第九章 原生质体育种

（二）融合体的检出与分离
1．利用营养缺陷型标记选择融合体 2．利用抗性选择融合体 3．用灭活原生质体检出融合体 4．利用荧光染色法选择融合体 5．双亲对碳源利用不同而检出融合体 6．融合体的其他选择方法 ①对昆虫的毒力测定进行融合体的选择 ②利用形态差异选择 ③生化测定指标选择融合体
五、融合重组体检出与遗传分析
（三）DNA含量及孢子形态测定
1．DNA含量测定 2．单倍化 3．有关酶活性及孢子体积的测定 4．分子生物学方法
六、原生质体融合的应用
1．提高产量或质量，合成新物质，新中间体 2．改良菌种遗传特性 3．优化菌种发酵特性 4．质粒转移 5．原生质体与细胞核融合 6．进行遗传分析
第三节
细菌原生质体融合育种
三、原生质体融合
（一）原生质体融合过程
两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定液中， 在PEG的诱导下，两个或两个以上凝聚成团，相邻 原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质 膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞，异 核体的细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂 合二倍体，通过染色体交换，产生各种重组体， 称为融合子 原生质体 、PEG 及适量的CaCl2、MgCl2
四、融合体再生
（一）融合体再生
双亲融合后形成的融合体不等于重组体，以霉菌 来说，可能是异核体或杂合二倍体或重组体，它们融 合后营养互补，经过再生，均可在基本培养基上形成 菌落。 融合体的再生包括融合体细胞壁的合成、重建和 融合体的再生。 酵母菌、细菌常用双层平板法，与融合前原生 质再生率测定相同。霉菌和放线菌除了用双层平板法 外，也可把原生质体直接分离到高渗培养基平板上， 同样能得到再生菌落。 复原：原生质体本身形成细胞壁，而且还能从原生质 体细胞上长出有细胞壁的菌丝体
原生质体的分离
制
收集
备
纯化
流
活性鉴定 保存
程
处理真菌用酶
纤维素酶 Cellulase
酵母裂解酶 Zymolyase
几丁质酶 Chitinase
β-1,3葡聚糖酶
商品酶
Novozyme234来自 Trichoderma harzianum
Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶
Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶 (for yeast)
原生质体融合育种的特点
1、杂交率高 2、受接合型或致育型的限制小 3、遗传物质传递更为完整 4、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能 5、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株
6、提高菌株产量的潜力较大
7、有助于建立工业微生物转化体系
原生质体融合育种五大步骤：
直接亲本及其遗传标记选择； 双亲本原生质体制备与再生；
第九章 工业微生物原生质体 育种和原生质体融合育种
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原生质体育种 微生物原生质体融合育种 细菌原生质体融合育种 放线菌原生质体融合育种 酵母菌原生质体融合育种 霉菌原生质体融合育种
第一节
原生质体育种
什么是原生质体？ 原生质体具有的新特性： 1、对诱变剂敏感 2、对噬菌体不敏感 3、不受感受态影响 包括：原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原 生质体转化育种，原生质体融合育种及其他原生质 体育种。
大分子的合成和 原生质体生长； 细胞壁的合成与 再生；分裂能力 的恢复并开始分 裂繁殖
2．再生率及其计算
无菌水稀释 培养 未原生质化 细胞（B) 计数
高渗溶液稀释 原生质体 悬浮液 高渗溶液稀释
培养
再生 菌落 (C) 总菌落数 (A)
培养
未酶解的细菌
再生培养基上总菌落数—酶处理后未原生质体化菌落数 再生率（%）= 原生质体数 C－B = A－B ×100% ×100%
酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化，才能大幅度地提高 制备率；放线菌制备原生质体，以对数期到静止期的转换期比较理想， 不仅制备量多，而且细胞壁再生能力也比较强；细菌适合在对数期分 离原生质体 （4）稳定剂：高渗溶液；无机盐对丝状真菌效果较好，而糖和糖醇 对酵母更为合适，细菌多使用蔗糖或NaCl （5）酶解前的预处理：SH-化合物（如巯基乙醇）广泛应用于酵母和 某些丝状真菌中 （6）酶系和酶的浓度：真菌-0.5％蜗牛酶和0.5%纤维素酶 （7）酶的作用温度和作用pH值及作用时间：通常细菌水解细胞壁的 温度在 35℃左右。一般放线菌的温度在 30～32℃。霉菌一般在 pH5.4-6.5，放线菌在pH6.5-7.0。作用时间也是影响原生体生成的重 要因素。 （8）菌体密度： （9）酶解方式：酶解时保持较好的通气条件和适当振荡可促进原生 质体释放和分离。
分离重组体，并试验其遗传稳定性研究 （一）重组体的检出和鉴别的方法 直接分离在基本培养基上 1．直接法 或选择培养基上。但是难 以检测表型延迟而又基因 2．间接选择法 重组的融合体 3．钝化选择法
先分离到完全培养基上，然 后再影印到选择培养基上。 这种方法可以检测表型延迟 重组体。
（二）融合率
如采用直接法，融合率的计算公式为： 融合率（％）=基本培养基上再生的菌落/完全培养基上 再生的菌落数×100% 如采用间接法．融合率的记算公式为： 融合率（%）＝重组体后代总数/所有后代总数×100％ 各类微生物之间融合频率差别很大．既使是同一个 种的不同菌株也不一样。霉菌、放线菌融合率约为0.1%一 10%，细菌和酵母菌为10-3一10-6。异种间融合率比同种间 又低得多，如霉菌种间融合率约为0.1％一1%，酵母菌、 放线菌为10-5一10-7。
微生物制备原 生质体后直接 再生，从再生 菌落中分离筛 选变异菌株， 最终得到优良 性状提高的正 突变株。
二、微生物原生质体诱变育种
（一）原生质体诱变育种方法 1是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变 ．物理诱变剂诱变原生质体的一般程序：
剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落 取10 ml对数生长期微生物培养物，离心收集菌体， 中筛选高产突变菌株。 无菌水洗涤→离心，菌体沉淀物用酶液悬浮，水解去壁制 成原生质体→离心，高渗溶液洗涤原生质体→原生质体悬 浮液稀释至一定密度，取适量放入无菌培养皿内→将培养 皿移至紫外灯下诱变处理→置暗处后处理一定时间→移入 再生培养基中再生培养（由于原生质体较脆弱，用双层平 板法再生）→分离优质菌株→突变株稳定性试验→突变株 鉴定。
5．原生质体的保存
（1）立即进行融合或其它方式育种 （2） 5％的二甲亚砜或甘油等其他保护剂；液氮。
（二）原生质体再生
l、原生质体再生的影响因素 ①菌体生理状态 ②稳定剂 ③酶浓度和酶作用时间 细菌、放线菌和酵母菌多用糖醇系统的稳定液；霉菌多 用盐溶液系统。 ④再生培养基：丝状真菌、酿酒酵母等的原生质体仅能 在固体培养基上再生，在液体培养基中细胞壁再生不 彻底，不能完全复原。再生培养基要用稳定剂配制， 还含有Ca2+和Mg2+,浓度和原生质体形成时的酶解液相 类似，菌种不同稍有差别。 ⑤残存菌体的分离 ⑥原生质体密度 ⑦排除再生培养基上的冷凝水 ⑧再生 方法
7、影响原生质体再生的因素
8、原生质体活性的检测方法 9、原生质体诱变育种的步骤
亲本原生质体诱导融合；
融合重组体（称为融合子）分离； 遗传特性分析与测定；
①超声波处理菌体释放原 生质体 一、直接亲本及其遗传标记的选择 ②酶解脱壁释放原生质体
一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为 直接亲本 直接亲本都带有遗传标记
二、原生质体制备与再生
（一）原生质体制备
最有效和最常用的是酶法。 处理细菌细胞壁用酶 处理放线菌细胞壁用酶 溶菌酶Lysozyme Lytic Enzyme裂解酶、 Lysozyme溶菌酶
一、微生物原生质体再生育种
1．原生质体再生育种的一般程序 ： 出发菌株的选择→菌种活化和预培养→原生质体 制备→原生质体再生→高产菌株分离（初筛） →复筛→遗传稳定性鉴定→菌种特性及发酵特 性研究。 2．原生质体再生育种实例 敏感，细胞壁的重建 和分裂能力的再生， 小单孢菌福堤霉素
