免疫化学技术

参考文献
Cuatrecasas,P.(1970) Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads J.Biol.Chem.245,3059-3065. （夏泉） 二．免疫前抗原准备及增强其抗原性的方法
质控实验
1. 在抗体固相化后，将洗脱液过滤，测定蛋白质总量（方法见附录 4），计算抗 体的固相化偶联率，通常偶联率应大于 80%。 2. 洗脱抗原的纯度，可用 SDS-PAGE 测定。
实验要点及说明
1. 实验需要采用重蒸馏水，以免水中化合物含有游离氨基的干扰。不然，固相化 的洗脱过程中氨基可能与醛基反应。 2. 如果醛基活化的凝胶，活化后不能及时应用，可放在含 0.5% 戊二醛的 0.1 mol / L 磷酸缓冲液（pH7.4）中，4℃保存，可稳定保存数周。 3. 经纯化的单克隆或多克隆抗体，均可用来制备含抗体的介质。每 ml 的聚丙烯 酰胺或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶小珠，可结合 1-3mg 抗体。 4. 采用低pH的缓冲液以洗脱抗体，是最有效的方法，但如此酸性条件不适于被纯 化的抗体，则可用含吸水性能的浓盐溶液（如 4 mol/L MgCl2 , 3 mol/L KSCN）。
试剂及仪器
待固相化抗体 聚丙烯酰胺或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶小珠（有市售商品） 25%戊二醛（电镜级） 含待纯化抗原的混合物 1 mol / L 磷酸钾缓冲液，pH 7.4 (见附录 1) 含 0.1 mol / L 甘氨酸的 0.1 mol / L 磷酸缓冲液 （见附录 1） PBS （见附录 1） PBS + 0.01 mol / L HCl + 叠氮钠（ 叠氮钠为有毒试剂） 洗脱缓冲液： 0. 2 mol / L HCl + 甘氨酸缓冲液 ，pH 2.8 再生缓冲液： 0.2 mol / L HCl + 甘氨酸缓冲液 pH 2.2 1mol/L 磷酸氢二钾
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1． 将层析柱与蠕动泵及部分收集器连接，如无此类设备可用手工操作（则参见后 列说明）； 2． 将含待纯化抗原的混合物缓慢上样（大约 10ml/h）,如果混合物的体积大于柱 体积，可将混合物过柱后再循环上样； 3． 在室温或 4℃孵育 1-2h，参照抗原的稳定性来选择温度； 4． 在 4℃，用 PBS 洗柱。直至其流出液 A280nm < 0 .05。 （三）抗原洗脱 1． 在 4℃，用 0.2 mol / L pH 2.8 HCl-甘氨酸缓冲液洗脱抗原，按 1-2ml/管收 集洗脱液。测定每一管的 A280nm； 2． 当 A280nm < 0.05 时，先后用 0.2 mol / L pH 2.2 HCl-甘氨酸缓冲液及含 0.1g/L 叠氮钠的 PBS 洗柱； 3． 含有抗原组分的各管，每管按 100-200μl / ml加入 1 mol / L K2HPO4 ,以中 和其酸性； 4． 用 SDS-PAGE 或功能检测法（如 RIA, ELISA）检测，以确定各管有无抗原的存 在； 5． 将含有抗原的各管合并，在 4℃对 PBS 透析。如果需要，可对抗原液进行浓 缩。
基本原理
为了得到抗小分子肽的抗体，可通过载体蛋白与其交联来加强其免疫源性。此外， 当应用固相化短肽进行固相免疫试验（如 ELISA,RIA）时，由于 6-16 肽一般和塑料表面 的结合不够满意，也需用肽-载体蛋白复合物进行包被。曾用多种交联方法来制备肽-载 体蛋白复合物，以下介绍其中应用广泛的戊二醛和羰二亚胺交联两种方法。戊二醛主要 与蛋白分子的赖氨酸残基反应、也与α-氨基及半胱氨酸的巯基反应。羰基二亚胺则主要 与α-氨基、ε-氨基及羰基反应，其次也与巯基和酚羟基反应。
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重蒸馏水 透析袋 层析柱 （2.5 cm × 20cm ） 真空泵 烧结玻璃漏斗 蠕动泵 UV 监测器 离心机 磁力搅拌棒器 旋转振荡器 通风橱
操作步骤
