实验八 亲和层析分离纯化蛋白质()
(完整版)蛋白质分离纯化的一般程序解析
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法蛋白质是细胞中的重要生物大分子，具有多样的结构和功能。
为了研究蛋白质的性质和功能，需要将蛋白质从混合样品中分离纯化出来。
蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括离心法、电泳法、层析法和亲和纯化法等。
下面将逐一介绍这些方法及其原理。
1. 离心法离心法是利用离心机将混合物中的蛋白质分离出来。
首先将细胞裂解，得到细胞裂解液，然后进行离心，以将细胞器、胞外物质和亲粒子（如蛋白质颗粒）分离。
离心可以根据不同物质的相对密度和大小进行分层分离，快速旋转离心机可以很好地分离出不同密度的颗粒。
2. 电泳法电泳法是将带电的蛋白质沿着电场移动，根据蛋白质的带电性质和大小分离的方法。
蛋白质可以根据电荷性质分为阴离子蛋白和阳离子蛋白，也可以根据亲水性质分为亲水性蛋白和疏水性蛋白。
电泳法常用的有SDS-PAGE、等电聚焦电泳等。
其中，SDS-PAGE可以根据蛋白质的分子量进行分离。
3. 层析法层析法是通过蛋白质与载体之间的亲和性或者分离介质之间的亲和性进行分离的方法。
层析法主要分为凝胶层析、离子交换层析、亲合层析和大小排阻层析等。
凝胶层析法是利用凝胶的网格结构来分离蛋白质，如凝胶过滤层析、凝胶过渡层析等。
离子交换层析法是利用蛋白质对离子交换树脂的吸附性质进行分离。
亲合层析法是通过亲和柱中的配体与蛋白质的亲和作用进行分离。
大小排阻层析法是根据蛋白质的分子量和形状进行分离。
4. 亲和纯化法亲和纯化法是利用特定的亲合剂与目标蛋白质之间的特异性亲和性进行分离纯化的方法。
亲和纯化主要包括亲和柱层析法、浸没纯化法、亲和剂电泳法等。
亲和柱层析法是将具有亲和填料的柱子与样品接触，通过洗脱再生的操作，将目标蛋白质从其他组分中分离纯化出来。
浸没纯化法是将特定亲合剂浸泡在蛋白质混合物中，使其与目标蛋白质发生亲和结合，然后以特定条件洗脱目标蛋白质。
亲和剂电泳法是负载亲和剂的凝胶片上进行电泳，使蛋白质与亲和剂结合，再通过电泳将其分离纯化出来。
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
实验八凝胶过滤法分离蛋白质
实验操作
3、加样：
取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞 色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混 合，即为上柱样品。 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰 好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出 口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面。 打开出口，让样品进入床内，直至样品全部 进Sephadex凝胶柱，关紧出口。 滴加蒸馏水使之成2cm水柱 。
在装柱过程中凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱装柱结束后其凝胶表面应平整2021610取4mgml蓝色葡聚糖溶液6mgml细胞色素c溶液2mgml重铬酸钾溶液各6滴混合即为上柱样品
实验八 凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤即凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 分子排阻层析(molecular exclusion chromatography) 分子筛层析(molecular sieve chromatography) 凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)
不要使平 整的床表 面搅动
实验操作
4、洗脱和收集
调节蠕动泵流速，使得进水速度 0.3ml/min。 打开出口，让柱内液体缓慢流出,流 速0.3ml/min， 取小试管20支，每管 收集1ml，观察两种颜色出现的管号。
不能 让凝 胶表 面露 出水 面
实验操作
5、绘制洗脱曲线。
五、注意事项
根据实验中遇到的各种问题，总结做好 本实验的经验与教训，完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点
附录：HPLC高压液相色谱
附录：凝胶过滤常用填料
亲和层析法 ph
亲和层析法 ph
亲和层析法（Phaffinity Chromatography）是一种分离和纯化蛋白质的方法，利用特定配体与目标蛋白之间的亲和性进行选择性吸附和洗脱。
在亲和层析法中，一种特定的配体或亲和剂（affinity ligand）被固定在亲和树脂上，例如蛋白A、蛋白G或金属离子等。
这些配体具有与目标蛋白质特异性结合的能力。
亲和层析法的操作步骤如下：
1.样品加载：将含有目标蛋白的混合物（样品）加载到装有
亲和树脂的柱上。
2.亲和吸附：目标蛋白与固定在亲和树脂上的配体发生特异
性结合，其他非目标蛋白被洗脱。
3.洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH、离子浓度、
温度等，使目标蛋白与亲和树脂上的配体解离，从而将目
