亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测定

亚甲蓝病毒灭活的技术原理


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亚甲蓝又名美蓝，分子量 319185，是一种光敏剂，吩 噻嗪类染料，其最大吸收峰为 670nm，临床上常作为解 毒剂，用于治疗亚硝酸盐中毒引起的高铁血红蛋白血症 和氰化物中毒。 亚甲蓝表面携带正电荷，与病毒核酸结合后可以嵌入 DNA/RNA 中，与病毒核酸带负电荷的 G-C 碱基对相结 合。在有光照的条件下，亚甲蓝分子吸收光能后可激发 产生单态分子氧，这种单态分子氧通过修饰鸟嘌呤碱基 而影响核酸，使其产生缺口，引起核酸链的断裂或导致 碱基位点丢失，从而阻止其复制,达到灭活病毒的目的。

对亚甲兰光化学法病毒灭活有效性的研究显示，血浆中指 示病毒的滴度显著下降，血浆中的病毒含量下降了6个数量级， 可能残留的病毒量低于百万分之一，达到了国际公认的血浆病 毒灭活有效性指标，也符合卫生部关于血浆制品病毒灭活的有 关规定。
美国AABB技术手册描述了病原体灭活血浆制品， 介绍了欧盟开展的三种病毒灭活方法，其中包括 亚甲蓝、核黄素和补骨脂素。但美国未开展。 欧盟指南中描述了病原体灭活的FFP制品的质量 要求，同时也介绍了三种方法。 英国指南中明确描述了亚甲蓝处理和去除的FFP 制品的质量要求，质量要求中对亚甲蓝残留量要 求为≤0.3umol/L ，与我们的国标一致。
医用病毒灭活箱的应用
当前的医用病毒灭活箱是用于光照灭活 时的专用设备，它集光源、温控、机械 摆动等装臵于一身，可以根据需要设定 照射强度、照射温度、照射时间和摆动 频率等诸多条件，使用方便。
光源选择：荧光灯 （1）单位时间内照射所释 放的热量较低； （2）达到相同灭活效果的 照射时间最短； （3）波长接600~700nm。 照射方式：有效光照强度范 围在 30 000~40 000lx。 （1）放臵血袋的托盘为钢丝 结构，有较大空隙，使血袋 两面都可以接受照射； （2）照射过程中托盘以 60±2 次/分钟的频率摆动； （3）箱内面为镜面，可以将 灯管直射的光源和镜面反射 的光源从 360 度全方位地 照射血浆。
比色: 亚甲蓝遇光易分解，萃取后需及时比色
谢 谢！
亚甲蓝病毒灭活血浆在我国开展近十年，各种关于 病毒灭活对血浆主要成分影响情况的报道可归纳为： 血浆经过 MB-P 法灭活后，血浆总蛋白回收率90%以上； 但部分不稳定的凝血因子(Ⅴ，Ⅷ)和纤维蛋白原（Fg） 的变化明显，Ⅷ因子的回收率一般在 80%左右。血浆 的免疫原性、各种电解质、酶的稳定性等的变化不明 显，PH 值也未受影响。
亚甲蓝的浓度与血浆病毒的灭活效果有直接关系， 只有达到一定的释放量才能起作用，但亚甲蓝若残留 过多会影响血浆的外观色泽，且亚甲蓝存在致突变的 可能性，因而必须对灭活前后亚甲蓝的含量进行测。
血浆中亚甲蓝残留量的检测

