第九章 原生质体育种
原生质体培养及其在果树育种上的应用
原生质体 的分离过程就是有合适 的酶组成 、酶溶液 ｐ Ｈ值 、酶解时间 、酶解温 度 ，在 一个稳 定的等渗 或稍 低于细胞 内压的环境下的酶解 反应 。合适的酶和渗透压 稳定 剂是得到大量原生质体 ，并在最大程度上维持原生
质体 活力 的 ２个 必 备 条件 。 酶 是 原 生质 体 分 离 中 的重 要 物 质 ，有纤 维 素 酶 、半
树育种上的应用进行综述 ，旨为相关研究提供参考 。
１ 原生质体材料的制备及培养
１ １ 原 生 质体 分 离材 料 的选 择 ．
纤维素酶 、果胶酶 、崩 溃酶 、离析 酶等。其 中最常用的 是纤维素酶 和果胶酶 ，前者作用 于细胞间 隙的果 胶质 ， 使细胞分开 ；后者直接作用于细胞壁 ，使细胞壁分解 释 放原生质体 。不同材料应通过试验确定适宜的酶液类 型 及组成 。渗透压稳定剂不仅对维持植物原 生质体 的完整 性和稳定性有着重要作用 ，而且对以后 的培养 和细胞分
摘要 ：综述 了近年来原生质体技 术的研 究进展及其在果树育种上 的应 用，并讨论 了原 生质体技术存在的 问题及
应 用前 景 。
关键词 ：原 生质体培养；原生质体 融合 ；胞 质杂种 ；果树 育种
中图分类号 ：Ｑ ４ ９３ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１０ － ３ ２ １ ）０ － ８ － ・ ８１ １（００ ４０ ２０ ０ ６ ０ ３
ａ ｐｉａｉｎ ｐ ｏ ｐ ｃｓａｅ ａｓ ｉｃ ｓｅ ． ｐ ｌ ｔｏ ｒｓ ｅ ｔ ｒ ｌｏ ｄ ｓｕ ｓ ｄ ｃ Ｋ ｅ ｒ ｓ： Ｐ ｏｏ ｌｓ ｃ ｌｕｅ； Ｐ ｏｏ ｌｓ ｕ ｉｎ； Ｃ ｂ ｉ ｓ Ｆ ｕｉ ｂ ｅ ｄｎ ｙ ｗｏ ｄ ｒｔｐａ ｔ ｕ ｔｒ ｒｔｐ ａｔｆ ｓｏ ｙ ｒｄ ； ｒ ｔ ｒｅ ｉ ｇ
原生质体育种名词解释
原生质体育种名词解释
嘿，朋友们！今天咱来聊聊原生质体育种。
啥是原生质体育种呢？这就好比是给生物界来了一场奇妙的大改造！
想象一下，原生质体就像是一个小小的魔法盒子，里面装着生物的各种遗传秘密和潜力。
我们通过一些特别的手段，把不同生物的原生质体凑到一块儿，让它们发生奇妙的反应和融合。
这可不是随随便便就能做到的哦！得像个细心的工匠一样，精心地操作。
把不同的原生质体放在一起，就好像让不同的颜料混合，会产生出全新的色彩和效果。
比如说，我们可以把一种植物的原生质体和另一种植物的原生质体融合在一起，说不定就能培育出一种具有特殊性状的新植物呢！这多神奇呀！它能让植物变得更强壮、更能抵抗病虫害，或者长出更漂亮的花朵、结出更美味的果实。
这就好像搭积木一样，我们可以用不同的原生质体搭出各种各样我们想要的形状。
而且这个过程充满了惊喜和未知，你永远不知道会得到什么样的奇妙产物。
再想想，要是能把动物的原生质体也这么搞一搞，那会出现什么好玩的事情呢？会不会有能飞的鱼，或者会游泳的鸟呢？哈哈，虽然现在可能还做不到，但谁知道未来会怎样呢！
原生质体育种可不只是好玩哦，它对我们的生活有着实实在在的影
响。
通过它，我们可以培育出更好的农作物，让我们有更多更健康的食物吃。
还能让一些濒临灭绝的物种有机会重新焕发生机，这不是很棒吗？
总之，原生质体育种就像是打开了生物世界的一扇神奇大门，让我们有机会去探索和创造更多的可能。
它让我们看到了生物的无限潜力，也让我们对未来充满了期待。
难道不是吗？。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
原生质体融合育种
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• 酶处理温度 • 破壁时的pH值 • 渗透压稳定剂
等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保 护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物 的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇， 蔗糖等有机物，KCl、NaCl等无机物。
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4）涂布于再生培养基，再生出菌落。
5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融
合子进一步试验、保藏。
6）生产性能筛选。