标蛋白洗脱。
4.纯化和收集：收集洗脱液中的目标蛋白，经过后续处理获
得纯化的蛋白质。
亲和层析法能够高效、选择性地富集目标蛋白质，并且可以在非变性条件下进行操作，从而保持蛋白的活性和折叠状态。
这使得亲和层析法在生物医药研究和生产中得到广泛应用，如蛋白质纯化、抗体制备、酶分析等。
分离纯化蛋白质的方法
分离纯化蛋白质的方法
分离纯化蛋白质的方法有多种，常用的方法包括：亲和层析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、逆流层析、尺寸排除层析、亲和吸附等。
1. 亲和层析：利用目标蛋白与某种特定配体的特异性结合，将目标蛋白与其他非特异结合的蛋白质分离开。
2. 凝胶过滤色谱：通过选择性大小排除来分离蛋白质。
较大的蛋白质无法进入凝胶孔道，较小的蛋白质可以顺利通过凝胶，实现分离纯化。
3. 离子交换色谱：通过蛋白质与离子交换基质之间的电荷作用进行分离。
离子与蛋白质的电荷性质决定了它们在离子交换基质上的吸附和洗脱特性。
4. 逆流层析：利用生物化学吸附系数的差异分离纯化蛋白质，结合了某种特定的结合物质与逆流洗脱的过程。
5. 尺寸排除层析：根据蛋白质的大小或分子量差异进行分离纯化，较大的蛋白质会直接通过层析柱，较小的蛋白质则会在柱中留下并延时流出。
6. 亲和吸附：利用蛋白质与特定亲和配体之间的特异性结合进行分离纯化。
这种方法具有高选择性和高效率。
这些方法可以单独使用，也可以联合使用，根据目标蛋白质的特性和需求来选择合适的分离纯化方法。
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
列举5种分离纯化蛋白质的方法。
列举5种分离纯化蛋白质的方法。
一、凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离纯化方法。
它利用蛋白质的电荷和大小差异，在电场作用下，将蛋白质分离成不同迁移速度的带状物。
常见的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺糖凝胶电泳（PAGE）等。
凝胶电泳具有分离速度快、样品适用范围广、易于操作等特点。
二、离子交换层析法（Ion Exchange Chromatography）：离子交换层析是根据蛋白质表面带电性的差异来分离纯化蛋白质的方法。
通过将样品加入装有离子交换树脂的层析柱中，通过控制洗脱缓冲液的离子浓度和pH，实现带正电荷或负电荷的蛋白质与树脂之间的相互作用，从而实现分离纯化。
三、亲和层析法（Affinity Chromatography）：亲和层析是利用蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来分离纯化蛋白质的方法。
常见的亲和层析方法包括亲和纸层析、亲和树脂层析等。
该方法具有选择性强、纯化效果好的优点，广泛应用于蛋白质纯化领域。
四、凝胶渗透层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶渗透层析也被称为分子筛层析，是一种以分子大小差异作为分离依据的方法。
通过在层析柱中加入一种孔隙较小的凝胶，利用蛋白质分子大小的差异，在经过柱体后，较小的蛋白质分子进入凝胶孔隙中，分离出来，而较大的蛋白质则能够直接流出。
五、逆流层析法（Reverse Phase Chromatography）：逆流层析是基于蛋白质与固定相之间的亲疏水性相互作用进行纯化的方法。
固定相常为亲疏水性的碳链，样品在不同的流动相条件下，通过调节流动相的成分和性质，来实现对蛋白质的分离纯化。
此外，还有疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography）、互补杂交法（Complementary Hybridization）等方法。
蛋白质的表达纯化
400ul
750ul
1800ul
50ul
10ul
灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。
01
加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。
1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。 灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）
5ml
3ml
4ml
120ul
20ul
30%Arc-Bis
Tris-HCl pH 6.7
H2O
10%AP
6
稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽，需800毫升。
7
注意事项
将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。 在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。
氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化
重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB, 用吸管抽吸重悬, 4 ℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。
NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟 ) 。
氨苄青霉素：100mg/mL
Washing Buffer（UWB）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3
蛋白质纯化实验步骤
蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。
下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。
一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。
样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。
二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。
离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。
三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。
可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。
这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。
四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。
五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。
凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。
六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。
柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。
七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。
透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。
八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。
常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。
九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白是一种常用的蛋白质纯化方法，它利用蛋白质与特定配体之间的亲和力进行分离纯化。
这种方法具有选择性强、操作简便、纯化效果好等优点，因此在生物化学、分子生物学等领域得到了广泛应用。
亲和层析纯化蛋白的基本原理是利用蛋白质与特定配体之间的亲和力进行分离纯化。
配体可以是化学物质、抗体、酶等，而蛋白质则是与配体具有特异性结合的分子。
在亲和层析纯化蛋白的过程中，首先将配体固定在某种固相材料上，例如琼脂糖、硅胶、磁珠等，然后将混合物（包含目标蛋白质和其他蛋白质）加入到固相材料中，目标蛋白质与配体结合，而其他蛋白质则不结合。
最后，通过洗脱等步骤，将目标蛋白质从固相材料中洗脱出来，从而实现纯化。
亲和层析纯化蛋白的优点在于选择性强。
由于配体与蛋白质之间的结合是特异性的，因此可以选择性地纯化目标蛋白质，而不影响其他蛋白质的存在。
此外，亲和层析纯化蛋白的操作简便，不需要复杂的设备和技术，因此适用于大规模生产和实验室规模的纯化。
最重要的是，亲和层析纯化蛋白的纯化效果好，可以得到高纯度的目标蛋白质。
亲和层析纯化蛋白的应用非常广泛。
在生物化学和分子生物学领域，亲和层析纯化蛋白被广泛应用于分离纯化重要的蛋白质，例如酶、激素、抗体等。
此外，亲和层析纯化蛋白还可以用于药物研发、生
物制药等领域，例如纯化重组蛋白、抗体等。
总之，亲和层析纯化蛋白是一种非常重要的蛋白质纯化方法，具有广泛的应用前景。
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白是一种广泛被应用于蛋白纯化的技术，在这种技术中，通过利用靶蛋白与某一亲和剂相互结合的特异性，达到将蛋白从混合
物中分离出来的目的。
具体流程如下：
1.选择适当的亲和剂：根据目标蛋白表面的属性，选择合适的亲和剂，例如特定抗体、金属离子（例如Ni2+）、亲和配体等。
2.制备亲和树脂：将亲和剂固定在树脂上，以制备亲和树脂。
3.样品制备：将含有目标蛋白的混合物制备好，例如细胞裂解物、过
滤液等。
4.样品沉积：将样品与亲和树脂混合，使亲和树脂中的亲和剂与目标
蛋白结合。
5.洗脱：将非特异性结合物和杂质用缓冲液进行洗脱。
6.蛋白洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH、离子浓度等，使
目标蛋白与亲和剂解离。
7.蛋白纯化：收集目标蛋白溶液，以得到纯化的蛋白。
需要注意的是，在亲和层析过程中，亲和剂选择、树脂选择以及缓冲
液的配比等，均会对纯化效果产生影响。
因此，需要根据各种参数进行优化，以得到更好的纯化效果。
chapter8亲和层析精品文档
Often need spacer arm
but watch out for adsorption to the spacer!
