬时转染瞬时转染是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的生长复制。
因此，瞬时转染的时间有限，通常只持续几天，直到外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因素消失为止。
判断细胞是否转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在转染两天后即能被检测到。
稳定转染稳定转染是在瞬时转染的基础上，瞬时转染时有一小部分的基因会整合到细胞基因组上，并随着细胞的生长分裂，质粒会随机分配到子细胞中从而稀释直至最终丢失，所以稳定转染要进行稳定细胞系的筛选，经过筛选出来的细胞株，此时的质粒已经完全整合到细胞基因组中，随着细胞的生长复制并稳定的遗传给后代。
瞬转稳转适用性瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转染一般用于基因产物的短期表达、基因敲除、蛋白质的小规模合成。
相对于瞬时转染，稳定转染表达适用于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高。
目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达蛋白时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本。
细胞转染一般步骤以24孔板进行细胞瞬时转染表达为例，全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染转染前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含抗性的正常培养基。
转染技术原理及应用
常规转染技术分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染永久转染;前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析;一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内依赖于各种不同的构建分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测;后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体episome存在;尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高;外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶APH；新霉素抗性基因,潮霉素B 磷酸转移酶HPH,胸苷激酶TK等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系;转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等;一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下表：转染方法原理应用特点磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染瞬时性转染不适用于原代细胞操作简便但重复性差有些细胞不适用DEAE-右旋糖苷法带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用转染时需除血清电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入稳定转染瞬时性转染所有细胞适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大, 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件病毒介导法通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等逆转录病毒特定宿主细胞但携带基因不能太大细胞需处分裂期需考虑安全因素腺病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中瞬时转染特定宿主细胞可用于难转染的细胞需考虑安全因素阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染所有细胞适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需除血清;转染效果随细胞类型变化大Biolistic颗粒传递法将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达瞬时性转染可用于：人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染瞬时性转染转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞各种转染方法的比较除上述传统方法外,近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐;其中树枝状聚合物Dendrimers和聚乙烯亚胺Polyethylenimine,PEI的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂;聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”proton sponge体;这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低;大量实验证明,PEI是非常有希望的基因治疗载体;目前在设计更复杂的基因载体时,PEI经常做为核心组成成分; 线型PEILine PEI,LPEI与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEIBranched PEI,BPEI要早一些,过去的研究认为在不考虑具体条件,LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低,有利于细胞定位,因此与BPEI相比应该转染效率高一些;但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率,但同时细胞毒性也增大;超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基,在染实验中发现这种PEI 