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3、原生质体融合育种的要点
（1）标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛
选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要 的是标记必须稳定。
采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还 可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功， 可以采用多标记菌种。
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(2) 原生质体的制备
原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入 细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下 由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原 细胞的一切活性。
在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用 溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素 酶等。
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影响原生质体制备的因素
1、原生质体融合育种的特点
(1) 杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件 下形
成类似于球形的原生质体。 (2) 受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一
株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种 属间微生物的杂交。 (3) 遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株 的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。
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第九章其它育种途径简介
第九章其它育种途径简介第一节诱变育种一、诱变育种(mutation breeding)概念诱变育种又称引变育种或突变育种，是人为的利用物理和化学因素诱发植物产生遗传变异，根据育种目标要求，对突变体进行选择和鉴定，直接或间接地培育成生产上有利用价值的新品种的方法。
一般以电离辐射、化学诱变为主要手段。
二、诱变育种的种类1、物理因素(1)辐射紫外线：是波长为200-390nm的非电离辐射线。
由于能量较低，穿透力不强，多用于照射花粉、孢子、组织培养中产生的愈伤组织等。
以250~290nm波长范围内的紫外线诱变作用最强，并以低压水银灯发出的紫外线辐照效果较好。
X射线：是一种波长约为10-10~10-5cm的电离辐射线，穿透力较强。
是最早应用于诱变工作的射线。
γ射线：是一种波长更短的电离辐射线，其波长为10-11-10-8cm。
60Co、137Cs 是目前应用最多的γ射线源。
由于γ射线穿透力很强，所以应用时必须严密防护，以确保安全。
β射线：是电子或正电子的射线束。
其质量小速度大，在组织中穿透距离仅几毫米。
在辐射育种中常用具有β射线的放射线性同位素32P、35S等溶液浸种，使这些同位素进入植物组织和细胞后作为内照射而产生诱变作用。
(2)太空育种(航天育种) 指普通种子搭载航天器，利用特有的太空环境引发诱变，产生各种基因变异，返回地面后选育植物新品种、新种质、新材料的方法。
(3)激光育种(是微波育种的一种)(4)高压静电场育种(5)重离子育种H、N、Ar诱变机理有直接、间接作用。
前者指DNA吸收了电离辐射的能量而引起分子损伤。
表现在①引起电离激发使碱基结构变化；②化学键受到破坏；③碱基在复制时无差别的插入键中。
间接作用是引起大分子损伤后的环境发生作用。
2、化学因素能与生物体的遗传物质发生作用，并能改变其结构，使其后代产生变异的化学物质称为化学诱变剂（chemical mutagen）。
归纳起来主要有以下几大类：(1)烷化剂类：以活跃的烷基取代其它分子的氢原子，从而导致遗传密码改变。
