免疫血清制备
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免疫血清制备
目的要求
通过免疫动物制备抗血清，掌握可溶性抗 原制备抗血清的原理、实验步骤及影响因 素。
Fra Baidu bibliotek
鉴定抗血清的特异性及工作浓度（效价）。
实验原理
具有免疫原性的物质，经注射途径进入机体， 可刺激机体产生相应抗体。根据抗原免疫原 性的强弱及机体反应性的差异，则产生抗体 的效价有所高低。 制备免疫血清一般需多次注射。可溶性抗原 免疫时应加佐剂，以增强机体对抗原的免疫 应答，提高抗血清的效价。
将抗血清（Ab）分别用NS作1:2、1：4、1：8 及1：16
不同稀释度稀释；
以1：30稀释血清作为Ag，进行双扩或对流免疫电泳 若Ag、Ab二者交界处出现沉淀线，说明有特异性 以出现沉淀线的Ab最高稀释度作为该Ab的工作效价
免疫过程
4.保存： 将工作浓度达到1:16的抗血清分成小包装（放入EP管内）， 贴上标签，注明血清名称、效价，制备日期，置-20º C冰箱 中冻存，备用。
免疫过程
3.放血并鉴定（第21天）： A.放血：心脏穿刺抽血 将家兔仰卧固定，用食指触摸其胸壁，探明心脏搏动最明 显处，用大号无菌空针在预定部位与胸壁呈45º 角刺入，针 头刺中心脏时有明显搏动感。待见血液进入针头后，固定 注射器位置取血。 注意抓紧动物，避免挣扎，改变体位。 B.分离血清： 将抽取的家兔血（约50-70ml)放室温自然凝固，使血块收 缩或2000rpm/min离心，分离出血清。 C.鉴定： 采用双扩法（梅花孔型）鉴定抗血清的特异性及工作效价
实验安排
1. 动物选择
选取2.5-3公斤左右、健康、无感染的雄性家兔8只
2.实验分组
全班分成4个小组，每组2只兔子 ： 其中两组免疫人血清白蛋白,制备抗人白蛋白； 另两组免疫人全血清，制备抗人全血清
3. 免疫前动物分组，并各自做好标记
挑选动物，采取涂色、剪毛等方式标记各自动物，避免相 互混淆。
免疫过程（以每组2只兔子为计算单位）：
1.第一次（第1天）： 称取人血清白蛋白(HSA)干粉30mg + NS 1.5ml→溶解后将 该Ag溶液逐滴滴入已事先搅拌的1.0ml福氏完全佐剂(CFA） 中，不断研磨→ 使Ag溶液均匀混于佐剂中，形成“油包水” 乳剂→每只兔子取0.8ml进行背部皮内多点注射。 “油包水”乳剂的验证：取1滴乳剂滴入水中，如立即散开， 说明未乳化好；如果不散开，飘在水面，则乳化完全。 2.第二次（第14天）： 称取HSA干粉50mg + NS 5ml →溶解后将该Ag溶液逐滴滴入 3mlCFA中→研磨为乳化物→每只兔子取3ml注射于腘窝淋巴 结及大腿肌肉，每侧1.5ml。
免疫过程
4.保存： 将工作浓度达到1:16的抗血清分成小包装（放入EP管内）， 贴上标签，注明血清名称、效价，制备日期，置-20º C冰箱 中冻存，有效期可达3－5年。
兔抗人全血清制备
免疫过程（以每组2只兔子为计算单位）：
1.第一次（第1天）： 将人血清作1：30稀释，取1：30稀释血清1.5ml逐滴滴入 已事先搅拌的1.5mlCFA 中，不断研磨→ 使Ag溶液均匀混 于佐剂，形成“油包水”乳剂→每只家兔吸取0.8ml于双 后足掌注射，每侧0.4ml。 2.第二次（第14天）： 取1：30稀释血清1.5ml，逐滴滴入已搅拌的1.5mlCFA中， 研磨→ 形成“油包水”乳剂→每只家兔吸取0.8ml于双后 腿腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结处进行注射，每侧0.4ml。
注意事项