的毒性低,但转染效率却较高;GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联,合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物;聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性,因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒,从而提高转染效率,当所形成复合物进入细胞以后,其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解,使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI,这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性,其可降解性对体内应用也具有重要的意义;影响转染实验的因素转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术;随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具;在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中,其应用越来越广泛;影响转染效率的因素有很多,细胞株本身的特性和活性,细胞培养条件,转染的DNA或RNA的质量,转染方法,转染试剂的选择等;常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染永久转染;前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析;一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内依赖于各种不同的构建分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β - 半乳糖苷酶等来帮助检测;后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体episome存在;尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高;外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶APH；新霉素抗性基因,潮霉素B磷酸转移酶HPH,胸苷激酶TK等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系;转染效率受多种因素影响,主要因素有下面几个：1．转染试剂不同细胞系转染效率通常不同,但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂;每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂;当然,最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂;2．细胞状态一般低的细胞代数<50能确保基因型不变;最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞,细胞生长旺盛,最容易转染;细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化;这会导致和转染相关的细胞行为的变化;也就是说同一种系的细胞株,在各实验室不同培养条件下,其生物学性状发生不同程度的改变,导致其转染特性也发生变化;因此,如果发现转染效率降低,可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果;3．转染方法不同转染试剂有不同的转染方法,但大多大同小异;转染时应跟据具体转染试剂推荐的方法,但也要注意,因不同实验室培养的细胞性质不同,质粒定量差异,操作手法上的差异等,其转染效果可能不同,应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件;1细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的基础;不同细胞有不同的培养基,血清和添加物;高的转染效率需要一定的细胞密度,一般的转染试剂都会有专门的说明;推荐在转染前24小时分细胞,这将提供正常细胞代谢,增加对外源DNA摄入的可能;一定要避免细菌,支原体或真菌的污染;2细胞密度细胞密度对转染效率有一定的影响;不同的转染试剂,要求转染时的最适细胞密度各不相同,即使同一种试剂,也会因不同的细胞类型或应用而异;转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低,乃至表达水平偏低;因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂,最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法,包括适当的接种量和培养时间等等;阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数,有的要求细胞90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%-80%之间,总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染,以求最佳的转染效果;不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度,比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因,就需要较低的铺板密度,所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂;一般转染时贴壁细胞密度为50%-90%,但这个需要参考所选转染试剂的说明书;3血清血清一度曾被认为会降低转染效率,老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染,但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤,甚至死亡导致转染效率极低;不过转染产品配方几经革新后的今天,对于主流的转染试剂来说,血清的存在已经不会影响转染效率,甚至还有助于提高转染效率,如阳离子聚合物等,血清的存在会影响DNA—转染复合物的形成,但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基或PBS来稀释DNA和转染试剂就可以了,在转染过程中是可以使用血清的;不过要特别注意：对于RNA转染,如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的;胎牛血清FCS经常用到,便宜一点的有马或牛血清;通常的,血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物,对不同细胞的生长作用有很大的差别;血清质量的变化直接影响细胞生长,因此也会影响转染效率;新加培养基的预热对细胞转染很有帮助;4抗生素细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染,但是这些添加剂可能对转染造成麻烦;比如青霉素和链霉素,就是影响转染的培养基添加物;这