《原生质体融合育种》课件
稻米和小麦的基因交换
细胞工程育种的应用
通过原生质体融合育种，实现稻 米和小麦遗传特性的交换， 以提 高两个农作物的产量和适应能力。
利用细胞工程技术和原生质体融 合，可以快速培育出抗性强、高 产优良品种。
植物基因编辑的进展
通过原生质体融合育种的细胞工 程技术，实现植物基因编辑， 能 够更精准地改良植物性状技术，将植物细胞分离并制备出原生质体。
2
随机融合和定向融合的区别
随机融合是将制备好的原生质体混合后融合，而定向融合是特定选择要融合的原生质 体进行融合。
3
影响融合效率的因素
原生质体浓度、温度、融合时间等因素会对融合效率产生重要影响。
应用案例
了解原生质体融合育种在农业和植物科学领域的具体应用案例。
优缺点
了解原生质体融合育种的优势、局限性以及未来发展方向。
原生质体融合育种的优点
快速获取新品种、遗传特性可控、有效提高农作物产量。
原生质体融合育种的缺点
融合效率低、变异性高、对环境的适应能力有限。
未来发展趋势
进一步改进原生质体融合育种技术，提高融合效率和品种稳定性。
结论
通过本课件的学习，我们了解了原生质体融合育种的基本原理、应用案例、优缺点以及未来发展趋势。 原生质体融合育种具有巨大的应用潜力，将助力农作物产量提升和遗传特性的改良。
《原生质体融合育种》PPT课 件
让我们一起了解原生质体融合育种的奥秘与应用。
介绍
原生质体融合育种是一种基因育种技术，通过将不同植物的原生质体融合，实现基因交流和遗传特性的 选择性增强。
什么是原生质体融合育种
原生质体融合育种是通过融合植物细胞的原生质体， 实现不同植物间基因的交流，以达到遗传性状 的改良。
利用原生质体育种技术获得优良酵母菌设计实验路线
利用原生质体育种技术获得优良酵母菌设计实验路线一、引言原生质体是一种独立的细胞结构，能够从细胞中分离出来，其膜结构与细胞膜相似，内含有细胞质、细胞器和液泡等细胞组分。
利用原生质体进行质体育种技术可以快速筛选和培育出优良的酵母菌株，提高酵母菌的发酵能力和产物产量。
本文将结合原生质体育种技术的原理和操作步骤，设计一条实验路线，以获得优良的酵母菌株。
二、实验原理原生质体育种技术是利用细胞外靶酶介导外源DNA进入酵母细胞质的一种技术。
其步骤包括：1）制备原生质体，将酵母细胞经过适当处理（如酶解细胞壁）制备成原生质体；2）选择合适的外源DNA，如含有目标基因的质粒；3）利用凝集素介导质粒与原生质体的结合，使质粒进入原生质提；4）将质粒整合到酵母基因组中，通过筛选培养条件促使原生质体内的外源基因表达。
三、实验步骤1.酵母菌细胞培养选择优良的酵母菌株，进行预培养。
在含有适宜培养基的培养瓶中，加入适量酵母菌液，经过恒温摇床培养，直至菌体生长到对数期（约达到OD600≈1）。
2.细胞壁酶解将酵母菌细胞收取，用含有Zymolyase的酶解缓冲液进行细胞壁酶解。
将酵母菌菌体与酶解缓冲液按照一定比例混合，恒温摇床酶解一定时间，使得酵母菌细胞壁酶解。
3.质体分离酶解后的细胞在低速离心下，使得原生质体分离出来。
去除上清液，保留沉淀中的原生质体。
4.质粒与原生质体结合准备含有目标基因的质粒，并与原生质体进行结合。
可以利用凝集素对质粒进行修饰，使质粒能够与原生质体特异性结合。
5.内化质粒将质粒与凝集素修饰的原生质体进行混合，经过适当条件的处理，使质粒进入原生质体内。
6.利用选择性培养基筛选培养原生质体内的酵母菌，用含有选择性抗生素的培养基进行筛选，筛选出带有外源基因的酵母菌。
7.验证外源基因表达通过PCR或蛋白质表达分析等技术，验证筛选出的酵母菌是否具有外源基因的表达。
8.进一步培养和优选将表达外源基因的酵母菌进行进一步培养，优选出其发酵能力和产物产量更高的菌株。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
第九章 新品种培育概述
四、多倍体和单倍体
1.染色体工程：多倍体育种和单倍体育种
人的染色体
• 1.特纳氏综合症（Turner）是常见的女性性染色体异常疾病。 常见的核型是45,X,少数是嵌合体,出生率1/2500～1/5000。 身材矮小，原发性闭经，性幼稚，蹼颈，后发际低，宽乳距, 肘外翻是本病的主要临床特征。 • 2.克氏综合征（Klinefelter Syndrome） 是常见的男性性染 色体异常疾病，典型的核型为47，XXY。表型特征有睾丸发育 不全。身材修长，乃足跟至趾骨间的距离增长所致。男子乳 腺发育、阴毛呈女性型分布，阴茎及睾丸均小。严重者伴有 智力迟钝、隐睾及尿道下裂等。本病发生率较高,在新生活婴 中的发生率是1.4～2.9％，是男性不育症中常见的一种。 • 3.爱德华综合征Edwards：染色体异常为18三体。表型特征有 智力低下、小头、前额窄、枕部突、小颌且张口范围小，腭 弓高窄、低位耳、肾畸形、肌张力增高及手紧握等。
