CRISPR-Cas9技术
CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
6.降低脱靶效应
Cas9切口酶
通过点突变的方 法，使Cas9只有 单链切割活性， 类似于切口酶
沈彬，2015
7.视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理
知识回顾 Knowledge Review
祝您成功！
?crisprcas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰?crrna结合相关的cas蛋白后形成crrnacas蛋白复合体通过碱基互补配对精确地与目标dna相结合随后cas蛋白对目标dna进行断裂和降解
基因编辑技术CRISPR/Cas9
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
crispr cas9原理简介
crispr cas9原理简介CRISPR-Cas9基因编辑技术，是一种通过靶向剪切基因组中特定DNA序列的方法。
该技术最初源自一种天然的细菌免疫系统，可用于编辑生物体的基因组。
CRISPR（簇状规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是细菌和古细菌基因组中的一种特殊DNA序列，以重复、间隔和短回文特点而命名。
CRISPR序列常常与Cas（CRISPR-associated protein）基因一起出现，这些Cas基因编码一类能够识别并修剪DNA的酶。
CRISPR-Cas系统中最常用的是Cas9酶，它是通过向CRISPR-Cas9复合物中引入特定的RNA分子来实现DNA靶向。
这种RNA分子称为单导RNA（sgRNA），它是一种具有20个核苷酸的短链RNA，结合了用于指引Cas9定位到特定目标序列的脱氧核苷酸。
sgRNA与Cas9酶形成复合物后，可以通过碱基互补配对与基因组DNA中的目标序列结合。
当sgRNA与Cas9复合物与目标DNA序列配对时，Cas9酶便会被激活并剪切其靶向序列。
这一过程引发DNA修复机制，使得目标序列得以重组或删除。
如果提供了外源DNA修复模板，修复机制还可以将该模板中的DNA片段插入到被剪切的部分，实现想要的基因修饰。
CRISPR-Cas9技术的优势在于其简单性和高效性。
相较于传统的基因编辑技术，CRISPR-Cas9可以更加准确地指定目标序列，并在短时间内完成基因组的编辑。
它已被广泛应用于基础科学研究、生物医学研究以及农业领域，为基因治疗和作物改良等领域带来了突破性的进展。
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享在现代生物学研究中，基因编辑技术的出现为研究人员提供了一种高效、精确、低成本的方式来研究基因功能和调控机制。
CRISPR-Cas9系统作为一种革命性的基因编辑工具被广泛应用于基因组编辑、疾病治疗和农业改良等领域。
本文将为您介绍CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程，并分享一些最佳实践。
CRISPR-Cas9基因编辑技术概述CRISPR-Cas9是一种依靠细菌天然的免疫机制发展而来的基因编辑技术。
CRISPR是一种特殊的DNA序列，可与Cas9酶一起，通过识别和切割DNA序列来精确编辑基因组。
CRISPR-Cas9系统的主要组成部分包括CRISPR RNA （crRNA）、转录单元结构化RNA（tracrRNA）和Cas9酶。
crRNA负责识别目标DNA序列，而tracrRNA将crRNA与Cas9酶结合起来形成活跃的CRISPR-Cas9复合物。
CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程1. 设计并合成RNA引导序列在使用CRISPR-Cas9进行基因编辑之前，首先需要设计并合成RNA引导序列。
该序列用于指导Cas9酶精确识别和切割目标基因组DNA。
合成的RNA引导序列通常由crRNA和tracrRNA合成而成，也可以合成一个融合的single-guide RNA （sgRNA）。
2. 构建CRISPR-Cas9载体CRISPR-Cas9基因编辑需要将Cas9酶和RNA引导序列导入目标细胞内。
可使用载体如质粒或病毒进行基因编辑构建。
选择合适的载体需考虑目标细胞类型、转染效率和所需编辑范围等因素。
将Cas9基因和RNA引导序列克隆至载体后，可通过转染或病毒介导转染等方法将其导入目标细胞。
3. 确定编辑效果在导入CRISPR-Cas9系统后，使用分子生物学方法来验证编辑效果。
例如，PCR、测序、Western blot或免疫组化等技术可以用于检测目标基因的突变、修复或敲除效果。
cas9基因敲除原理
cas9基因敲除原理
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，可以通过切割DNA序列
来实现基因敲除。
CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，是一种天然存在于细菌和
古细菌中的免疫系统。
Cas9则是CRISPR-Cas9系统中所使用
的酶。
CRISPR-Cas9系统通过三个主要组件来实现基因敲除：CRISPR RNA（crRNA），tracrRNA和Cas9。