固相萃取小柱将亚甲蓝从血浆中提取出。 分光光度计检测。 不能直接用分光光度计测定血浆中亚甲蓝 的含量,因为血浆本身为复杂的混合物,含有 多种蛋白,在亚甲蓝最大吸光波长处血浆蛋 白亦有吸光,而且血浆蛋白个体差异很大,因 此无法取得准确的检测结果,要想准确检测 血浆中亚甲蓝含量,必须排除干扰,既将亚甲 蓝提取出来,再进行测定。
1992年，德国最早将依靠该项技术处理的新鲜冰冻血浆应用于临床。
90年代中期，上海血液中心开发以荧光照射光源和配臵亚甲蓝去除 滤器为特点的亚甲蓝光化学血浆病毒灭活技术，随后该项技术在我国 被逐步推广。
2004年，世界卫生组织将亚甲蓝光化学血浆病毒灭活技术列入 “人血 浆制品病毒灭活或去除指南”， 欧盟和英国也纳入“输血指南”。
血浆制品病毒去除方法：
主要在血浆蛋白分离工艺中应用
乙醇沉淀 深层过滤 离子交换色谱和亲和层析色谱 纳米膜过滤 纳米膜过滤技术 单一的病毒灭活/去除方法虽然能较好的起到处理病毒 效果，但是无法灭活和去除所有病毒，如细小病毒B19、 VIR918、PARV4、SV40和PrPSc。
血浆病毒灭活方法
有机溶剂/去污剂（S/D）法
亚甲蓝病毒灭活血浆的质量控制
乌鲁木齐市血液中心质量管理科 梅静 2015.4
血浆病毒 灭活的必 要性
亚甲蓝病 毒灭活的 技术原理
亚甲蓝病 毒灭活血 浆的制备
病毒灭活 血浆的质 量控制
血浆病毒灭活的必要性
随着血液检测技术的进步和血液管理措施的完善，目 前的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV的检测在很大程度上降低了 输血导致病毒传播的几率，但由于 1 病毒变异导致免疫反应性的改变； 2 免疫静默感染； 3 检测技术存在窗口期漏检的局限性； 4 检测病原体种类的局限； 输血引起艾滋病病毒（HIV、HCV、HBV）的风险尚 不能完全杜绝；不常见的病毒如人类T淋巴细胞白血病病 毒（HTLV）、西尼罗病毒（WNV）、EB病毒等在大多数 国家均未被列入血液常规检测。现有的检测手段不能完全 排除血浆中可能存在的未知病毒。
主要检测设备：固相萃取富集装置
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亚甲蓝残留量检测方法
使用Waters Oasis小柱萃取血浆中的亚甲蓝
使用前的Waters小柱
1、用6ml甲醇活化Waters小柱 2、加入6ml供试血浆
亚甲蓝残留量检测方法
将萃取出的亚甲蓝洗脱后进行比色
Waters小柱萃取出 血浆中的亚甲蓝
3、萃取亚甲蓝 4、用30％甲醇6mL清洗 5、用含1％乙酸的甲醇溶液2ml洗脱 6、洗脱液离心（3500rpm/10min） 7、用含1％乙酸的甲醇溶液作试剂 空白，在654±2nm波长处测定 吸光度 注：用同样的方法萃取检测标准品
热处理 终端干热法
辛酸处理法
蒸汽处理法
低pH孵放法
以上方法多用于从原料血浆生产血 浆蛋白制品，均需要将大量的不同 人份的血浆混合处理，不但容易增 加某些不能被灭活病原体（如朊病 毒prion等）的扩散风险，且处理 难度大，费用高。
亚甲蓝光化学法能对单人份血 浆进行病毒灭活，适用于采供 血机构对临床用血浆的病毒灭 活处理，更适合于我国的国情 和临床实际应用。
亚甲蓝病毒灭活的技术原理
与脂膜和蛋白质结合 对核酸有较高的亲和性 亚甲蓝为多靶点的光敏剂，光照射产生单线态氧和羟自由基引 起广泛损伤 亚甲蓝可与病毒的核酸与脂质包膜相结合，在可见光的作用下， 可使病毒的核酸断裂，包膜破损，因而能杀灭包括艾滋病病毒 （HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）等的脂质包 膜病毒和部分非脂质包膜病毒。
亚甲蓝作为一种外来物质进入人体后，对人体的潜在影响尚不 可知。若病毒灭活血浆中残留过多的亚甲蓝，还会造成血浆外 观和色泽的明显改变，使病人输注时可能产生心理负担。 在保证灭活所需的有效浓度下，要尽量减少其残留量，因而对 病毒灭活血浆中的亚甲蓝残留量/率进行控制很有必要。选择 合适的亚甲蓝含量的测定方法很重要。
6、洗脱
换干净的试管，加2ml洗脱液洗脱小柱上的亚甲蓝。
7、检测
将洗脱液离心3000转/5分钟，取上清液于4040半自动 生化分析仪检测洗脱液调零，654nm波长，分别测定 标准管和测定管吸光度。
测定管吸光度 ×0.5 标准管吸光度
计算：亚甲蓝（μmol/L）= （μmol/L）
注意事项
留取标本：病毒灭活冰冻血浆臵30～37℃融化时 间应小于6分钟。为使其尽快融化，应不断轻柔 摇动血浆袋。不得急剧摇动血浆袋，以防止血浆 中出现大量泡沫。
2007年乌鲁木齐市血液中心引进该技术, 截至2014年底使用亚甲蓝光 化学病毒灭活血浆13万单位以上。
一次性使用血浆病毒灭活输血过滤器