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但有些转染试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞;这可能间接导致细胞死亡,造成转染效率低;目前转染试剂因为全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作,非常方便,省去了污染等麻烦;5氮磷N/P比N/P比是转染效率的关键为了换算方便,一般以DNA/转染试剂质量比表示,在一定比例范围内转染效率随N/P比成比例增高,之后达到平值,但毒性也随之而增加,因此在实验之前应根据推荐比例,确定本实验的最佳转染比例;6DNA质量DNA质量对转染效率影响非常大;一般的转染技术如脂质体等基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显着影响转染复合物的有效形成及转染的进行,但对GenEscort系列转染试剂影响不大;核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒,能达到两倍2×CsCl梯度离心以上的纯度效果,使您不必为DNA质量操心;此外,对一些内毒素敏感的细胞如原代细胞,悬浮细胞和造血细胞,QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒,在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子,保证理想的转染效果;但如果使用GenEscort转染试剂,一般不需要这么高的DNA质量要求;当使用GenEscort转染试剂时,即使采用传统的酚－氯仿沉淀方法纯化质粒,仍然可达到非常好的转染效果,但所用的质粒量比试剂盒纯化方法的DNA用量大一些;4．载体构建转染载体的构建病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等也影响转染结果;病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高,但不同病毒载体有其特定的宿主,有的还要求特定的细胞周期,如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞,此外还需考虑一些安全问题如基因污染;除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响,如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响;如果基因产物对细胞有毒性作用,转染也很难进行,因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰;转染技术的要点及转染试剂正确选择转染技术的要点及转染试剂正确选择转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术,它是研究基因表达调控,突变分析等的常规工具;随着功能研究的兴起,其应用越来越广泛;以下就向大家介绍一些转染的技术要点及市面上主要的转染试剂类型的选择;常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染永久转染;前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析;一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-96小时内依赖于各种不同的构建分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测;后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体episome存在;尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高;外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶APH；新霉素抗性基因,潮霉素B磷酸转移酶HPH,胸苷激酶TK等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系;转染效率收多种因素影响,主要因素有下面几个：1. 细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的基础;不同细胞有不同的培养基,血清和添加物;低的细胞代数<50能确保基因型不变;高的转染效率需要一定的细胞密度,一般的转染试剂都会有专门的说明;推荐在转染前24小时分细胞,这将提供正常细胞代谢,增加对外源DNA摄入的可能;一定要避免细菌,支原体或真菌的污染;2. 血清大多数培养基在使用前需要加血清;胎牛血清FCS经常用到,便宜一点的有马或牛血清;通常的,血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物,对不同细胞的生长作用有很大的差别;血清质量的变化直接影响转染效率;因此在转染前建议先测转右试出对细胞生长良好的血清批号,转染时用同一批号的血清,并同时做负对照不加转染试剂及外源DNA以测试细胞生长是否正常;有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低,因此在转染前要除血清;但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤,甚至死亡导致转染效率极低;3. 载体构建转染载体的构建病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等也影响转染结果;病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高,但不同病毒载体有其特定的宿主,有的还要求特定的细胞周期,如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞,此外还需考虑一些安全问题如基因污染;除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响,如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响;如果基因产物对细胞有毒性作用,转染也很难进行,因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰;4. DNA质量DNA质量对转染效率影响非常大;一般的转染技术如脂质体等基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显着影响转染复合物的有效形成及转染的进行;核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒,能达到两倍2x CsCl梯度离心以上的纯度效果,使您不必为DNA 质量操心;此外,对一些内毒素敏感的细胞如原代细胞,悬浮细胞和造血细胞,QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒,在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子,保证理想的转染效果;5.