首先，crRNA
和tracrRNA结合形成一个复合体，被称为单导螺旋RNA （sgRNA）。
sgRNA可以与Cas9酶结合，并引导Cas9 酶与
特定DNA序列中的目标基因相结合。
当Cas9与sgRNA定位到目标基因的特定序列时，它会切割DNA，导致基因序列中的断裂。
细胞会试图修复这个断裂，
但通常会导致不完整的修复，从而引起基因缺失或突变。
这就实现了基因敲除的目标。
此外，通过供应外源的DNA修复模板，可以利用Cas9的断
裂修复机制来进行目标基因的修复。
这种方法被称为基因敲入，可以在目标基因上插入新的基因组成部分。
总而言之，CRISPR-Cas9系统利用Cas9酶和sgRNA的组合，定位和切割特定的DNA序列，实现了基因敲除和敲入的目标。
这项技术在基因研究和治疗领域有着广泛的应用前景。
crispr cas9原理及应用
crispr cas9原理及应用CRISPR-Cas9 是一种革命性的基因编辑技术，其原理基于一种存在于细菌免疫系统中的天然机制。
该技术利用了一种称为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats （CRISPR）的 DNA 序列和 Cas9 蛋白质，能够准确地识别和编辑基因组中的特定目标序列。
CRISPR-Cas9 技术的基本原理是通过设计特定的引导 RNA 来指导 Cas9 蛋白质精确地结合到目标 DNA 序列上。
一旦 Cas9与目标 DNA 结合，它会切割 DNA 分子，从而可能引发自然修复过程或介导外源 DNA 片段嵌入到基因组中。
这种技术的目标序列可以根据需求进行设计，从而实现精确的基因组编辑。
CRISPR-Cas9 技术在基因组编辑领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能和疾病模型的构建。
科学家可以利用CRISPR-Cas9 技术来人为地引发基因突变，以研究基因功能和疾病的发病机制。
此外，CRISPR-Cas9 技术还可以用于治疗基因相关疾病。
通过准确编辑患有遗传病的患者的基因组，科学家可以修复或纠正疾病相关基因的缺陷，以治疗或预防疾病的发生。
CRISPR-Cas9 技术还被用于生物学研究和农业领域。
从基因组编辑的角度看，这种技术可以用于培育产量更高、对病虫害抵抗力更强的农作物，以满足全球不断增长的粮食需求。
此外，CRISPR-Cas9 技术还可以用于改良微生物产生特定化合物，例如药物或化学制品。
总而言之，CRISPR-Cas9 是一种功能强大的基因编辑技术，它已经革新了生物学研究和医学领域。
它的应用不仅仅局限于基因功能研究，还包括基因治疗、农业改良等领域，为人类带来了希望和新的可能性。
crispr cas9工作原理
crispr cas9工作原理
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，其工作原理可以分为三个主要步骤：适应、切割和修复。
1. 适应：CRISPR-Cas系统最初通过识别和适应外源DNA的
序列来开始工作。
这一步骤发生在细菌或古细菌中，它们利用Cas蛋白和一段短的RNA序列来识别和保存外源DNA序列。
2. 切割：一旦适应完成，CRISPR-Cas系统可以进行基因编辑。
在这一步骤中，细菌通过产生一种叫做sgRNA (单导RNA)的RNA分子，该分子拥有与目标基因序列相匹配的部分。
sgRNA与Cas9蛋白结合形成复合物，这个复合物可以前往细
胞核。
sgRNA和Cas9复合物会识别和结合到目标基因的特定DNA
序列上。
一旦结合成功，Cas9蛋白便会发挥剪刀的作用，切
割目标DNA，并形成双链断裂。
3. 修复：当DNA双链断裂发生时，细胞会尝试修复这一伤口。
通常有两种修复机制：
- 非同源末端连接（NHEJ）：这是一种快速但不精确的DNA
修复机制。
在NHEJ中，细胞会直接连接断裂的DNA末端。
这种修复方式可能会导致插入缺失或碱基改变，从而导致基因功能的改变。
- 同源重组（HDR）：这是一种较慢但更精确的修复机制。
在
HDR中，细胞会利用一个同源的DNA模板来修复断裂的DNA。
这种修复方式可用于插入、删除或修改目标基因的具体部分。
通过CRISPR-Cas9技术，我们可以精确地切割和修改基因，进而研究和改变生物体的特性和功能。
这项技术在基因治疗、农业改良和生命科学研究等领域具有广泛的应用前景。
CRISPR-Cas9技术优化
▪ CRISPR-Cas9在农业领域的应用
1.CRISPR-Cas9技术可以用于改良农作物，提高作物的抗病性 、抗虫性和抗旱性。 2.通过CRISPR-Cas9技术，研究人员可以精确地编辑作物的基 因，以提高作物的营养价值或改善作物的品质。 3.目前，CRISPR-Cas9已经在一些农作物中展示出良好的改良 效果，如改良水稻、小麦等粮食作物。
CRISPR-Cas9技术的应用领域
▪ CRISPR-Cas9在生物研究中的应用
1.CRISPR-Cas9技术可以用于快速、高效地构建基因敲除或基 因过表达的细胞或动物模型。 2.通过CRISPR-Cas9技术，研究人员可以精确地编辑细胞或动 物的基因，以研究基因的功能和疾病机制。 3.目前，CRISPR-Cas9已经成为生物研究中最常用的基因编辑 工具之一。
CRISPR-Cas9技术简介
▪ CRISPR-Cas9技术的优势