1. 免疫血清制备是一项常用的免疫学实验技术，而制备效价 高、特异性强的抗血清必须具备理想的免疫原、选择适宜 的动物、制定可行的免疫方案（如Ag剂量、剂型、注射 途径、注射次数、间隔时间等），才能达到预期目的。 2. 福氏完全佐剂在注射后易造成局部持久溃疡及形成肉芽肿， 但对抗体生成无影响。 3. 免疫剂量不宜过大，剂量过大时易形成免疫耐受；若抗原 宝贵可采取淋巴结直接注射。 4. 抗体鉴定除特异性、效价鉴定外，还需进行纯度检测： 采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，若出现多条电泳带， 提示抗血清中杂蛋白较多，需进一步分离提纯。
⒋实验流程：
免疫：两种Ag均为可溶性Ag, 需加入佐剂制成“油包水” 乳剂，免疫家兔2次； 放血：采取心脏穿刺抽血法进行放血； 鉴定：沉淀反应（双扩）测定抗血清特异性、效价并保存。
免疫方案
兔抗人白蛋白(human seruma albumin,HSA) 血 清制备 兔抗人全血清制备
兔抗人白蛋白血清制备
免疫过程
3.放血并鉴定（第21天）： A.放血：心脏穿刺抽血 将家兔仰卧固定，用食指触摸其胸壁，探明心脏搏动最明 显处，用大号无菌空针在预定部位与胸壁呈45º 角刺入，针 头刺中心脏时有明显搏动感。待见血液进入针头后，固定 注射器位置取血。 注意抓紧动物，避免挣扎，改变体位。 B.分离血清： 将抽取的家兔血（约50-70ml)室温自然沉降或2000rpm/min 离心，分离出血清。 C.鉴定： 采用双扩或对流免疫电泳鉴定抗血清特异性及工作效价
称取HSA20mg+NS 2ml →10mg/ml 取0.2ml(10mg/ml)+ NS1.8ml →1mg/ml 取0.2ml(1mg/ml)+ NS1.8ml →100ug/ml 将抗血清（Ab）分别用NS作1:2、1：4、 1：8 及1：16不同稀释度稀释； 以 10mg/ml、 1mg/ml、 100ug/ml的HSA分 别作为Ag，进行3组双扩 若Ag、Ab二者交界处出现沉淀线，说明 有特异性 以出现沉淀线的Ab最高 稀释度作为该Ab 的工作效价
目的要求
通过免疫动物制备抗血清，掌握可溶性抗 原制备抗血清的原理、实验步骤及影响因 素。
Fra Baidu bibliotek
鉴定抗血清的特异性及工作浓度（效价）。
实验原理
具有免疫原性的物质，经注射途径进入机体， 可刺激机体产生相应抗体。根据抗原免疫原 性的强弱及机体反应性的差异，则产生抗体 的效价有所高低。 制备免疫血清一般需多次注射。可溶性抗原 免疫时应加佐剂，以增强机体对抗原的免疫 应答，提高抗血清的效价。
将抗血清（Ab）分别用NS作1:2、1：4、1：8 及1：16
不同稀释度稀释；
以1：30稀释血清作为Ag，进行双扩或对流免疫电泳 若Ag、Ab二者交界处出现沉淀线，说明有特异性 以出现沉淀线的Ab最高稀释度作为该Ab的工作效价
免疫过程
4.保存： 将工作浓度达到1:16的抗血清分成小包装（放入EP管内）， 贴上标签，注明血清名称、效价，制备日期，置-20º C冰箱 中冻存，备用。
免疫过程
3.放血并鉴定（第21天）： A.放血：心脏穿刺抽血 将家兔仰卧固定，用食指触摸其胸壁，探明心脏搏动最明 显处，用大号无菌空针在预定部位与胸壁呈45º 角刺入，针 头刺中心脏时有明显搏动感。待见血液进入针头后，固定 注射器位置取血。 注意抓紧动物，避免挣扎，改变体位。 B.分离血清： 将抽取的家兔血（约50-70ml)放室温自然凝固，使血块收 缩或2000rpm/min离心，分离出血清。 C.鉴定： 采用双扩法（梅花孔型）鉴定抗血清的特异性及工作效价
实验安排
1. 动物选择
选取2.5-3公斤左右、健康、无感染的雄性家兔8只
2.实验分组
全班分成4个小组，每组2只兔子 ： 其中两组免疫人血清白蛋白,制备抗人白蛋白； 另两组免疫人全血清，制备抗人全血清
3. 免疫前动物分组，并各自做好标记
