脓毒症心肌功能障碍模型大鼠的构建与评价

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research

1249

·研究原著·

张胜，男，1989年生，河北省沧州市人，回族，宁夏医科大学在读硕士，医师，主要从事重症医学研究。

通讯作者：王晓红，博士，主任医师，副教授，硕士生导师，宁夏医科大学总医院ICU 科，宁夏回族自治区银川市 750004

文献标识码:B

投稿日期：2019-07-03 送审日期：2019-07-05 采用日期：2019-08-21 在线日期：2019-10-23

Zhang Sheng, Master candidate, Physician, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Corresponding author: Wang Xiaohong, MD, Chief physician, Associate professor, ICU, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

脓毒症心肌功能障碍模型大鼠的构建与评价

张 胜1，白吉佳2，徐艳萍3，王晓红2 (1宁夏医科大学，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏医科大学总医院，2ICU 科，3心脏中心

功能检查部，宁夏回族自治区银川市 750004)

DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2464 ORCID: 0000-0002-9840-8260(张胜)

文章快速阅读：

文题释义：

脓毒症心肌功能障碍：是脓毒症或脓毒症休克最严重的并发症之一，其特征为心脏整体可逆的功能障碍，但心功能障碍的严重程度仍是影响脓毒症预后的重要因素之一，若不能及时有效地改善脓毒症心肌功能障碍将显著增加脓毒症患者病死率。

脂多糖：是革兰阴性菌重要的致病物质，注射脂多糖方法虽不能完全模拟脓毒症病理生理的复杂性，但该方法致病方式统一、可控，动物产生的临床表现具有同质性，并可导致脓毒症休克等严重病理变化，因此大部分脓毒症临床前研究都基于此方法。

摘要

背景：目前认为心肌线粒体结构与功能的损伤在脓毒症心肌功能障碍中起着关键作用。 目的：构建大鼠脓毒症心肌功能障碍模型，为研究该疾病提供有效的实验手段。

方法：72只清洁级雄性SD 大鼠随机分为对照组28只、脂多糖组44只；两组大鼠各随机抽取20只用于观察造模后10 d 生存率；脂多糖组剩余24只依据造模后时相分为脂多糖 6，12，24 h 组3个亚组，每组8只。脂多糖组腹腔注射10 mg/kg 脂多糖建立大鼠脓毒症模型，对照组注射等量生理盐水。脂多糖各亚组分别于各时相点行超声心动图检查心功能。留取心肌组织光镜观察心肌组织病理形态结构，透射电镜观察心肌超微结构；ELISA 法检测大鼠静脉血清心肌肌钙蛋白、脑钠肽浓度。实验经宁夏医科大学总医院伦理审查委员会批准(审批号：2018-320)

结果与结论：①与对照组比较，脂多糖组大鼠10 d 生存率明显降低；②与对照组比较，脂多糖 6 h 组左室射血分数、左室缩短分数未见降低(P 均> 0.05)，脂多糖 12 h 组、脂多糖 24 h 组左室射血分数、左室缩短分数显著降低(P 均< 0.01)，且随时间延长降低更明显(P 均< 0.01)；③与对照组比较，脂多糖 12 h 组、脂多糖 24 h 组血清肌钙蛋白Ⅰ、脑钠肽水平升高(P 均< 0.01)，且随脂多糖注射时间延长，肌钙蛋白Ⅰ、脑钠肽水平逐渐升高(P 均< 0.01)；④脂多糖各组心肌病理形态及超微结构与对照组比较出现明显损伤，且随着脂多糖注射时间延长损伤加重；⑤结果说明，实验成功建立大鼠脓毒症心肌功能障碍模型，该模型稳定可靠。 关键词：

脓毒症；脂多糖；大鼠模型；心肌功能障碍 中图分类号：R446；R496；R318 基金资助：

国家自然科学基金资助项目(81460288)，项目负责人：王晓红

Constructing and assessing a rat model of sepsis-induced myocardial dysfunction

Zhang Sheng 1, Bai Jijia 2, Xu Yanping 3, Wang Xiaohong 2 (1Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2ICU, 3Department of Heart Center Function Examination, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China)

张胜，白吉佳，徐艳萍，王晓红. 脓毒症心肌功能障碍模型大鼠的构建与评价[J]. 中国组织工程研究，2020，24(8):1249-1253. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2464

1250

Abstract

BACKGROUND: It is currently believed that myocardial mitochondrial structure and function damage play a key role in sepsis-induced myocardial dysfunction.

OBJECTIVE: To construct a rat model of sepsis-induced myocardial dysfunction and provide an effective experimental method for studying the disease.

METHODS: Seventy-two SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (n =28) and lipopolysaccharide (LPS) group (n =44). Twenty rats were randomly selected from each group for observation of 10 days of survival. According to the post-modeling phase, the remaining 24 rats of the LPS group were divided into three subgroups, LPS 6-hour group, LPS 12-hour group and LPS 24-hour group, with 8 rats in each group. A sepsis model was constructed by intraperitoneal injection of 10 mg/kg LPS in the LPS group, and the control group was injected with an equal volume of normal saline. Echocardiographic examination of cardiac function was performed at each phase in each LPS subgroup. Myocardial histopathological morphology was observed by light microscopy, and myocardial ultrastructure was observed by transmission electron microscopy. Serum cardiac troponin and brain natriuretic peptide levels were measured by ELISA. The study was approved by the Ethic Committee of General Hospital of Ningxia Medical University in China (approval No. 2018-320). RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the 10-day survival rate of rats in the LPS subgroups was lower.