1.CRISPR-Cas9技术具有操作简便、效率高、成本低等优点。 2.与传统的基因编辑技术相比，CRISPR-Cas9技术更加精准， 错误率更低。 3.CRISPR-Cas9技术可以广泛应用于生物学、医学、农业等领 域。
▪ CRISPR-Cas9技术的应用领域
CRISPR-Cas9技术优化
目录页
Contents Page
1. CRISPR-Cas9技术简介 2. CRISPR-Cas9的工作原理 3. CRISPR-Cas9技术的优势 4. CRISPR-Cas9技术的应用领域 5. CRISPR-Cas9技术存在的问题 6. 优化CRISPR-Cas9的策略和方法 7. 优化后的CRISPR-Cas9应用案例 8. CRISPR-Cas9技术的未来展望
CRISPR-Cas9的优化策略
crispr cas9技术
1.2 .CRISPR/Cas9作用机理
CRISPR-Cas系统的结构：CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由 不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列 S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。
CRISPR/cas9基因编辑技术及应 用
——— 一种来源于细菌获得 性免疫由RNA指导Cas蛋白对靶 向基因获得性修饰的技术
1. CRISPR-Cas系统简介
• 1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的 碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序 列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌 的基因组中，2002 年，正式将其命名为 成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)
在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与
野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使
用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可
以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行
操 Ca作s9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程（Cas9质粒建立 k1n、oc设k-计ou识t细别靶胞位系点）的一对DNA Oligos
CRISPR/技术的前景及优缺点
1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为 每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换 20个核苷酸就行。
基因组编辑技术CRISPRCas9原理及应用
基因组编辑技术CRISPRCas9原理及应用CRISPR-Cas9基因组编辑技术：原理、应用与前景引言：近年来，CRISPR-Cas9基因组编辑技术引起了广泛的关注，并被誉为“基因编辑的革命”。
由于其高效、精准、廉价、简便等特点，CRISPR-Cas9已被广泛应用于生命科学研究、疾病治疗、农业改良和生物制药等领域。
本文将首先介绍CRISPR-Cas9的原理，然后探讨其在不同领域的应用，并展望其未来发展前景。
一、CRISPR-Cas9基因组编辑技术的原理：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种常见于细菌和古菌的基因组中存在的一类短重复序列，它们的间隔区域（spacers）存在与外源侵略元素（例如噬菌体、质粒）的序列（protospacers）相对应的片段。
CRISPR系统通过将外源侵略元素的DNA序列整合到自身基因组中，形成新的spacer，从而构建了一种免疫记忆系统。
Cas9是一种细菌来源的蛋白质，具有剪切DNA双链的能力。
当发生外源侵袭时，CRISPR系统将受到侵略元素的DNA序列转录成非编码的crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA），以及一个编码Cas9的mRNA。
这些RNA分子最终会结合形成成熟的gRNA （guide RNA），并与Cas9蛋白质形成复合体。
gRNA通过与目标DNA序列的互补配对，引导Cas9蛋白质与目标DNA序列结合，并且Cas9蛋白质的核酸酶活性将目标DNA双链切割成两段。
二、CRISPR-Cas9技术在生命科学研究中的应用：1.基因功能研究：通过CRISPR-Cas9技术，可以有效地靶向特定基因的编码区域进行敲除、靶向特定位点进行基因突变，从而揭示基因在生物系统中的功能和调控机制。
这种基因编辑技术的高效性和精确性，使得科学家们能够更加准确地研究基因与表型之间的关联，有助于解析复杂疾病的发病机制。
crispr-cas9技术原理
crispr-cas9技术原理CRISPR-Cas9技术是一种基因编辑技术，可以精确地修改DNA序列。