(一） 基质固相化抗体的制备 1. 2. 抗体溶液对 0.1 mol / L pH7.4 磷酸缓冲液透析，4℃，过夜； 将 20ml 湿润的凝胶小珠移入烧结玻璃漏斗；用 3-5 个柱体积的 重蒸馏水洗， 然后再以 0.1 mol / L pH7.4 磷酸缓冲液洗两次； 3. 将凝胶移入适当的烧杯中，在通风橱内，分别加入 50ml 重蒸馏水，10ml 1 mol / L 磷酸缓冲液（pH7.4），及 20ml 25% 戊二醛； 4. 烧杯加盖，放入 37℃恒温振荡器中，缓慢振荡过夜； 5. 将凝胶转移到烧结玻璃漏斗中，用 20-40 倍于凝胶体积的 0.1 mol / L pH7.4 磷酸缓冲液充分洗涤，以除去多余的戊二醛，得到活化的凝胶； 6. 每 10ml 活化的凝胶，加入含 10-20mg 抗体的 10ml 0.1 mol / L pH7.4 磷酸 缓冲液； 7. 上述混合物在 37℃，用搅拌器缓慢搅拌 18h； 8. 混合物转入 50ml 离心管中，离心（4℃，300× g 离心 20 分），收集凝胶，再 加 10-20ml PBS 离心洗涤，直至其上清液的 A280nm < 0.05; 9. 取凝胶，加入 50ml 含 0.1 mol / L 甘氨酸的 0.1 mol / L 磷酸缓冲液 ，室 温放置 2 小时，以中和残余的醛基。然后在 300×g 离心 20 分，弃上清； 10. 将含有固相化抗体的凝胶装入适当的层析柱中，依次用洗脱缓冲液及 PBS 洗 涤，开始使用。也可以在含 0.1g/L 叠氮钠的 PBS 中，4℃长期保存。 （二）抗原与含抗体的固相化介质结合
操作步骤
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1. 纯化的抗体对结合缓冲液透析过夜（4°C）； 2. 加 10ml CNBr-Sepharose 4B 到 10ml 抗体溶液中。放在摇床或振荡器上，轻轻 振摇过夜（4°C）。( 图 2-1-1 )；
图 2-1-1 CNBr 活化的 Sepharose 4B 与抗体 交联示意图
3.
试剂及仪器
• • • • • • 纯化的抗体（50-100mg 溶于 10ml 柠檬酸缓冲液）。 CNBr 活化的 Sepharose 4B（有商品供应），凝胶沉淀体积 10ml。 结合缓冲液：0.1mol /L 柠檬酸钠缓冲液,pH6.5 (见附录一)。 洗脱缓冲液：0.1mol /L 柠檬酸钠缓冲液,pH6.5 含 1mol/L 的 NaCl。 2 mol /L 乙醇胺 透析袋 (MW CO 10 000)
基本原理
增强抗体的应答尤其是对于剂量小或抗原性低抗原的应答，最常用的方法是与 抗原同时注入合适的佐剂。当佐剂含有细菌组分时，可起到增加对有效抗原的摄 取、延长抗原的存在时间及非特异性的增强免疫系统的反应的作用。 佐剂的选择对抗体的亚型及应答性有影响。一般的规律是，在小鼠应用百日咳 杆菌毒素或氢氧化铝会增加过敏性抗体类型：IgG1及IgE。相反，应用完全福氏 （Freund’s）佐剂会增强IgG2a同工型的应答，而含霍乱毒素的佐剂会增强IgA的应 答。 对于小分子糖半抗原的处理参见第六篇第一章。
基本原理
Sepharose 是琼脂糖凝胶颗粒的商品名，可与抗体连接制成亲和层析载体。 Sepharose 需先经活化后再与蛋白质连接。经溴化氰（CNBr）活化来制备亲和层析 载体是最常用的方法。琼脂糖、交联琼脂糖和聚丙烯酰胺都可以被 CNBr 活化而作 为与蛋白质结合的固相载体。抗体通过赖氨酸残基上的ε-氨基与活化了的载体以共 价键连接。连接后形成的亲和层析载体，可吸附相应的抗原从而分离提纯抗原或带 有特异抗原决定簇的抗原片段。本文主要介绍 CNBr 活化的 Sepharose 4B 与抗体的 连接。
试剂及仪器
佐剂（有商品化佐剂，或自制佐剂） 注射器（小鼠用 1ml，家兔用 2-5ml） 针头 （小鼠用 25-G, 家兔用 30-G） 聚乙烯塑料管 双向注射器装置（见图 2-1-1）
操作步骤
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（一）氢氧化铝法 1. 溶解 30g硫酸铝铵（NH4Al (SO4)2.12H2O）于 360ml蒸馏水中； 2. 慢慢加入 150 ml 1N NaOH； 3. 在室温放置 30 min； 4. 以蒸馏水洗沉淀 3 次； 5. 制成 50-60mg/ ml 悬液，在４℃保存； 6. 以每小鼠１mg 与抗原同时注射； 7. 溶于盐水的抗原与佐剂（不完全或完全佐剂，仅完全佐剂含有结核分支杆菌） 可用上述特殊的双向注射器设备混匀； 8. 每小鼠的注射总量一般为 0.2ml 皮下注射，或 0.05ml 足掌注射，注意勿将抗 原乳剂用于静脉注射； 9. 也可用其它脂类或矿物油来代替上述佐剂，制成水－油、或油－水乳剂再加入 或不加细菌细胞壁成分，用于免疫小鼠或家兔。
图 2-1-2
免疫动物用的双向注射器
(二）百日咳毒素法 每小鼠 100ng 百日咳毒素与抗原同时静脉注射。 (三) 霍乱毒素法 与抗原同时口服，每小鼠用量为 100-500ng.
