DNA指纹图谱

DNA指纹图谱实验

上课地点：化学楼120 上课时间：选课时

任课教师：薛闯办公地点：生化楼215 电话：84706308

课程要求：

预习实验内容，掌握实验目的及原理、仪器和试剂、实验步骤；

手写完成预习报告（实验名称、实验目的、实验原理、实验器材与试剂、实验方法与步骤），课堂检查预习报告情况。

自带U盘和尺子。

实验注意事项：

1、实验台上物品按实验室管理老师要求摆放整齐；

2、实验废物按实验室管理老师要求收集；

3、实验结束后，经老师检查后方可离开。

实验纪律：

1、按时上课

2、穿实验服（白大衣）

3、不许吃东西，课堂严禁大声喧哗

4、手机静音

实验成绩：

预习报告：20分

实验操作：40分

报告内容：结果和讨论40分

DNA指纹图谱实验

（指导教师：薛闯）

一．实验目的

1. 掌握DNA 指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程

2. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA 片段的长度。

3. 掌握对DNA指纹数据进行基本统计分析方法。

二. DNA指纹图谱实验原理

1984 年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys 及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA 指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。由于DNA 指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。

DNA 指纹具有下述特点：

1. 高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA 图形的概率仅3×10-11 ；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10 -19。全世界人口约50 亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA 指纹的图形完全相同。

2. 稳定的遗传性：DNA 是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50 % 给子代。

3. 体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA 指纹图形完全一致。

DNA 指纹图谱法的基本操作：

从生物样品中提取DNA （DNA 一般都有部分的降解），可运用PCR 技术扩增出高可变位点（如VNTR 系统，串联重复的小卫星DNA 等）或者完整的基因组DNA ，然后将扩增出的DNA 酶切成DNA 片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA 探针与膜上具有互补碱基序列的DNA 片段杂交，用放射自显影便可获得DNA 指纹图谱。

DNA 指纹图谱法的基本操作示意图

琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA 在凝胶中的位置。如有必要，

还可以从凝胶中回收DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp 的DNA。长度100kb 或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。

在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

DNA指纹数据处理：

1.DNA指纹图谱的共有带率（Band-sharing，简称BS）

BS=2N AB/(N A＋N B)

式中：N A指个体A的条带数，N B为个体B的条带数，N AB指个体A和个体B共有的条带数。

2.平均等位基因频率(q)及最低平均杂合率(Ht)

q ＝l-(1-BS)1/2，Ht＝l-q

式中BS为共有带率。

3.两个个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率（P）

两个无关个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率为：

P1 =（1-2BS＋2BS2 ）n/BS；

两个同胞个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率为：

P2 =［1-0.5q（1-q）2（4-q）］n／BS

式中：n 为个体的平均条带数，q 为平均等位基因频率。

三. 实验材料和试剂

1.DNA 样品：犯罪现场CS DNA 样品、嫌疑犯S1 DNA 样品、嫌疑犯S2 DNA 样品、嫌疑犯S3 DNA 样品

2. 化学试剂和溶液

(1). TAE（50 ×）

Tris 242g

冰醋酸57.1ml

EDTA （0.5mol/L pH 8.0 ）100ml

使用时用蒸馏水稀释50 倍。

(2).琼脂糖agarose （电泳级）

3. 仪器设备和消耗品

电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、移液器（10 μ l）、离心管、一次性枪头，一次性手套。

四. 实验步骤

DNA样本的琼脂糖凝胶电泳：

1.用量筒量20ml电泳缓冲液TAE倒入烧杯中，然后用天平称量0.2g琼脂糖倒

入烧杯中；

2.用微波炉加热30秒左右使琼脂糖完全融化（当心煮沸的液体，溢出！）；

3.冷却至65 ℃左右时用微量移液器加入10 μl Goldview TM核酸染料，充分混

匀；

4.将制胶器置于工作台面上，将胶模和梳子分别插入制胶器内，梳子应距胶模

一端约1cm，梳齿底边与胶模表面保持0.5-1mm的间隙；

5.待琼脂糖冷却至60℃左右时，小心倒入胶模内（避免产生气泡），使凝胶缓

慢展开直至在胶模表面形成一层约3mm厚的均匀胶层，室温静置30分钟；

6.待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出梳子（注意切勿使样品槽破裂），在胶

模上形成相互隔开的样品槽；

7.将凝胶连同胶模放入电泳槽平台上，倒入TAE缓冲液直至浸没过凝胶面

2-3mm，小心去除样品槽中的气泡；

8.用微量移液器缓慢地将3μL DNA样品分别加入到样品槽内，注意避免因样品

过多而溢出，污染邻近样品；

9.加样完毕后，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开

始电泳，在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm（电压值V/电泳槽两极之间距离cm）；

10.当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳；关闭电源，然后将胶

板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的保鲜膜上，在波长254nm紫外灯下进行观察，DNA条带呈现荧光；在紫外灯下观察DNA 的迁移位置；