该技术基于一种天然存在于细菌和古菌中的免疫系统，用于抵御病毒感染。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一类特殊的DNA序列，而Cas9（CRISPR-associated protein 9）则是一个酶，具有剪切DNA的能力。
CRISPR-Cas9技术的原理如下：首先，通过人工设计，引导RNA（gRNA）片段与Cas9蛋白结合，形成CRISPR-Cas9复合物。
这个gRNA片段的序列可以与目标DNA序列特异性配对，指导Cas9蛋白结合到目标DNA上。
一旦CRISPR-Cas9复合物与目标DNA配对成功，Cas9蛋白就会活化，剪切该DNA序列的两个链。
剪切产生的两端会形成间隔，是DNA修复机制介入的信号。
细胞为了修复这个断裂的DNA片段，会启动自身的修复机制。
修复DNA的过程有两个主要途径：第一个是非同源末端连接（NHEJ），这是一种错误拼接的修复机制，可能导致插入或缺失碱基。
第二个是同源重组（HR），利用一个与断裂区域同源的DNA模板修复损坏的DNA。
后一种修复方式可以用来插入特定的DNA序列，以实现基因编辑。
通过人工提供一个同源的DNA模板，可以将想要的DNA序列插入到目标基因中。
因此，CRISPR-Cas9技术可以实现非常准确的基因编辑和改变。
总的来说，CRISPR-Cas9技术通过引导RNA与Cas9蛋白结合，精确地识别和剪切目标DNA序列，进而触发细胞自身的修复机制，实现基因编辑。
这种技术改变了基因编辑的方式，使其更加高效和可行，因此被广泛应用于生物学研究和医学领域。
《crisprcas9技术》课件
CRISPR-Cas9的应用
基因组编辑及修补
CRISPR-Cas9技术可以精确的定位基因组中特定位点 进行编辑和修补，是医学、农业、工业等领域中重 要的基因体系。
基因靶向表达
利用CRISPR-Cas9技术的靶向控制基因表达可以实现 治疗疾病、生产有用生物制品等应用。
基因调控
CRISPR-Cas9技术可选择性、有 Nhomakorabea地进行基因调控，
应用前景
• CRISPR-Cas9技术未来将 广泛用于医疗、农业、 工业、环保等领域，成 为生物技术创新的重要
• 推基动于C力R。ISPR-Cas9技术的 新产品、新技术、新应 用也将成为未来投资的 热点领域。
2
编辑系统的工作原理
CRISPR-Cas9通过识别、结合、切割目标基因位点，进一步实现对基因组的编辑 和修补，使基因组发生特定改变，达到治疗或改良目的。
3
PAM序列的特点
PAM序列指的是Cas9靶序列的附近序列，是单导RNA结合Cas9蛋白并定位于靶点 上的关键信息之一，其特点包括长度和序列的多样性。
农业遗传改良
利用CRISPR-Cas9技术对商业作物进行精准改良是未
CRISPR-Cas9技术的局限和挑战
1 异源物质的干扰
2 细胞外的嵌合酶
CRISPR-Cas9技术会受到外部异源物质的干扰， 影响其在目标细胞内的有效性。
CRISPR-Cas9技术需要有效的嵌合酶才能达到 预期效果，因此嵌合酶的研究一直是制约该 技术发展的瓶颈之一。
应用领域
CRISPR-Cas9技术已广泛应用于基因组编辑、基因表达调控、疾病治疗和药物筛选等领域，且 应用前景广阔。
CRISPR-Cas9系统的构成和原理
crispercas9基因编辑原理
crispercas9基因编辑原理
CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种利用RNA-Cas9蛋白复合物进行特定基因的精确编辑的技术。
CRISPR-Cas9是一种轻松无痛的基因修饰技术。
它可以有效地定向编辑、插入或
删除特定基因，以修复基因突变以治疗多种遗传性疾病。
CRISPR-Cas9技术来源于天然防御机制，是由一种被称为CRISPR-Cas9的蛋白复合物
组成的，由一条RNA夹带着伴侣蛋白Cas9和一种叫做tracrRNA的RNA组成。
RNA是一种
单链核酸，Cas9是一种酶，能够在DNA双链中定位、切开并结合某些RNA片段。
CRISPR-Cas9蛋白复合物是一种复杂的分子结构，它具有定位、辨别及酶切的功能。
研究人员可以将CRISPR-Cas9的某些部分改造，以使其能识别目标基因，并将人工构建的DNA片段插入
目标位置以覆盖原始突变。
CRISPR-Cas9技术的运作原理很简单，通常情况下它以一种叫做“现场DNA剪切”的
方式运作。
首先，RNA复合物会识别特定基因的序列，然后Cas9蛋白切开 DNA双螺旋，
最后，人工构建的DNA片段插入目标位置，并将原始突变覆盖掉。
由于设计原理的简单性，CRISPR-Cas9技术的应用极为广泛，如人类基因编辑、植物基因编辑等等都可以使用它。
CRISPR-Cas9技术的优势在于可以快速有效地编辑基因，而且相较于传统基因编辑技
术而言，这种新型技术能够快速精准地编辑指定基因序列。
另外，这一技术也可更加节省
时间和资源，因此，CRISPR-Cas9的出现是一个突破，将加速基因工程及治疗遗传性疾病
的进程，改变着人类进化的历史。
基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法及注意事项
基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法及注意事项概述基因编辑技术是一种革命性的科学工具，可以精确修改细胞和生物体的基因组。
其中CRISPR-Cas9成为最受关注的基因编辑技术之一，因其简便、高效和准确性而备受赞誉。
本文将介绍CRISPR-Cas9的使用方法及注意事项。