实验要点及说明
１． 用前要确定抗原－佐剂复合物是稳定的：乳剂滴置冷水中不分散； ２． 福氏完全佐剂如注入皮下或滴入眼，十分有害； ３． 在第一次免疫后或免疫增强剂注射后，一般抗体的滴度峰在 10-30 天期间 出现，注意在此期间进行监测。
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参考文献
Moncada,C., Torres, V. And Israel,Y. (1993) Simple method for the preparation of emulsions for immunolization. J. Immunol. Meth. 152, 133-140 （朱正 美） 三．小分子肽抗原与载体蛋白交连
加 1ml 2 mol /L 乙醇胺溶液（封闭 CNBr-Sepharose 4B 残余的活性基团）， 继续振摇 1 小时（4°C）； 4. 将抗体- Sepharose 4B 装到适当的层析柱中。用两倍柱体积的结合缓冲液洗 柱，接着用两倍柱体积的洗脱缓冲液洗，最后用两倍柱体积的 PBS 洗。凝胶在 使用和保存时，须始终保持在液面以下，不得干燥； 5. 抗体- Sepharose 4B 加叠氮钠（0.2g/L）后 4°C 储存。
第二篇 免疫化学技术
第一章 抗血清制备
第一节
一．抗体亲和层析纯化法
抗原纯化及制备的基本方法
基本源自文库理
在生物化学研究及生物技术工程中，免疫亲和层析广泛应用于从复杂混合物中 纯化蛋白质。应用固相化的抗体，通过常规的一步法可将抗原纯化 1000-10000 倍。用固相化抗体纯化抗原的方法可分为三个主要步骤： 抗体的固相化； 抗原与含抗体的介质结合； 洗脱抗原。 如果有所需的免疫亲和介质，根据下面的纯化蛋白质的操作步骤，可方便的应 用于多种的抗原纯化。
对照实验
抗体与 CNBr - Sepharose 4B 的结合量可通过结合前后蛋白量的变化来确定。
实验要点及说明
1. 抗体样品不得含有其它带氨基的化合物。
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2.
3.
在交联时某些单克隆抗体活性会明显丧失。如果抗体的活性在交联过程中剧烈 下降，则应在扩大交联之前停止反应或选用其它方法（例如用戊二醛活化的载 体）。 抗体的交联是不定向的，如果赖氨酸残基含在抗体结合位点中，会导致其失去 抗原结合能力。
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5.
如不具备蠕动泵及部分收集器，则可利用重力手动收集 0.5-2ml/管，通过紫 外分光光度计测定 280nm 的吸收度。 6. 在用低 pH 溶液洗脱时，有抗体可能从介质上脱离。因此，IgG 的重链及轻链 可能污染洗脱组分。
参考文献
1. Guesdon, JL. and Avameas, S. (1976) Polyacrylamide-agarose beads foe the preparation of effective immunoabsorbants. J Immunol. Meth. 11, 129-133 2. Ternyck, T. and Avameas, S. (1972) Polyacrylamide-protein immunoabsorbants prepared with glutaraldehyde. FEBS Lett. 23, 34-28 （ 朱正美 ） 附：抗体-Sepharose 4B 亲和层析柱的制备