多酚氧化酶

Sephadex的机械稳定性相对较差， 不耐压，要求流速较慢，不能实现快速 而高效的分离。 Sephadex LH-20和LH-60是在 Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基 基团形成LH型烷基化葡聚糖凝胶，适 用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性 物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。
琼脂糖凝胶
现在PPO的应用多用于提高植物对病原 菌的抗性。 PPO与一些水果和作物的褐化有关。 PPO是决定红茶品质的关键酶类。在啤 酒生产过中,PPO与啤酒风味陈化紧密相 关。反之,为了防止水果褐化,保持水果新 鲜,生产上也运用多种方法降低水果中 PPO活性和含量。
提取和纯化
制备丙酮粉（ 4℃ ）
- 30℃的果实解冻 与丙 酮-蒸馏水混合 粉碎 抽滤 滤渣用-30 ℃的丙 酮冲洗 滤渣既为丙酮 粉 室温下晾干。
包括Sepharose和Bio-gel A等。 Sepharose与2,3二溴丙醇反应，形Sepharose CL型凝胶（CL-2B ~4B），分离特性基本没变，
琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，
但热稳定性和化学稳定性都有所提高，可以在更
广泛的pH范围内应用。
琼脂糖凝胶稳定性要超过一般的葡聚糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样 品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶的机械强 度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两 种凝胶，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以 比较快。 琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范 围很广，适合于分离大分子物质，但分辨 率较低。琼脂糖凝胶不耐高温。
琼酯糖凝胶
已装柱好的苯基琼脂糖 PenlysepharoseCL4B柱,用高盐缓冲 液A预平衡, 酶液借助梯级蠕动泵加 在柱上,洗脱液以一定流速,从高盐缓 冲液A减弱至低盐缓冲液B,最后以 50%的乙二醇进行洗脱 。由紫外监 控器(280nm)监控，调节分级收集器 流速收集。
酶活性测定 测定波长视底物而定,测定 温度为25℃,反应液由pH4的柠檬 磷酸缓冲液、测定底物和酶液组 成,一个酶活力单位为测定条件下, 每分钟引起光密度改变0.001所需 的酶量。
PPO的纯化常采用盐析法。盐析主 要是利用酶蛋白在高浓度的盐溶液 中溶解度减小而析出的原理。硫酸 按由于价廉、溶解度大，且能使蛋 白质稳定，故是最常用的盐析剂。
多酚氧化酶的SDS-PAGE电泳纯 度鉴定、分子量测定 常用SDS-PAGE电泳对多酚氧化酶 的纯度和分子量进行测定，并推 测同工酶的数量。
PPO测定 1.酶对底物专一性 取酶液,加磷酸缓冲液,再迅速加 入邻苯二酚,摇匀后在10min, 20min, 30min时测光密度。同样，以对甲 酚，对苯二酚，酪氨酸，间苯二酚 为底物进行测定。
2.pH对酶活力的影响 取6份酶液, 同时取对苯二酚溶液,也 为6份,混合并分别加入pH从5.8,6.2, 6.6, 7.0, 7.4,7.8磷酸缓冲液各2ml,反应 10min, 20min,30min,测定在410nm处的 光密度。
活性酶的提取 用磷酸缓冲液将丙酮粉溶解 离心 沉淀再用磷酸缓冲液提 取1次 合并2次离心后上清液 浓缩 粗酶
(NH4)2SO4分级沉淀 (NH4)2SO4按质量浓度进行9个 分级 加入粗酶液中 0℃ 下静置 离心 上清液再加 入下一级的(NH4)2SO4浓度（重 复操作，测定每次沉淀的酶活性 和蛋白含量）
葡聚糖凝胶
文献报道植物组织中PPO分子量一般 介于40-70K之间，根据葡聚糖凝胶分离大 分子的原理，葡聚糖凝胶分离PPO与杂蛋白。 不同型号凝胶的分离范围是根据球形蛋白 理论模型确定的，而实际分离蛋白的结构 与理论模型常有较大差异，因此在纯化PPO 时，采用不同型号的葡聚糖凝胶进 行分离效果的比较。
多酚ห้องสมุดไป่ตู้化酶的研究
简介
多酚氧化酶(polyphenol oxidase， 简称PPO）是一类广泛存在于植 物体内的含铜金属酶类.由于其与 果蔬加工、品质等密切相关,人们 很早就开始对它进行深入细致的 研究.
• 铜是酶的活性中心，从蛋白质中除 去一部分或全部铜，将引起酶活性 下降或完全失活，若添加铜的话， 酶活又能恢复。不同果蔬中的PPO铜 辅基的数量会有所不同，如蘑菇中 PPO含4个铜原子，而扁豆的PPO含1 个铜原子。
凝胶层析
层析系统
装柱 平衡 加样 洗脱 收集
层析柱
梯度混合仪
恒流泵
部分收集器
5.抑制剂对PPO活性的影响
将磷酸缓冲液分别与每种抑制 剂混合,置于水浴保温。取酶液, 对苯 二酚溶液同时保温,迅速混合后保温, 分别和多种溶液抑制剂混合,于 410nm处比色测定,参比液是不加抑 制剂的酶活性。
• 葡聚糖凝胶 Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、 弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的。 强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解 断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化 剂接触。Sephadex在高温下稳定，可以煮 沸消毒。 在用Sephadex进行凝胶层析实验时常 使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液。
3.温度对酶活力的影响
取 PPO 粗酶液、醋酸缓冲液、儿茶酚(底 物)溶液，分别于5 、10 、20、30、35、 40、45、50、55 、60 、65℃温度下保温 2.0min，测定PPO 的活力和确定P P O 最 适反应温度。
4.PPO 的热稳定性
将粗酶液分别在20、40、60、80℃ 条件下分别保温0.0、3.0、7.0、15.0、 25.0min 后，测定PPO的活力和确定 P P O 最适反应温度。