一、CRISPR-Cas9的基本原理CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 的缩写，表示在易位区间（intergenic spacers）中间存在有一系列的短回文序列。
Cas9是一个典型的CRISPR相关蛋白，具有剪切双链DNA 的能力。
CRISPR-Cas9系统是通过引导RNA（sgRNA）与Cas9蛋白相结合，形成核酸酶复合物，使其能够精确地识别和通过碱基互补与目标基因的DNA序列结合并剪切。
二、CRISPR-Cas9的使用方法1．设计和合成引导RNA（sgRNA）sgRNA是CRISPR-Cas9系统中的关键部分，必须能够精确地与目标基因DNA序列配对。
在设计sgRNA时，需要注意以下几个方面：- sgRNA应该针对目标基因的特定区域，选择一个具有高度保守性的序列。
- 避免选择嵌合的互补序列，以免引起非特异性的DNA剪切。
- 确保sgRNA的序列无法与其他基因组中的DNA序列配对，以避免非特异性的DNA剪切。
2．合成Cas9蛋白Cas9蛋白可以由获得专利的CRISPR-Cas9公司购买，或者通过实验室内的表达系统获得。
合成或表达的Cas9蛋白可以通过亲和纯化方法来纯化。
3．转染CRISPR-Cas9系统将sgRNA和Cas9蛋白导入目标细胞的过程称为转染。
转染可以通过多种方法实现，包括化学物质转染、电穿孔转染、病毒载体转染等。
选择转染方法时，应根据特定的细胞类型和实验需求进行选择，并确保转染效率和毒性满足要求。
4．基因编辑的检测和分析在CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑后，需要对编辑结果进行检测和分析。
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种革命性的生物工程工具，它利用细菌体内天然存在的免疫系统来精确修改基因。
自从2012年首次引入以来，CRISPR-Cas9已经被广泛用于改变生物学研究和医学治疗的方式。
本文将介绍CRISPR-Cas9的原理、应用方法，并总结其在不同领域的应用。
### CRISPR-Cas9的原理CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古生菌基因组中的DNA序列，它记录了它们所受到的外来病毒基因组的片段。
Cas9是CRISPR系统中的一种蛋白质，具有剪切DNA 的能力。
利用这种系统，科学家们成功将CRISPR-Cas9技术应用于编辑生物体的基因。
CRISPR-Cas9系统的工作原理如下：1. 选择目标基因：确定需要编辑的特定基因序列，并设计与其互补的RNA引导分子（sgRNA）。
2. sgRNA的结合：通过合成互补基因组DNA片段成为单链RNA，与Cas9蛋白结合成一个复合物。
3. 定位到基因组：CRISPR-Cas9复合物进入靶细胞，通过与目标基因的序列互补对应，定位到特定的基因位点。
4. 剪切DNA：Cas9蛋白通过剪切DNA的方式精确修改目标基因，形成双链断裂。
5. 修复机制介入：细胞自身的DNA修复机制介入，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式修复双链断裂。
6. 基因修复：通过修复机制，引入目标基因的缺陷或修复，实现基因编辑。
### CRISPR-Cas9的应用方法CRISPR-Cas9技术的应用方法主要包括基因敲除、基因敲入和基因打靶等。
下面将详细介绍这些方法：#### 1. 基因敲除基因敲除是指通过CRISPR-Cas9技术使目标基因完全失活。
其步骤如下：- 设计sgRNA：选择目标基因的外显子序列，设计与之相互配对的sgRNA。
基因编辑——CRISPR-Cas9技术的革命性影响
基因编辑——CRISPR-Cas9技术的革命性影响一、CRISPRCas9技术概览CRISPRCas9，全称“成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR相关蛋白9”，是一项革命性的基因编辑技术，它使得科学家能够准确地定位并修改DNA序列，从而改写生物的遗传蓝图。
1.1 技术原理与根基CRISPRCas9系统起源于细菌和古菌的天然防御机制，它们用此来抵挡病毒侵袭。
系统的核心由CRISPR RNA（crRNA）和Cas9酶组成。
crRNA携带一段与目标DNA互补的序列，而Cas9酶则具备剪切DNA的能力。
一旦crRNA与目标DNA配对，Cas9酶会精准地切割DNA双链。
接着，细胞的自然修复过程可能导致突变，或者研究人员可以通过提供修复模板来引导特定的基因修改。
1.2 应用广度与影响力CRISPRCas9技术的诞生极大地推进了生命科学的研究进程，其应用无处不在：1.2.1 疾病研究与治疗CRISPR已应用于研究和治疗一系列遗传疾病，如囊性纤维化、镰状细胞病，甚至某些类型的癌症。
通过修复或关闭致病基因，科学家期待开辟新的治疗途径。
1.2.2 农业生物科技在农业领域，该技术被用来增强作物的抗虫、抗病和耐逆性，提升产量和营养价值。
1.2.3 生物工程与工业生产CRISPR也被用来改造微生物，以制造生物燃料、药品以及其他有价值的化学品。
1.2.4 基础科学研究在基础生物学研究中，CRISPRCas9是揭示基因功能、探索细胞调控机制和阐明疾病发病机制的不可或缺的工具。
然而，伴随着CRISPRCas9的巨大潜力，也引发了关于伦理和社会的深刻讨论，如基因编辑可能造成的不可逆影响以及公平性问题。