转染技术转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等;一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下：转染方法原理应用特点DEAE-右旋糖苷法带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染,瞬时性转染不适用于原代细胞,操作简便但重复性差,有些细胞不适用;电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入稳定转染,瞬时性转染,所有细胞适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大,需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件阳离子性的脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染,所有细胞适用性广,转染效率高,重复性好但转染时需除血清转染效果随细胞类型变化大病毒介导法逆转录病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染,特定宿主细胞可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大细胞需处分裂期,需考虑安全因素 ,腺病毒瞬时转染,特定宿主细胞可用于难转染的细胞,需考虑安全因素; Biolistic 颗粒传递法将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达瞬时性转染可用于：人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染,瞬时性转染转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。
稳定转染步骤范文
稳定转染步骤范文稳定转染是指将外源基因或RNA通过载体引入目标细胞，并使其在细胞中稳定存在和表达。
稳定转染在生物医学研究和基因治疗等领域扮演着重要的角色，因为它可以使目标细胞长期稳定地表达外源基因，以实现相关研究或治疗的目的。
下面是稳定转染的一般步骤：1.选择适当的载体：选择合适的载体是稳定转染的第一步。
常用的载体包括质粒、病毒和质体等。
质粒是最常用的载体之一，它具有较大的载体容量，便于实验操作，且没有传染性。
病毒能够高效转染目标细胞，但需要确保安全性，避免病毒复制和毒性对细胞的影响。
质体是构建稳定转染细胞株的另一种选择，其使用较为复杂，但稳定性较好。
2.插入目标基因：将目标基因插入到选定的载体中。
基因的插入可以通过限制性内切酶切割和连接等方法实现。
确保插入的基因与载体配对后形成完整的DNA分子。
3.构建稳定转染细胞株：将含有插入目标基因的载体转染入目标细胞中。
转染方法包括化学法、电穿孔法、微粒轰击法和病毒感染法等。
其中，化学法最为常用，其通过化学品改变细胞膜的通透性来促进外源基因的转染。
4.选择处理：添加适当的选择抗生素或标记物来选择转染成功的细胞。
常用的选择剂包括抗生素G418和新霉素等。
由于稳定转染的成功率较低，这一步骤的目的是选择和培养含有插入基因的稳定转染细胞克隆。
5.扩增和筛选稳定转染细胞：将转染成功的细胞株进行扩增培养，并通过PCR、荧光显微镜观察和免疫标记等方法筛选出稳定转染的细胞株。
6. 确认并分析稳定转染细胞株：鉴定细胞株中目标基因的表达情况。
可以通过Western blot、RT-qPCR等方法来检测外源基因的表达水平，并通过细胞功能实验来研究基因在细胞中的功能。
7.建立稳定转染细胞株库：将稳定转染的细胞株进行存储和保存，以备将来使用。
总结：稳定转染是通过引入外源基因或RNA，使其在目标细胞中长期稳定地表达。
稳定转染的步骤包括选择适当的载体、插入目标基因、转染目标细胞、选择处理、扩增和筛选稳定转染细胞、确认并分析稳定转染细胞株以及建立稳定转染细胞株库等。
真核细胞转染操作方法——【感受态细胞的制备及其转化技术】
真核细胞转染操作方法一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。
由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。
利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：(1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。
(2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。
(3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的情况。
(5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。
(6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为mRNA的基因组序列得到表达。
(7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。
DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。
目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。
进行真核转染的一般程序：1克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。
稳转株的建立与筛选
稳转株的建立与筛选
稳转株的建立与筛选是一种利用染色体工程技术实现长期稳定地保存和表达特定基因的方法。
稳转株的建立具有重要的科学价值，可以大大提升研究的效率，进而加快新药的研发速度。
稳转株的建立主要包括三个步骤：1.基因构建；2.转染载体构建；3. 稳转株建立。
1.基因构建是将转染基因构建成转染载体所需要的形式。
一般来说，需要经过PCR扩增、DNA合成、引物设计等步骤，最终得到最终的基因构建。
2.转染载体构建是将基因与转染载体结合起来，使基因能够被转染载体携带，并且可以被细胞内表达。
一般来说，转染载体构建需要进行DNA合成、PCR扩增、克隆、测序验证等步骤。
3.稳转株建立是将转染载体转染到目标细胞中，并获得稳定表达特定基因的稳转株。
一般来说，稳转株建立包括转染载体转染、筛选和稳定性验证等步骤。
转染载体转染是将转染载体转染到细胞内的过程，可以通过质粒转染、质粒融合、质粒导入、病毒感染等方法来实现。
筛选是将转染后的细胞分为稳定表达和不稳定表达两类，以获得稳定表达特定基因的细胞株，常用的筛选方法有抗性筛选、荧光筛选等。
稳定性验证是在筛选后，通过RT-PCR、Western blot、荧光免疫等方法，来证明稳转株能够稳定表达特定基因。
建立稳转株后，还需要进行稳定性监测，以确保稳转株能够稳定表达特定基因。