臂部分或全部缺失。表型特征有：婴儿时期哭声似猫叫，因 而得名，可有喉器小和会厌小等喉部发育异常。严重智力低 下，小头、圆形脸、眼距宽、眼裂下斜、耳位低、内眦赘皮， 贯手等多种畸形，约一半患者有先天性心脏病，智力低下， 生活能力差，常早亡。4P-综合征类似5P-综合征，但常常更 为加重，还可呈尿道下裂,腭裂、严重的精神以及运动障碍， 癫痫发作等，属少见病例。 • 6.染色体断裂综合征：可见大量染色体断裂，多由于范可尼 （Fanconi）综合征与Bloom综合征。
植物组织培养与诱变育种相结合的关键问题：
第一,确定适合的诱变剂； 第二,确定适合的诱变材料(或靶细胞或靶组织)。选择诱变 的植物组织培养材料要考虑其分散程度和整齐度,以 及再生能力和再生途径,还要考虑能否获得足够大的
第九章 生物技术在药用植物育种上的应用1
人造血液及其生产
通过基因工程的方式 创造了能合成人干扰素的 大肠杆菌，每1Kg的培养液 可提取4～20mg干扰素，若 从人血中提取干扰素， 300L血才提取1mg！
1983 SCIENCE Cover – Transgenic Mice 1997 TIME Cover - DollyScience Vol来自 222, Nov. 1983
殊环境下的药用植物引种困难等问题，生物技术
在药用植物育种上的应用研究已成为当今中药研 究的热点，如育出了茎尖地黄新品系，已在产区 应用，并将使传统中药进入一个崭新的时代。
什么是生物技术？
生物技术（Biotechnology ）：
Bio Biology Technology Application The application of Biology for the benefit of humans
一、离体培养技术（in vitro culture）
植物细胞的全能性（Cell Totipotency） 一个植物细胞能产生一个完整植株的固 有能力称之为细胞的全能性。 即广义的组织培养，是现代生物技术的一个 重要组成部分，它是指运用无菌操作技术，将 从植物体分离的符合需要的组织、器官或细胞 （包括去壁后的原生质体）等，接种在人工培 养基上，置于人工控制的环境条件下进行培养， 以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的 其它生物产品的技术。
S – sensitive plants R – resistant plants
Biotechnology:
A collection of technologies
The Applications of Biotechnology
给学生微生物遗传育种学复习思考题1
给学⽣微⽣物遗传育种学复习思考题1《微⽣物遗传育种》复习思考题01 绪论1、⼯业微⽣物菌种应具有哪些基本特征？⾮致病性；适合⼤规模培养⼯艺要求；利于规模化产品加⼯⼯艺；具有相对稳定的遗传性能和⽣产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应⽤价值。
2、简述⼯业微⽣物遗传育种的分类。
天然菌种（native strain）：通过⾃然筛选和分离获得的⼯业菌种；诱变菌种（mutagenized strain）：通过物理、化学等诱变剂在实验室⼈⼯诱变⾃然筛选与分离的菌株所获得产量或/和性状改善的⼯业菌种；重组菌种（recombinant strain）是通过遗传重组技术对菌种进⾏定向遗传改良获得的⼯业菌种；遗传修饰⽣物体（genetic modification organisms, GMOs）：经外源基因导⼊并因此发⽣遗传整合和性状改变的⽣物体。
3、试从微⽣物遗传学的不同⾓度阐述你对微⽣物多样性的认识。
⼀、微⽣物物种的多样性; ⼆、微⽣物遗传的多样性;三、微⽣物代谢的多样性 ;四、微⽣物的⽣态多样性;五、微⽣物利⽤的⼴泛性02 第四章⼯业微⽣物育种诱变剂1、什么是诱变剂？可分为哪⼏种类型？诱变剂：凡能诱发⽣物基因突变，并且突变频率远远超过⾃发突变率的物理因⼦或化学物质.可以分为三类：物理诱变剂；化学诱变剂：⼀类能对DNA起作⽤，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质；⽣物诱变剂：采⽤某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗⽣素产量明显提⾼的抗性突变株。