因此，全球科研社群正致力于构建相应的伦理准则和监管框架，以保障这项技术的安全和负责任使用。
二、医疗领域的应用科技进步在医疗领域中扮演着日益重要的角色，尤其是在遗传疾病治疗方面，科学家们正以前沿的技术和创新方法开辟新的治疗路径。
2.1 遗传疾病治疗的革新遗传疾病源于基因突变，它们可以由父母遗传，也可能在个体的生命过程中自发产生。
crispr-cas9技术
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引 导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
2021/6/7
2
CRISPR/cas9作用机理
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1.CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在 的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列 作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基 因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔 序列整合到两个重复序列之间
➢ 2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞
EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。
2021/6/7
1
1.2 .CRISPR/Cas9作用机理
CRISPR-Cas系统的结构：CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序 列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。
2.CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟
加工)
3.CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传
物质的干扰
2021/6/7
3
2.CRISPR/cas9技术的应用
CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术
CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。通过基因工程手段
2.CRISPR/Cas9技术的缺点 1.脱靶效应
2021/6/7
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CRISPRCas9技术介绍
CRISPR/Cas9技术介绍一、CRISPR/Cas9系统的构成CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。
在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。
Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。
Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。
通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。
因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。
这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。
NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。
crisper cas9技术简介
pAAV-miCMV-Cas9
6.2kb
pAAV-U6-gRNA-CMV-EGFP
编号 H422 H423
说明 腺相关病毒, Cas9 腺相关病毒,表达gRNA
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联系方式: 杨兴林, yxl@
Cas9位点查找
Cas9位点查找
选择最优的cas9靶点
Cas9载体构建
Cas9载体活性验证
Cel1实验原理示意图
Control
Cas9
PCR产物~500bp 预测切割产物~340bp
预测切割产物~160bp
Cas9质粒活性检测实例
和元公司CRISPR/Cas9系统介绍
和元Cas9载体系统
11.9kb pLenti-CMV-Puro-T2A-3Flag-Cas9n
7.9kb
pLenti-U6-gRNA-CMV-EGFP
编号 H136 H137 H140
说明 Puro抗性标记 Cas9n, Puro抗性标记 慢病毒, gRNA载体
基于腺相关病毒载体的Cas9系统
载体大小
载体全名
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基因组编辑技术 -CRISPR/Cas9
杨兴林 博士
主要内容