对数期细胞，不需要 遗传标记
2．化学诱变剂诱变原生质体的一般程序
通常操作程序包括：出发菌株培养和原生质体制备及 再生→选择合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度→加入 原生质体悬浮液，混合（含有高渗溶液，稳定原生质体） →诱变处理→离心弃诱变剂、原生质体沉淀用稳定液洗涤 →稀释、分离到再生平板上（双层平板法）→再生培养→ 观察、筛选突变株→复筛→突变株鉴定。 原生质体诱变周期一般比常规诱变育种要长，难度更 大。
（二）原生质体诱变育种实例
1．扩展青霉原生质体制备 2、原生质体再生 3、原生质体诱变 4、突变株筛选
三、微生物原生质体转化育种
整条DNA或DNA片段的转化
四、微生物原生质融合育种
五、其他微生物原生质体育种
第二节 微生物原生质体融合育种
用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制 成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学 方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色 体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优 良性状于一体的稳定融合子。 聚乙二醇诱导和电融和 聚乙二醇种内融合率可高达27%，种间的融合率也 可达10%，比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱 导融合又将融合率提高10倍。
2．原生质体的鉴别 （1）低渗爆破法： （2）荧光染色法：0.05%-0.1%的荧光增白剂（VBL） 3．原生质体的收集和纯化 （1）过滤法：使用砂芯漏斗。 （2）密度梯度离心法： （3）界面法： （4）漂浮法：
4．原生质体的活力鉴定
（1）荧光素双醋酸盐（FDA）染色法 （2）酚藏花红染色法（0.01%染料染色，活红，死白） （3）伊文思篮染色法 （0.25%伊文思篮，活无色，死蓝色）
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第四节
放线菌原生质体融合育种
第五节
酵母菌原生质体融合育种
第六节
霉菌原生质体融合育种
本章习题
一、名词解释 原生质体再生育种 二、问答题 1、与诱变育种和杂交育种相比较原生质体融合育种有什么优点？ 2、以细菌原生质体融合育种为例试述原生质体融合育种的步骤 3、原生质体再生育种的优点 4、影响酶法分离原生质体的因素 5、影响原生质体融合的因素 6、融合体检出的方法 原生质体融合育种 再生率 融合率
（二）原生质体融合的影响因素 1．融合剂： 化学融合剂：不同种类微生物对PEG分子量的要求不尽 相同。细菌：1500-6000；放线菌：1000-1500；真菌： 4000-6000.浓度一般为30%-50%。 物理融合剂：电场和激光 2．温度：丝状真菌适宜融合的温度约为30℃；而细菌 原生质体融合的适温往往偏低，据认为4℃或20℃比 37℃更好；放线菌通常在常温（约20℃）下进行融合。 总的来说在20-30℃下进行融合效果较理想。融合处理 时间从1min-1h，但大多数微生物1～10 min， 3、亲株的亲和力和原生质体的活性 4．无机离子： 在PEG介导融合时，通常需要一定梯度的 Ca2+、Mg2+有效地促进融合 5．其他条件 ：细胞密度，不少于106/ml；应采用年轻 的含残余菌丝少的的原生质体进行融合。
原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处 理等因素有关。 1、 酶法分离原生质体的影响因素 （1）培养基组成 （2）菌体培养方式：丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌 和酵母菌多用振荡沉没培养法。 （3）菌体菌龄：丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生 质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前 期和对数期效果最好。