除了上述方法，也可以采用其他方法如遗传筛选、生物信息学分析等来进行稳定性监测。
总之，稳转株的建立与筛选是一个复杂的过程，需要经过基因构建、转染载体构建、转染载体转染、筛选和稳定性验证等步骤，最终获得稳定表达特定基因的稳转株。
真核载体的应用和原理
真核载体的应用和原理简介真核生物是指细胞内含有真核细胞核的生物，包括动植物、真菌等。
真核生物的细胞包含多个细胞器，如细胞核、线粒体等。
对于研究真核生物的基因功能和表达调控，研究人员常常利用真核载体作为工具进行基因转染和表达。
本文将介绍真核载体的应用领域和基本原理。
应用领域基因转染真核载体可以用于将外源基因导入真核生物细胞中，通过基因转染可实现以下应用： - 基因功能研究：通过敲除或过表达外源基因，研究其对细胞和生物体的影响。
- 蛋白质表达：利用真核载体实现外源蛋白质在真核细胞中的高效表达。
- 基因治疗：将治疗基因导入患者体内，用于治疗一些遗传性疾病等。
转基因生物研究真核载体也被广泛应用于转基因生物研究，通过在真核生物细胞中导入外源基因，研究人员可以： - 验证基因功能：通过外源基因的表达，研究其在生物体中的功能和调控。
- 制备抗体：将外源蛋白表达在真核细胞中，制备特异性抗体，用于蛋白质识别和研究。
基本原理选择适合的真核载体在进行基因转染实验时，选择适合的真核载体非常重要。
常用的真核载体有：- 原核真核双操作子表达载体：这种载体结构合理，适合真核生物的表达。
- mama 单元载体：这类载体包含起始子，终止子，选择子，选择子较为灵活。
载体构建和转染技术为了实现外源基因的转染，通常需要进行以下步骤：1. 基因克隆：将外源基因插入载体中，构建重组载体。
2. 载体扩增：利用细菌进行大量的载体扩增。
3. 纯化载体DNA：纯化扩增后的载体DNA，去除可能存在的杂质。
4. 细胞培养：培养要转染的真核细胞，使其进入合适的状态。
5. 转染：将纯化的载体DNA导入培养的真核细胞中，实现外源基因的表达。
表达调控真核载体的应用还包括对外源基因的表达调控，研究人员通过改变载体中的启动子、转录因子结合位点等元件，可以实现基因的定量、定位和时序调控。
成果分析在转染后，需要进行相关结果的分析以验证实验效果。
常用的方法包括： - 蛋白质表达分析：通过免疫印迹法或荧光染色等技术，检测外源蛋白的表达情况和定位。
CHO稳定细胞株开发步骤有哪些？稳定细胞株筛选原理详解
CHO稳定细胞株开发步骤有哪些？稳定细胞株筛选原理详解CHO（中国仓鼠卵巢）细胞株是目前最常用的哺乳动物细胞株之一，被广泛应用于生物制药、生物技术、疫苗制备等领域。
稳定细胞株是指在细胞培养中，将外源基因集成到细胞染色体中并稳定表达的细胞群体。
稳定细胞株具有表达稳定、重现性好等优点，可用于大规模蛋白质生产。
CHO稳定细胞株开发的主要步骤如下：克隆：选择具有高表达能力的基因，将其克隆到合适的表达载体中，如pcDNA3.1、pCDM8等。
转染：将表达载体导入CHO细胞中，使其表达外源基因。
转染方式有多种，如电穿孔、钙磷共沉淀、透析等。
筛选：利用筛选标记（如耐药基因或荧光标记）对转染细胞进行筛选，筛选出高表达的克隆细胞。
扩增：将选出的细胞进行扩增，直至获得足够量的细胞。
稳定化：将稳定的克隆细胞继续培养，保持其稳定表达目标基因。
鉴定：通过Western blot、ELISA等方法对细胞株进行鉴定，验证其表达目标基因的能力和稳定性。
在CHO稳定细胞株开发过程中，还需要注意培养条件的优化，包括培养基配方、温度、CO2浓度、氧气含量等。
此外，对于不同的目标蛋白，还需要针对性地优化表达条件和纯化方法。
稳定细胞株筛选原理及方法：稳定细胞株筛选是指通过对转染后的细胞群体进行筛选，筛选出稳定集成了外源基因并稳定表达的细胞株。
其基本原理是依赖于转染细胞后外源基因的选择性筛选和纯化。
常用的稳定细胞株筛选方法有两种：抗生素筛选法：将外源基因构建在带有特定抗生素耐受基因的质粒上，转染细胞后在培养基中加入相应抗生素，使只有带有外源基因的细胞能够在抗生素的选择压下存活，其他未集成外源基因的细胞则被杀死。
选择性标记物筛选法：外源基因构建在带有选择性标记物（如荧光蛋白、酶标记等）的质粒上，转染细胞后通过标记物筛选，筛选出带有外源基因的细胞群体。
选择性标记物可以使用光学显微镜、流式细胞仪等设备进行检测和纯化。
两种筛选方法各有优缺点，抗生素筛选法虽然常用但存在一些问题，如转染细胞的抗生素耐受性存在差异，有可能导致筛选结果的不确定性；而选择性标记物筛选法可以减少抗生素对细胞的影响，但其纯化效率较低，需要更复杂的实验设备和技术。
(完整版)G418筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
真核转染稳定筛选标记及原理
转染后的表达
1.瞬时表达 质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核，
进行转录输出mRNA进行蛋白质合成。几天内大 部分的质粒都会被降解或传代而稀释。一周以后 几乎检测不到。转染的质粒不整合到染色体上， 出现短暂的（24-96h）高水平表达，依赖于质粒 纯度、浓 度和转染效率。
2.稳定表达
转染的质粒DNA整合到染色体上可以持续存 在，转染的细胞可以长期表达。
▪ H：次黄嘌呤；补救合成核苷酸的原料 ▪ A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成 ▪ T：胸苷；补救合成dTTP的原料 ❖ 作用机理：TK是核苷酸补救合成途径的一个关键 酶
二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系 统
❖ 遗传标记：DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关 键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸
❖ 编码产物：二氢叶酸还原酶（DHFR） ❖ 筛选药物：叶酸类似物——氨基喋呤或氨甲喋呤 ❖ 作用机理：dhfr—缺陷型细胞因不能合成核酸而
死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且 在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT） 基因选择系统
❖ 遗传标记：XGPRT ❖ 编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ❖ 筛选药物：霉酚酸
❖ 作用机理：XGPRT合成GMP。
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌 呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）， 可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可 通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。