Depasse 最早提出了 “过滤器的应用”， 极大地简化和改进了 MB-P 法的操作，为 MB-P 法由实验室走向临床迈出了重要一 步。 目前使用的一次性使用血浆病毒灭活输 血过滤器主要由亚甲蓝添加元件、光照 袋、过滤器、血浆储存袋和连接管路组 成，是一种简便、实用的血浆灭活器材。
亚甲蓝检测依据

《血站技术操作规程》2012年版：14 附录 F 血液质量控制检查方法 — F.19 亚甲蓝残留量。 《全血及成分血质量标准》 GB18467-2012— 5.16病毒灭活冰冻血浆质量标准，亚甲蓝残留 量 ≤0.30 µmol/L。

血浆中亚甲蓝残留量的检测
所需实验仪器、试剂

试验仪器:
0.04ml混匀）于标明标准的小柱内加0.3ml标准液
3、加质控液（0.300μmol/L）： （取血浆0.36ml,加质控液0.04ml混匀） 于标明标准的小柱内加0.3ml质控液 4、加样：于标明测定的小柱内加6.0ml血浆
5、清洗
待血浆完全进入小柱后，用3ml清洗液清洗小柱，去血浆中的蛋白
质、脂质和其他杂质，血浆中亚甲蓝被吸附于吸附剂上。

固相萃取富集装臵及配套的固相萃取耗材：推荐使用Waters Oasis产品 （www.waters.com） 真空泵


分光光度计
试管离心机


试剂：亚甲蓝标准品粉剂、甲醇、乙酸、蒸馏水

其他耗材：容量瓶、移液器、试管等
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亚甲蓝残留量的检测原理
固相萃取-分光光度法
利用固相小柱内吸附介质是一种大孔聚合物， 对血浆中亚甲蓝具有很强的选择性吸附，可排除血 浆蛋白、脂肪和其它杂质的干扰，当血浆标本通过 小柱时，血浆中血浆中亚甲蓝被柱子中大孔聚合物 吸附，最后用洗脱液洗脱液洗脱亚甲蓝，采用柱子 提取血浆中残留亚甲蓝，用含1%醋酸的甲醇溶液调 零，在653 nm检测标准、质控、测定管，其吸光度 与浓度呈正比。





Waters Oasis小柱特性: -大孔聚合物.对化合物的保留强 - 是一种通用性的吸附剂（pH范围较宽1-14） - 30%甲醇清洗,可完全去除血浆中的蛋白、脂质和其它杂 质 - 亚甲蓝在不同溶剂中,最大吸收峰不同： 甲醇溶液为653nm ,故本法选653nm 为测试波长. - 可用1％乙酸的甲醇溶液,迅速将柱床顶的亚甲蓝洗脱. 亚甲蓝酸性染料，（pH3.5 1％乙酸的甲醇溶液）
成品试剂盒的组成
小柱
R1： 活化液
R2： 清洗液
R3： 洗脱液
亚甲蓝标准液：（100μmol/L)
质控液：（0.300μmol/L）
操作方法（详读说明书、按说明书操作）
1、柱预处理
取小柱三支表明测定、标准、质控，分别插入固相萃取装臵过滤柱子
中，加入3ml活化液活化小柱。 2、加标准液（ 10μmol/L）：（取血浆0.36ml,加100μmol/L标准液