因此，可以认为这些溶源性噬菌体是⼀种⽣物诱变剂。
2、什么是突变？突变的表现型有哪些？基因突变的特点有哪些？突变，从⼴义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起⽣物变异以外，任何表型上可遗传的突变都属突变范围，如染⾊体整倍性和⾮整倍性的变化及染⾊体结构上的畸变等都包括在内。
1、形态突变型，是⼀种可见突变，它包括微⽣物菌落形态变化，如菌落形状⼤⼩、颜⾊、表⾯结构等；2、⽣化突变型，；3、条件致死突变型；4、致死突变型；5、抗性突变型；6、营养缺陷型；普遍性；随机性（基因突变可以发⽣在⽣物个体发育的任何时期和⽣物体的任何细胞。
第九章原生质体培养
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解 壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐 溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作 渗透稳定剂的培养基中培养。 此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾， 它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使 RNA酶不活化，并使离子稳定。
四.植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生 质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材 料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。 这些处理包括：暗处理、预培养、低温处 理等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游 离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞， 找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细 胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol／L甘 露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中 只加0.4~0.45mol／L的甘露醇，两者差别较 大。
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表 皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表 皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉 轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将 材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不 均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将 原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行 酶解。
2.酶溶液的pH值 酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影 响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH 值为5．0时， 原生质体产生得很快，但损坏较严 重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6．0时， 最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理 同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始 pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增 加，损伤的原生质体也少得多。