1. CRISPR/Cas9技术的基本原理 2. CRISPR/Cas9主Байду номын сангаас实验流程 3. 和元公司CRISPR/Cas9系统介绍
CRISPR/Cas9技术的基本原理
基因组编辑技术
一种利用同源重组 (Homologous Recombination,HR) 或者非同源末端连接(Non-homologous End Joining, NHEJ) 原理改变生物体内源基因 的遗传学技术。
基因编辑技术CRISPRCas9的操作步骤与技巧
基因编辑技术CRISPRCas9的操作步骤与技巧概述基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的基因工程方法，它使得科学家们能够准确、高效地修改生物体的基因组。
CRISPR-Cas9系统利用CRISPR序列指导Cas9酶进行DNA切割，并借助细胞自然的修复机制来实现精确的基因修饰。
本文将介绍CRISPR-Cas9技术的操作步骤，以及实验中需要注意的技巧和注意事项。
操作步骤：1. 设计合适的gRNA（引导RNA）序列：gRNA是用来指导Cas9酶精确切割特定DNA序列的RNA分子。
设计一个合适的gRNA序列是CRISPR-Cas9技术操作的第一步。
确保目标DNA序列位点的选择和gRNA序列的设计遵循一定的规则和原则，以提高操作的效率和准确性。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白：合成合适的gRNA是CRISPR-Cas9技术的关键。
根据设计的gRNA序列，合成相应的gRNA。
同时，合成Cas9蛋白或利用表达载体将Cas9蛋白表达进入细胞中。
3. 转染gRNA和Cas9蛋白：将合成的gRNA和Cas9蛋白转染到目标细胞中。
可以使用合适的转染试剂和方法，如化学转染、电转染或病毒转染等。
确保gRNA 和Cas9蛋白能够成功地进入细胞内。
4. DNA切割和修复：一旦Cas9与gRNA形成复合物进入细胞核，Cas9便能够准确地识别和切割目标DNA序列。
DNA的切割会引发细胞内自然的修复机制，可以选择使用非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）来修复切割的DNA。
NHEJ修复机制常常带来插入缺失或错配，而HDR可以实现特定的DNA改造。
5. 筛选和检测：在进行CRISPR-Cas9基因编辑后，需要对细胞或生物体进行筛选和检测，以鉴定编辑效果和确认目标基因的改变。
可以利用PCR、Westernblot、DNA测序等方法验证基因的编辑和修饰效果，并在细胞或生物体水平进行相关功能性分析。
技巧和注意事项：1. 合适的gRNA选择：选择合适的gRNA序列对于CRISPR-Cas9技术的成功应用至关重要。
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2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ ＤＮＡ配对 利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特 CRISPR－on系统。 真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子 ＶＰ16结合获得。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理
CRIPSR 基因座的表达 (包括转录和转录后的成熟 加工) 当该噬菌体再次入侵细 菌时，CRISPR 簇首先转录 为长的crRNA前体，然后逐 步被加工成小的成熟的 crRNA。 CRISPR/Cas 系统活性的 发挥或者是对外源遗传物 质的干扰 crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互 补配对精确地与目标DNA相 结合，随后Cas 蛋白对目 标DNA 进行断裂和降解。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理
2、CRISPR-Cas系统的应用
2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑 技术
基因组编辑技术是一种可以在基因组 水平上对DNA序列进行改造的遗传操 作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切 酶，在预定的基因组位置切断DNA， 切断的DNA在被细胞内的DNA修复 系统修复过程中会产生突变，从而达 到定点改造基因组的目的。 通过修复途径，基因组编辑技术可以 实现三种基因组改造，即基因敲除， 特异突变的引入和定点转基因 基因组编辑是研究基因功能的重要手 段之一，也可被用于人类遗传性疾病 的治疗，因此这类技术成为现代分子 生物学的研究热点
例子：基因敲除的实验过程
1、在把基因序列中寻 找NGG序列获得其附近 20多个碱基的序列， 与tracrRNA序列融合， 设计出sgRNA并合成该 序列。 2、将该序列以及cas9 基因连入如图所示载 体。 3、转化感受态，质粒 小提，测序验证。 4、细胞培养与细胞转 染 5、敲除效果检测。 6、建立稳定敲除的细 胞株
CRISPR/Cas9系统及 其应用
CRISPR-Cas系统简介
CRISPR-Cas系统的应用技术
CRISPR-Cas系统的应用前景