8.2 亲和色谱原理
8.1 生物亲和作用
8.1.1 亲和作用的本质：钥匙和锁孔的关系
相互作用
静电作用
氢键
疏水性相互作用 配位键
弱共价键
8.1 生物亲和作用
8.1 生物亲和作用
• 生物体内相互作用的分子对： • (1) 酶—底物或抑制剂或辅酶 • (2) 抗原—抗体。 • (3) 激素—受体。 • (4) 糖蛋白与凝集素, • (5) 生物素—生物素结合蛋白等
8.1 生物亲和作用
8.1.2 影响亲和作用的因素 详见p314
离子强度
pH值
抑制氢键形成的物质 温度
离液离子
螯合剂
8.1 生物亲和作用
8.1.3 亲和作用体系 p316
8.2 亲和色谱原理
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的 专一分子可逆结合的特性。
如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核 糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系， 都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力 称为亲和力。
• 凝集素（Lectin）是指一种从各种植 物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖 蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血 球（含血型物质），故名凝集素。
• 常用的为植物凝集素 （Phytoagglutin，PNA），通常以其 被提取的植物命名，如刀豆素A （Conconvalina，ConA）、麦胚素 （Wheat germ agglutinin，WGA）、 花生凝集素（Peanut agglutinin， PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它们 的总称。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理分离纯化蛋白质是生物化学和分子生物学研究中的重要步骤。
蛋白质的分离与纯化可以使我们更好地理解蛋白质的结构和功能，并为进一步的研究提供可靠的蛋白质样本。
下面将介绍一些常见的蛋白质分离和纯化方法及其原理。
1.存活细胞提取法：这种方法是从细胞中提取蛋白质。
先将细胞破碎，然后通过离心等手段去除细胞碎片和细胞器，留下蛋白质溶液。
使用该方法分离的蛋白质包括细胞质蛋白、细胞膜蛋白等。
2.柱层析法：柱层析法是一种广泛应用的蛋白质分离方法。
它主要依据蛋白质的性质（如分子质量、电荷、亲水性等）在各种填料（如离子交换、凝胶透析、亲和层析等）上的差异进行选择性分离。
原理是根据蛋白质与填料之间的相互作用，通过溶液通过填料层析柱时，不同蛋白质以不同速率在填料间扩散，并在填料内发生各种相互作用，从而实现蛋白质的分离。
该方法可同时分离多个蛋白质，并制备高纯度的蛋白质。
3.电泳法：电泳法是根据蛋白质在电场中的迁移速率、电荷性质和分子大小等特征进行分离的方法。
常见的电泳方法包括SDS-、等电聚焦电泳、二维电泳等。
其中，SDS-是最常用的蛋白质分离方法之一，它通过SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变成带负电荷的复合物，继而在电场作用下，按照蛋白质的分子质量大小进行分离。
4.超滤法：超滤法是根据不同分子量的蛋白质在超滤膜上的渗透性差异进行分离。
超滤分离可以根据孔隙的大小将不同分子量的蛋白质阻滞，有效地去除较小分子量的杂质，得到目标蛋白质的高纯度。
5.亲和层析法：亲和层析法是通过目标蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离的方法。
配体可以是特定的抗体、金属离子、凝胶颗粒等。
原理是通过将配体共价结合到固定相上，然后将蛋白质样品溶液通过，使目标蛋白质与配体发生特异性结合，其他非特异性结合的蛋白质被洗脱，最后目标蛋白质被洗出。
6.上下层析法：上下层析法是一种根据沉降速度差异进行分离的方法。
利用离心过程中不同蛋白质溶液中蛋白质的不同沉降速度将蛋白质分离。
实验八亲和层析分离纯化蛋白质
实验步骤
6、将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子， 液面应该完全没过电极。
7、点样（Marker和待测蛋白样，加入样品缓冲液）每个点样孔点 30ul样品，每板胶点5ul Marker。
加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合 8、80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V； 9、溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束 10、撬开玻璃板，将凝胶做好标记， 放在塑料盒内，加入染色液， 染色30min左右。 11、染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色。
洗脱的蛋白溶液（3号管）25uL， 加5uL 5X上样缓冲液。
点样前沸水中加热3-5min。
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
实验目的
掌握SDS-PAGE检测蛋白分子量原理 和方法
掌握垂直板电泳的操作方法
实验原理
蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了 各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