④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个 小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补， 不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激 活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用 一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的 不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分 化条件等。
植物原生质体技术在植物育种中的应用
植物原生质体技术在植物育种中的应用植物原生质体技术是利用植物的胚、组织和细胞作为原材料，通过一系列特殊处理方法得到的一种无细胞壳的裸细胞体系。
原生质体中有许多重要的细胞器和生理代谢过程，可以被用来进行植物育种。
这种技术是目前广泛应用于植物性状改良和基因工程研究的一种非常重要的技术。
植物原生质体技术的核心思想在于选择优良的母本和父本，通过雄性和雌性不育的方法将两者结合在一起，再通过原生质体培养技术进行育种。
通过这种方法，可以有效地提高植物产量、抗病性、耐旱性等优良性状，达到优化植物性状的目的。
植物原生质体技术在植物育种中的应用可以分为以下三个方面：1. 品种改良通过拟南芥、水稻、玉米等多种植物的原生质体培养，可以选择出具有抗旱、抗病、耐寒、高产等多种优秀性状的品种。
例如，在拟南芥中，可利用原生质体技术培育出抗蘑菇病、丰产性等多种优良品种，为植物育种提供了更多有利基础材料。
2. 基因工程通过利用原生质体技术，可以在植物中导入外源基因，实现对植物DNA的改编。
这种技术广泛运用在植物抗虫、抗病、耐旱等优化性状的育种当中。
例如，在小麦中导入抗蚜虫基因，可以显著提高小麦的收成，为农业生产发展提供了强有力的技术支持。
3. 生物制剂植物原生质体技术还可以应用于生物制剂的生产。
利用细胞培养技术，植物细胞中的代谢产物如酶、激素、蛋白质和其他生物活性物质等可以被大量生产。
例如，使用原生质体技术生产逆境胁迫下的植物蛋白质，可以为生命科学提供重要的研究基础材料，有助于深入探究植物逆境适应机理。
总之，植物原生质体技术在植物育种中具有广泛的应用前景，特别是对于具有异质不亲和性、双倍体、难种植种等的植物，原生质体技术可以提供新的选育渠道，为植物育种研究提供了新的思路。
未来，借助先进的技术手段和质量控制水平的提高，植物原生质体技术将进一步发挥作用，促进植物育种技术的创新和进步。
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2．原生质体的鉴别 （1）低渗爆破法： （2）荧光染色法：0.05%-0.1%的荧光增白剂（VBL） 3．原生质体的收集和纯化 （1）过滤法：使用砂芯漏斗。 （2）密度梯度离心法： （3）界面法： （4）漂浮法：
4．原生质体的活力鉴定
（1）荧光素双醋酸盐（FDA）染色法 （2）酚藏花红染色法（0.01%染料染色，活红，死白） （3）伊文思篮染色法 （0.25%伊文思篮，活无色，死蓝色）
大分子的合成和 原生质体生长； 细胞壁的合成与 再生；分裂能力 的恢复并开始分 裂繁殖
2．再生率及其计算
无菌水稀释 培养 未原生质化 细胞（B) 计数
高渗溶液稀释 原生质体 悬浮液 高渗溶液稀释
培养
再生 菌落 (C) 总菌落数 (A)
培养
未酶解的细菌
再生培养基上总菌落数—酶处理后未原生质体化菌落数 再生率（%）= 原生质体数 C－B = A－B ×100% ×100%
微生物制备原 生质体后直接 再生，从再生 菌落中分离筛 选变异菌株， 最终得到优良 性状提高的正 突变株。
二、微生物原生质体诱变育种
（一）原生质体诱变育种方法 1是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变 ．物理诱变剂诱变原生质体的一般程序：
剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落 取10 ml对数生长期微生物培养物，离心收集菌体， 中筛选高产突变菌株。 无菌水洗涤→离心，菌体沉淀物用酶液悬浮，水解去壁制 成原生质体→离心，高渗溶液洗涤原生质体→原生质体悬 浮液稀释至一定密度，取适量放入无菌培养皿内→将培养 皿移至紫外灯下诱变处理→置暗处后处理一定时间→移入 再生培养基中再生培养（由于原生质体较脆弱，用双层平 板法再生）→分离优质菌株→突变株稳定性试验→突变株 鉴定。
酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化，才能大幅度地提高 制备率；放线菌制备原生质体，以对数期到静止期的转换期比较理想， 不仅制备量多，而且细胞壁再生能力也比较强；细菌适合在对数期分 离原生质体 （4）稳定剂：高渗溶液；无机盐对丝状真菌效果较好，而糖和糖醇 对酵母更为合适，细菌多使用蔗糖或NaCl （5）酶解前的预处理：SH-化合物（如巯基乙醇）广泛应用于酵母和 某些丝状真菌中 （6）酶系和酶的浓度：真菌-0.5％蜗牛酶和0.5%纤维素酶 （7）酶的作用温度和作用pH值及作用时间：通常细菌水解细胞壁的 温度在 35℃左右。一般放线菌的温度在 30～32℃。霉菌一般在 pH5.4-6.5，放线菌在pH6.5-7.0。作用时间也是影响原生体生成的重 要因素。 （8）菌体密度： （9）酶解方式：酶解时保持较好的通气条件和适当振荡可促进原生 质体释放和分离。
第四节
放线菌原生质体融合育种
第五节
酵母菌原生质体融合育种
第六节
霉菌原生质体融合育种
本章习题
一、名词解释 原生质体再生育种 二、问答题 1、与诱变育种和杂交育种相比较原生质体融合育种有什么优点？ 2、以细菌原生质体融合育种为例试述原生质体融合育种的步骤 3、原生质体再生育种的优点 4、影响酶法分离原生质体的因素 5、影响原生质体融合的因素 6、融合体检出的方法 原生质体融合育种 再生率 融合率
7、影响原生质体再生的因素
8、原生质体活性的检测方法 9、原生质体诱变育种的步骤
原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处 理等因素有关。 1、 酶法分离原生质体的影响因素 （1）培养基组成 （2）菌体培养方式：丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌 和酵母菌多用振荡沉没培养法。 （3）菌体菌龄：丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生 质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前 期和对数期效果最好。
5．原生质体的保存
（1）立即进行融合或其它方式育种 （2） 5％的二甲亚砜或甘油等其他保护剂；液氮。
（二）原生质体再生
l、原生质体再生的影响因素 ①菌体生理状态 ②稳定剂 ③酶浓度和酶作用时间 细菌、放线菌和酵母菌多用糖醇系统的稳定液；霉菌多 用盐溶液系统。 ④再生培养基：丝状真菌、酿酒酵母等的原生质体仅能 在固体培养基上再生，在液体培养基中细胞壁再生不 彻底，不能完全复原。再生培养基要用稳定剂配制， 还含有Ca2+和Mg2+,浓度和原生质体形成时的酶解液相 类似，菌种不同稍有差别。 ⑤残存菌体的分离 ⑥原生质体密度 ⑦排除再生培养基上的冷凝水 ⑧再生 方法
2．化学诱变剂诱变原生质体的一般程序
通常操作程序包括：出发菌株培养和原生质体制备及 再生→选择合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度→加入 原生质体悬浮液，混合（含有高渗溶液，稳定原生质体） →诱变处理→离心弃诱变剂、原生质体沉淀用稳定液洗涤 →稀释、分离到再生平板上（双层平板法）→再生培养→ 观察、筛选突变株→复筛→突变株鉴定。 原生质体诱变周期一般比常规诱变育种要长，难度更 大。
（二）原生质体诱变育种实例
1．扩展青霉原生质体制备 2、原生质体再生 3、原生质体诱变 4、突变株筛的转化
四、微生物原生质融合育种
五、其他微生物原生质体育种
第二节 微生物原生质体融合育种
用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制 成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学 方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色 体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优 良性状于一体的稳定融合子。 聚乙二醇诱导和电融和 聚乙二醇种内融合率可高达27%，种间的融合率也 可达10%，比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱 导融合又将融合率提高10倍。
四、融合体再生
（一）融合体再生