1. CRISPR-Cas系统简介
1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中， 2002 年， 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质 高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。
1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它 与folk酶功能类似，但是它并不需要形 成二聚体才能发挥作用。
2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入 侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转 移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞 EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同 年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成 双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定 点插入。
3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景
3.1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因
为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要 替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不
具特异性。 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单
方便。
较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来 的并发症。
3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景 目前应用CRISPR-Cas9系统的研究主要集中在基因编辑方 面。而Cas9真正的优势主要在于它具有能够将３种主要生 物聚合物（ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质）结合在一起的特殊 能力。 各种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用 gRNA的靶向作用结合到dsＤＮＡ的任意位点，发挥人们预 期的功能。 例如：Cas9如果与甲基化酶或去甲基化酶、乙酰化酶或去 乙酰化酶、激酶、磷酸化酶等促进染色质结构变异的蛋白 成功融合还将有助于表观遗传学的研究，并能够持久改变 基因的表达状态。如果几个作用于基因组不同位点Cas9复 合物的协同作用，还可通过改变基因组的结构实现基因调 控的目的。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理 CRISPR 的高度可变的间隔区的获得
首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG序列），将临 近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5'端 合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间
2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白 失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ 结合的能力。这种失 去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名为Dead Ｃas9。将ｄCas9与 gRNA在细胞中共表达，则gRNA可以介导ｄCas9蛋白与ＤＮＡ 结合。 如果ｄCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用； 如果ｄCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始
2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术
CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 Mali 等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR 相关蛋白 Cas9，在一段人为重组的sgRNA( small-guide RNA) 的引导下，针对 小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编 程RNA 进行DNA 改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。