挑选动物，采取涂色、剪毛等方式标记各自动物，避免相 互混淆。
免疫过程（以每组2只兔子为计算单位）：
1.第一次（第1天）： 称取人血清白蛋白(HSA)干粉30mg + NS 1.5ml→溶解后将 该Ag溶液逐滴滴入已事先搅拌的1.0ml福氏完全佐剂(CFA） 中，不断研磨→ 使Ag溶液均匀混于佐剂中，形成“油包水” 乳剂→每只兔子取0.8ml进行背部皮内多点注射。 “油包水”乳剂的验证：取1滴乳剂滴入水中，如立即散开， 说明未乳化好；如果不散开，飘在水面，则乳化完全。 2.第二次（第14天）： 称取HSA干粉50mg + NS 5ml →溶解后将该Ag溶液逐滴滴入 3mlCFA中→研磨为乳化物→每只兔子取3ml注射于腘窝淋巴 结及大腿肌肉，每侧1.5ml。
免疫过程
4.保存： 将工作浓度达到1:16的抗血清分成小包装（放入EP管内）， 贴上标签，注明血清名称、效价，制备日期，置-20º C冰箱 中冻存，有效期可达3－5年。
兔抗人全血清制备
免疫过程（以每组2只兔子为计算单位）：
1.第一次（第1天）： 将人血清作1：30稀释，取1：30稀释血清1.5ml逐滴滴入 已事先搅拌的1.5mlCFA 中，不断研磨→ 使Ag溶液均匀混 于佐剂，形成“油包水”乳剂→每只家兔吸取0.8ml于双 后足掌注射，每侧0.4ml。 2.第二次（第14天）： 取1：30稀释血清1.5ml，逐滴滴入已搅拌的1.5mlCFA中， 研磨→ 形成“油包水”乳剂→每只家兔吸取0.8ml于双后 腿腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结处进行注射，每侧0.4ml。
注意事项
1. 免疫血清制备是一项常用的免疫学实验技术，而制备效价 高、特异性强的抗血清必须具备理想的免疫原、选择适宜 的动物、制定可行的免疫方案（如Ag剂量、剂型、注射 途径、注射次数、间隔时间等），才能达到预期目的。 2. 福氏完全佐剂在注射后易造成局部持久溃疡及形成肉芽肿， 但对抗体生成无影响。 3. 免疫剂量不宜过大，剂量过大时易形成免疫耐受；若抗原 宝贵可采取淋巴结直接注射。 4. 抗体鉴定除特异性、效价鉴定外，还需进行纯度检测： 采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，若出现多条电泳带， 提示抗血清中杂蛋白较多，需进一步分离提纯。
⒋实验流程：
免疫：两种Ag均为可溶性Ag, 需加入佐剂制成“油包水” 乳剂，免疫家兔2次； 放血：采取心脏穿刺抽血法进行放血； 鉴定：沉淀反应（双扩）测定抗血清特异性、效价并保存。
免疫方案
兔抗人白蛋白(human seruma albumin,HSA) 血 清制备 兔抗人全血清制备
兔抗人白蛋白血清制备
免疫过程
3.放血并鉴定（第21天）： A.放血：心脏穿刺抽血 将家兔仰卧固定，用食指触摸其胸壁，探明心脏搏动最明 显处，用大号无菌空针在预定部位与胸壁呈45º 角刺入，针 头刺中心脏时有明显搏动感。待见血液进入针头后，固定 注射器位置取血。 注意抓紧动物，避免挣扎，改变体位。 B.分离血清： 将抽取的家兔血（约50-70ml)室温自然沉降或2000rpm/min 离心，分离出血清。 C.鉴定： 采用双扩或对流免疫电泳鉴定抗血清特异性及工作效价
称取HSA20mg+NS 2ml →10mg/ml 取0.2ml(10mg/ml)+ NS1.8ml →1mg/ml 取0.2ml(1mg/ml)+ NS1.8ml →100ug/ml 将抗血清（Ab）分别用NS作1:2、1：4、 1：8 及1：16不同稀释度稀释； 以 10mg/ml、 1mg/ml、 100ug/ml的HSA分 别作为Ag，进行3组双扩 若Ag、Ab二者交界处出现沉淀线，说明 有特异性 以出现沉淀线的Ab最高 稀释度作为该Ab 的工作效价