1、用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。 2、将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3、用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4、加入1ml 洗脱液。 5、用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集
0.2ml（约4滴）。 6、PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7、将第2管和第3管用于目的蛋白的检测。
※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 ※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。
12%分离胶
试剂名称
ddH2O 30% Acr-Bis (29:1) 1.5M Tris-HCl（pH8.8）
10% SDS TEMED（加速剂） 10% APS（催化剂，最后加）
亲和层析在蛋白质纯化中的应用.docx
亲和层析在蛋白质纯化中的应用.docx亲和层析在蛋白质纯化中的应用亲和层析(affinity chromatography, AC) 是一种简单易操作的生物大分子分离纯化的重要方法之一，它的基本原理是将与待分离纯化的目标产物具有亲和力的亲和配体固定在载体上(比如说，常用载体有琼脂糖、壳聚糖、纤维素、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃等)，利用目标产物与亲和配体之间的特异性亲和力，使得亲和配体选择性地结合目标产物，从而达到分离纯化的目的。
亲和层析主要包括四个步骤：(1)制备亲和层析柱;(2)样品裂解液与亲和层析柱结合;(3)将杂质洗出;(4)洗脱目标产物。
亲和层析因具有简单易操作、选择性高、载量大以及分离纯化的蛋白纯度较高等优点，因而被广泛应用于在生物大分子的纯化，如结合蛋白、酶、抗体、抗原、DNA、RNA、病毒、细胞等生物大分子的纯化。
本文就亲和层析在近几年蛋白质纯化中的应用作一介绍。
1 亲和层析的类型亲和层析的类型主要有：生物亲和层析(BAFC)、免疫亲和层析(IAFC)、固定化金属离子亲和层析(IMAC)、拟生物亲和层析(BMAFC)以及特殊基团亲和层析等。
科研人员可以根据自己实验的实际需要选择相应的亲和层析方法来达到实验目的。
2 亲和层析在蛋白纯化中的应用蛋白的分离纯化是蛋白组学研究中一个非常重要的环节，蛋白质能否有效的分离纯化关系到整个实验的成败。
2011年Arnold等用有机小分子1A4，2A8，2A9以及2A10作为亲和配体，与N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B)共价结合制备成亲和层析柱，纯化了不同的抗体，其中以2A10作为亲和配体所制得的亲和层析柱纯化得到的抗体产率大于90%，纯度大于80%，这与以蛋白A为配体亲和纯化的抗体的产率和纯度相当，然而小分子为配体的亲和层析柱却解决了以蛋白A为配体易污染、不稳定的难题。
乙酰胆碱酯酶维持乙酰胆碱在动物体内平衡起着非常重要的功能作用，对乙酰胆碱酯酶的研究有着极其深远的意义。
实验八 亲和层析分离纯化蛋白质(14)
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
实验目的
掌握SDS-PAGE检测蛋白分子量原理
和方法
掌握垂直板电泳的操作方法
实验原理
蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了 各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对 数呈线性关系：
实验试剂
低分子量标准蛋白（Mark） 兔磷酸化酶B MW=97400 牛血清白蛋白 MW=66200 兔肌动蛋白 MW=43000 牛碳酸酐酶 MW=31000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14400
30%丙烯酰胺（Acr） 10%SDS 1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 10%过硫酸铵(AP)（现配现用） TEMED（四甲基乙二胺） 2样品缓冲液 10电极缓冲液母液（pH8.3） 染色液
GSH- Sepharose 4B
GSH- Sepharose 4B
实验步骤
一、装GST柱
1、清洗和装好层析柱，封闭出口。 2、加入2 mL PBS。 3、取1 ml GSH- Sepharose 4B填料，加入 柱子中。 4、打开柱子出口，使PBS缓慢流出。
注意：始终保持柱内的液面高于填料
亲和层析 分离纯化目标蛋白
实验目的
掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原 理和实验方法（第一部分） 掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理和方法 （第二部分）
第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白
亲和层析原理
生物大分子与配体特异非共价可逆结合
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3．制作5.0%浓缩胶
按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶 2ml，插入梳子，聚合15 min。
试剂名称 蒸馏水 30%丙烯酰胺（29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8） 10%SDS 四甲基乙二铵（TEMED） 10%过硫酸铵（AP） 总体积 5.0% 1.7 ml 430 ul 310 ul 25 ul 10 ul 25 ul 2.5 ml