➢ 胸苷激酶基因（tk）选择系统 ➢ 二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统 ➢ 黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶基因（HGPRT）选择系统 ➢ 新霉素抗性基因（neo）选择系统 ➢ 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统 ➢ 潮霉素抗性选择系统
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黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT） 基因选择系统
? 遗传标记：XGPRT ? 编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ? 筛选药物：霉酚酸
? 作用机理：XGPRT合成GMP。
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌 呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT）， 可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可 通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。
转染后的表达
1.瞬时表达 质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核，
进行转录输出 mRNA进行蛋白质合成。几天内大 部分的质粒都会被降解或传代而稀释。一周以后 几乎检测不到。转染的质粒不整合到染色体上， 出现短暂的（ 24-96h）高水平表达，依赖于质粒 纯度、浓 度和转染效率。
2.稳定表达
转染的质粒 DNA整合到染色体上可以持续存 在，转染的细胞可以长期表达。
将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，能表达 XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过 XMP中间体补 救合成GMP，使DNA合成正常进行。加入霉酚酸后，阳性克 隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性细胞则受霉酚酸的抑 制而死亡，以此来筛选阳性细胞。
新霉素抗性基因选择系统
? 遗传标记：APH ? 编码产物：氨基糖苷磷酸转移酶 ? 筛选药物：新霉素，即G418一种氨基糖苷类抗生素，
?H：次黄嘌呤；补救合成核苷酸的原料 ?A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成 ?T：胸苷；补救合成dTTP的原料 ? 作用机理：TK是核苷酸补救合成途径的一个关键 酶
二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系 统
? 遗传标记：DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关 键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸
? 编码产物：二氢叶酸还原酶（DHFR） ? 筛选药物：叶酸类似物——氨基喋呤或氨甲喋呤 ? 作用机理：dhfr —缺陷型细胞因不能合成核酸而
真核细胞稳定转染筛选标ห้องสมุดไป่ตู้ 及原理
主讲人：
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外源基因表达的三个概念
分类
转化
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入原核细 胞中 。
转染
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入真核细 胞中 。
转导
通过病毒介导
，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
常用的真核表达系统
?酵母表达系统 ?丝状真菌表达系统 ?昆虫表达系统 ?哺乳动物表达系统
转 染 方 法
理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、 细胞毒性小等特点。病毒介导的转染技术，是 目前转染效率最高、细胞毒性很低，但准备程 序复杂，对细胞类型有很强的选择性很难普及。 非病毒介导的转染技术中，以 阳离子非脂性物 质为主的混合物配方 转染效率最高。该类转染 具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，且 不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质 体介导的转染方法更方便。
?胸苷激酶基因（ tk）选择系统 ?二氢叶酸还原酶基因（ dhfr）选择系统 ?黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶基因（ HGPRT）选择系统 ?新霉素抗性基因（ neo）选择系统 ?氯霉素乙酰转移酶基因（ cat）选择系统 ? 潮霉素抗性选择系统
细胞内DNA的合成途径
细胞的DNA 合成有主要途径和旁路途径两种方式
1. 主要途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸脲甘酸在二 氢叶酸还原酶的催化下合成 DNA
2. 旁路途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT) 或胸腺嘧啶激酶 （TK ）的催化下补救合成 DNA 。
胸苷激酶基因选择系统
? 遗传标记：TK ? 编码产物：胸苷激酶 ? 筛选药物：HAT选择法
的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中 选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。
潮霉素抗性选择系统
? 遗传标记 ： HPH ?编码产物：潮霉素 B磷酸转移酶 ?筛选药物：潮霉素 B ?作用机理：HPH灭活潮霉素 B
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整合的概率比较小，要获得稳定转染的细胞 株需要筛选标记共同转染，通过选择压力维持表 达稳定。需要长时间的抗性选择培养。
酵母表达系统常用的选择性标记
?营养缺陷性酵母 trp1- ，ura3- ，his3- ，leu2- ，
lys2-。 ?显性选择标记，用于野生型酵母菌
的转染。 G418 筛选。
哺乳动物细胞遗传性标记
影响80S核糖体功能核蛋白质的合成 ? 作用机理：新霉素抗性基因编码3磷酸转移酶降解
G418。适用于所有的真核细胞
氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统
? 遗传标记：CAT，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素 乙酰化反应的蛋白质
? 编码产物：氯霉素乙酰转移酶 ? 筛选药物：氯霉素 ? 作用机理：真核细胞缺乏CAT，将CAT作为报告基因与目