双亲融合后形成的融合体不等于重组体，以霉菌 来说，可能是异核体或杂合二倍体或重组体，它们融 合后营养互补，经过再生，均可在基本培养基上形成 菌落。 融合体的再生包括融合体细胞壁的合成、重建和 融合体的再生。 酵母菌、细菌常用双层平板法，与融合前原生 质再生率测定相同。霉菌和放线菌除了用双层平板法 外，也可把原生质体直接分离到高渗培养基平板上， 同样能得到再生菌落。 复原：原生质体本身形成细胞壁，而且还能从原生质 体细胞上长出有细胞壁的菌丝体
（二）融合体的检出与分离
1．利用营养缺陷型标记选择融合体 2．利用抗性选择融合体 3．用灭活原生质体检出融合体 4．利用荧光染色法选择融合体 5．双亲对碳源利用不同而检出融合体 6．融合体的其他选择方法 ①对昆虫的毒力测定进行融合体的选择 ②利用形态差异选择 ③生化测定指标选择融合体
五、融合重组体检出与遗传分析
原生质体的分离
制
收集
备
纯化
流
活性鉴定 保存
程
处理真菌用酶
纤维素酶 Cellulase
酵母裂解酶 Zymolyase
几丁质酶 Chitinase
β-1,3葡聚糖酶
商品酶
Novozyme234来自 Trichoderma harzianum
Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶
Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶 (for yeast)
（二）原生质体融合的影响因素 1．融合剂： 化学融合剂：不同种类微生物对PEG分子量的要求不尽 相同。细菌：1500-6000；放线菌：1000-1500；真菌： 4000-6000.浓度一般为30%-50%。 物理融合剂：电场和激光 2．温度：丝状真菌适宜融合的温度约为30℃；而细菌 原生质体融合的适温往往偏低，据认为4℃或20℃比 37℃更好；放线菌通常在常温（约20℃）下进行融合。 总的来说在20-30℃下进行融合效果较理想。融合处理 时间从1min-1h，但大多数微生物1～10 min， 3、亲株的亲和力和原生质体的活性 4．无机离子： 在PEG介导融合时，通常需要一定梯度的 Ca2+、Mg2+有效地促进融合 5．其他条件 ：细胞密度，不少于106/ml；应采用年轻 的含残余菌丝少的的原生质体进行融合。
分离重组体，并试验其遗传稳定性研究 （一）重组体的检出和鉴别的方法 直接分离在基本培养基上 1．直接法 或选择培养基上。但是难 以检测表型延迟而又基因 2．间接选择法 重组的融合体 3．钝化选择法
先分离到完全培养基上，然 后再影印到选择培养基上。 这种方法可以检测表型延迟 重组体。
（二）融合率
如采用直接法，融合率的计算公式为： 融合率（％）=基本培养基上再生的菌落/完全培养基上 再生的菌落数×100% 如采用间接法．融合率的记算公式为： 融合率（%）＝重组体后代总数/所有后代总数×100％ 各类微生物之间融合频率差别很大．既使是同一个 种的不同菌株也不一样。霉菌、放线菌融合率约为0.1%一 10%，细菌和酵母菌为10-3一10-6。异种间融合率比同种间 又低得多，如霉菌种间融合率约为0.1％一1%，酵母菌、 放线菌为10-5一10-7。
第九章 工业微生物原生质体 育种和原生质体融合育种
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原生质体育种 微生物原生质体融合育种 细菌原生质体融合育种 放线菌原生质体融合育种 酵母菌原生质体融合育种 霉菌原生质体融合育种
第一节
原生质体育种
什么是原生质体？ 原生质体具有的新特性： 1、对诱变剂敏感 2、对噬菌体不敏感 3、不受感受态影响 包括：原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原 生质体转化育种，原生质体融合育种及其他原生质 体育种。
一、微生物原生质体再生育种
1．原生质体再生育种的一般程序 ： 出发菌株的选择→菌种活化和预培养→原生质体 制备→原生质体再生→高产菌株分离（初筛） →复筛→遗传稳定性鉴定→菌种特性及发酵特 性研究。 2．原生质体再生育种实例 敏感，细胞壁的重建 和分裂能力的再生， 小单孢菌福堤霉素
对数期细胞，不需要 遗传标记
亲本原生质体诱导融合；
融合重组体（称为融合子）分离； 遗传特性分析与测定；
①超声波处理菌体释放原 生质体 一、直接亲本及其遗传标记的选择 ②酶解脱壁释放原生质体
一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为 直接亲本 直接亲本都带有遗传标记