Compared with the control group, there was no reduction in left ventricular ejection fraction and left fractional shortening in the LPS 6-hour group (both P > 0.05). While in the LPS 12-hour group and LPS 24-hour group, the left ventricular ejection fraction and left fractional shortening significantly decreased (all P < 0.01)，and the decrease was more obvious with time (all P < 0.01). Compared with the control group, the serum cardiac troponin and brain natriuretic peptide levels were significantly increased in the LPS 12-hour group and LPS 24-hour group (all P < 0.01), and the serum cardiac troponin and brain natriuretic peptide levels gradually increased with LPS injection time (all P < 0.01). The myocardial pathological morphology and ultrastructure of the LPS subgroups showed obvious damage compared with the control group, and the damage was more obvious with the prolongation of LPS injection time. In this experiment, we successfully constructed a stable and reliable model of sepsis-induced myocardial dysfunction in rats, which is an ideal animal model for clinical research of sepsis cardiomyopathy. Key words: sepsis; lipopolysaccharide; rat model; myocardial dysfunction

Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81460288 (to WXH)

0 引言 Introduction

脓毒症是指机体对感染反应失调导致危及生命的器官功能障碍[1]。脓毒症心肌功能障碍(sepsis-induced myocardial dysfunction ，SIMD)是脓毒症或脓毒症休克最严重的并发症之一，其特征为心脏整体但可逆的功能障碍[2]，但心功能障碍的严重程度仍是影响脓毒症预后的重要因素之一。研究表明大约50%脓毒症患者有心肌功能障碍的表现，其死亡率高达70%-90%，因此改善脓毒症后的心肌功能障碍和心肌损伤能改善患者的预后[3-4]。脓毒症心肌功能障碍的发病机制复杂，涉及炎症递质失调、线粒体功能障碍、氧化应激、钙调节紊乱、自主神经系统失调和内皮功能障碍等[5-6]，但具体的发病机制尚未完全阐明。

近年在脓毒症患者和动物模型研究中发现脓毒症心脏冠脉血流正常或增加，极少发生心肌细胞凋亡和坏死，但存在心肌收缩装置的损伤，目前认为心肌线粒体结构与功能的损伤在脓毒症心肌功能障碍中起着关键作用[7]。因此创建能够模拟临床脓毒症心肌功能障碍的动物模型对探索脓毒症心肌功能障碍发病机制，寻找有效的治疗手段极其重要。目前已知的应用盲肠结扎穿孔术(CLP)诱导脓毒症大鼠心肌功能障碍，但该技术受肠道内容物的细菌组成和手术操作差异性等影响，存在变异性[8]。该研究拟采用大鼠腹腔内注射脂多糖建立脓毒症心肌功能障碍模型，通过超声监测大鼠心功能、测定心肌酶学、观察大鼠心肌病理形态和超微结构变化，旨在建立可靠、稳定的脓毒症心肌功能障碍动物模型。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年6月至2019年3月在宁夏

医科大学颅脑实验室完成。 1.3 材料

1.3.1 主要试剂与仪器 脂多糖(LPS ，Escherichia coli O55:B5，美国sigma 公司，批号：028M4094V)，水合氯醛(天津市大茂化学试剂公司，批号：20170718)，大鼠心肌肌钙蛋白I(cTnI/TNNI3)酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：8UL4XU1N)，大鼠脑钠肽酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：KWXJFZUQAL)。全波长酶标仪(美国Bio-tek 公司)，Vivid 7 pro 超声诊断扫描仪(美国GE 公司)。

1.3.2 实验分组及模型建立 SPF 级雄性SD 大鼠72只，9至10周龄，体质量260-280 g ，购自宁夏医科大学动物实验中心，动物许可证号：SCXK(宁)2015-0001。常规饲养于温度22-25 ℃，湿度(55±5)%，12 h 明暗交替，自由摄食、饮水。大鼠实验前12 h 禁食，自由饮水。实验经宁夏医科大学总医院伦理审查委员会批准(审批号：2018-320)。 1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 将72只大鼠随机分为对照组28只；脂多糖组44只；两组各取20只观察造模后10 d 生存率；脂多糖组剩余24只根据腹腔注射内毒素后不同时相又分为脂多糖 6，12，24 h 组3个亚组，每组8只。

1.4.2 建立大鼠脓毒症模型 将脂多糖溶于生理盐水，配制成质量浓度为1 g/L 的溶液，脂多糖组腹腔注射10 mg/kg 脂多糖建立大鼠脓毒症模型[9-10]，对照组注射等量的生理盐水。 1.4.3 指标检测方法 对照组腹腔注射生理盐水后6 h ，脂多糖各亚组大鼠分别于造模后6，12，24 h 相应的时相点，用3 mL/kg 体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉后行超声心动图检查心功能，随后下腔静脉采血并开胸立即摘取心脏放入4 ℃生理盐水漂洗，沿左心室最大横径冠状切面取