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析 • 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合） • GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B） • GST融合目标蛋白 • 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 • 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白
GSH- Sepharose 4B
12%分离胶 2.5 ml 3.0 ml 2.0 ml 75 ul 10 ul 75 ul 7.5 ml
• 按上表中所列顺序加试剂，加完AP后轻轻 摇匀，迅速加入两块玻璃板间。
• 在分离胶液面上缓慢滴加1 mL蒸馏水，聚 合15 min，至分离胶与水之间出现一条清 亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残 余的水。
4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液， 拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。 5．每个点样孔加30ul样品，每板胶加10ul Marker。 6．50V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将 电压调节到80V，电泳2-3h。
7．等到溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。
8．撬开玻璃板，将凝胶放在塑料盒内， 加入染色液，染色30min。 9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液 脱色。（或用蒸馏水加热脱色）
实验目的
• 掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋 白的原理和实验方法（第一部分） • 掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理 和方法（第二部分）
第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白
一、实验原理
亲和层析
生物大分子与配体特异非共价可逆结合。
• • • • • 酶-底物或底物类似物 抗体-抗原 激素-受体 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT）
GSH- Sepharose 4B
外源蛋白的表达和纯化
二、实验步骤
（一）目标蛋白诱导表达和菌体收集 1．0.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌中的蛋白 表达，28℃，200 rpm培养3-6 h。 2．5000 rpm离心5 min，倒掉上清。 3．沉淀加40 ml水，5000 rpm离心5 min。
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在 15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈 线性关系：log MW = K - bm
浓缩胶
• 浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场 中的迁移速度：Cl->蛋白质>Gly-。 • 电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形 成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋 白质加速移动。
（四）装GST柱子
1．清洗和装好层析柱，封闭出口。
2．加入2 mL PBS。 3．用滴管取0.5-1 ml GST填料，加入柱子中。
4．打开柱子出口，使PBS缓慢流出。
注意：始终保持柱内的液面高于GST树脂。
（五）纯化目的蛋白
1．用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。
2．将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3．用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4．加入1ml 洗脱液。
• 当蛋白质移到Cl-区时，高电压消失，蛋白 质的移动速度减慢，在快慢离子间被浓缩。
二、实验步骤
1．洗净玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后吹干， 安装制胶器。 2．根据下列配方制作12%分离胶。
12%分离胶
试剂名称
蒸馏水 30% 丙烯酰胺（29:1） 1.5M Tris-HCl（pH10% 过硫酸铵（AP） 总体积
5．用离心管收集洗脱液，每管收集0.2ml。 6．PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7．用分光光度计测定每一管的吸光度值， 记录读数，绘制洗脱曲线。 8．将读数最大的一管用于SDS-PAGE分析。
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
一、实验原理
• 蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消 除了蛋白质间原有的电荷差异。
（二）细胞破碎 1．倒掉上清，加30 ml PBS缓冲液悬浮菌体。
2．破碎菌体，超声波2 min，停止1 min。 （菌液始终保持在冰浴中）
3．重复8-10遍，直至菌液清澈。
（三）离心 1．每个小组分取1-2 ml细胞破碎液， 12000 rpm，离心5 min。 2．分取50 uL上清液，4℃保存。 3．其余的上清液准备过GST柱子。