免疫学实验方法

ELISPOT（酶联免疫斑点法）
方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果 B细胞产生抗体，抗体与班上的抗原结合。加入二抗和显色 剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。
此法的主要优点是:
① 稳定、特异，且抗原用量少；
②与ELISA联合使用，可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌
，并可定量测定； ③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
（2）巨噬细胞吞噬试验：将待测巨噬细胞与某种可
被吞噬又易于计数的颗粒性物质（如鸡红细胞）混
合温育后，颗粒物质被巨噬细胞吞噬，根据吞噬百
分率即可反映巨噬细胞的吞噬能力。
三、细胞因子的检测
酶联免疫吸附试验-ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
•基础: 抗原或抗体的固相化
结果判断 • 设立实验对照:阳性对照和阴性对照
• 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
TNFR1–/–
TNFR1–/–/TNFRR2–/–
Figure 3. mTNF induces infiltration of innate immune cells and angiostasis in tumors from TNFR1–/– but not TNFR1–/–/R2–/– mice. and CD31+ (E and F) cells as indicated. G and H, for confocal microscopy analysis, tissue sections were stained with Cy3-labeled anti-CD31 for blood vessel endothelial cells (green) and the VasoTACS in situ kit to detect apoptosis (red). Arrows, apoptotic endothelial cells in the tumor.
•成败的关键因素： 组织的固定、包埋
抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间）
非特异性抗原的封闭
内源性酶或自发荧光的消减
显色
思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？
五、免疫印迹技术 –Western Blotting （分子生物学实验方法）
一. 蛋白质样品的提取分离
二. 蛋白质样品的定量
抗原或抗体的酶标记 * *
•用途：目标蛋白的定性或定量分析
ELISA三个必要试剂：
（1）固相的抗原或抗体，
即"免疫吸附剂"（immunosorbent）;
（2）酶标记的抗原或抗体， 称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。
ELISA基本的实验过程： a.包被 b.抗原抗体反应 c.酶促反应,显色 d.终止显色，读取数据。 对照和标准曲线： 阳性对照 阴性对照 定量测定：标准品制作标准曲线 待测样品的合理稀释
细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。
详细见后述
3．细胞毒试验
细胞毒实验技术是检测 CTL 、 NK 等细胞杀伤靶
细胞活性的一种细胞学技术。主要用于肿瘤免疫、
移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。
（1）放射性核素释放法：(51Cr、125I—UdR)
51Cr
release
CTL
51Cr
labeled
免疫学试验方法
Commonly used immunological methods
免疫
识别和清除抗原性异物
可能有利，也可能有害
免疫应答
免疫系统具有区别“自己”和“非己”的能力
免疫耐受
免疫学检测与免疫学技术
一、抗原抗体的检测技术 二、免疫细胞的检测 三、细胞因子的检测-ELISA 四、免疫组织化学 五、免疫印迹技术 –Western Blotting 六、 流式细胞术 七、PCR技术 八、基因沉默技术
度越快，则甲簪生成的量越多，吸光度越高；细胞
毒性越大，则甲簪生成的量越少，吸光度越低。
MTT实验流程
1. 细胞的增殖和细胞毒实验，一般可在96孔细胞培养板中进行。 2. 每孔加入100微升细胞悬液。细胞的数量取决于实验目的和培养时间。增殖实验 每孔通常加入103个以上数量的细胞；细胞毒性实验每孔至少加入5x103个或以上数 量的细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等 因素确定)。 3. 接种的细胞按照实验需要，送入细胞培养箱进行培养。增殖实验通常要给予010微升特定的药物或生长因子进行刺激。细胞毒实验通常要给予0-10微升抑制因子
细胞密度：
每毫升培养基中活细胞的个数=每个方块内细胞的平 均数×细胞稀释比例×104
1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4cm3 = 10-4 ml
(二)免疫细胞功能的测定
1．T细胞功能测定
（ 1 ） T 淋巴细胞增殖试验： T 细胞受到特异性抗原
或有丝分裂原（PHA、ConA）刺激后可发生增殖，
Target cell CTL
Target cell
Assay Cr51 release
Target cell
（2）乳酸脱氢酶释放法：细胞受损，LDH释放，
LDH在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成
NADH 。后者再通过递氢体 - 吩嗪二甲酯硫酸盐
(PMS) 还原碘硝基氯化氮唑蓝 (INT) 或硝基氯化四 氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm 或570nm波长处读取的OD值，经计算即可得NK细 胞活性. （3）MTT比色分析法
• 免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只 是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上 有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度 非常高。 • Western Boltting 先要进行SDS-PAGE，然后 将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载 体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测 样品，可以用于定性和半定量。
（2）迟发型超敏反应（DTH）的检测：此方法为体
内检测细胞免疫功能的简便易行的皮试方法。其原
理是外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同
的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并
释放多种细胞因子，产生以单核细胞浸润为主的炎
症，局部发生充血、渗出，于24~48小时发生，72小
时达到高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反 应强烈的可发生水肿，甚至坏死。
ELISA与Western Blotting比较
• WB可以看到特异性的条带，但是定量比较麻烦； • ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那 得到的数值就不可信； • WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到； • WB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测； • WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体 、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白 起作用的；而ELISA无能为力； • WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。ELISA一 块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照 、梯度样等来提高检测的可信度。
• 原理：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的
抗原（抗体）标记上荧光素制成荧光标记物， 再用这种荧光标记物作为分子探针检查细胞或 组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织 中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，荧光 素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看 见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗 体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量 。
织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核 阳性。 • ELISA用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是 血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到
组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作
上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来 形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸 附”的含义。
四、免疫组织化学 Immunohistochemistry 原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶）
用途：组织或细胞内抗原的定性和定位
流程：
免疫荧光技术（immunofluorescence ，IF）
• 定义：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧
光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内
分布的方法。
一、抗原抗体的检测技术 免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系
列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞 因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研 究中的应用。 免疫学技术的应用极为广泛，疾病的诊断 、疗效评价及理论研究等。
二、免疫细胞的检测 对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定 (一)细胞计数—细胞计数板 *准备细胞计数器：70%乙醇 →制备单个细胞悬液：贴壁细胞需胰酶消化 →加样 → 细胞计数： 100 倍镜下观察，“计上不计下，计 左不计右”
可通过以下三种方法检测。
1）形态计数法
2）3H-TdR或125I-UdR掺入法
放射性元素 wash
Stimulate
Assay
3）MTT（噻唑蓝）比色法 MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被
活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素
还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此
甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速
三. 制备SDS－PAGE胶
四. 转移电泳及免疫印迹
五. 结果分析-用Western Blot 图片灰度分析软件
imageJ或Quantity One
免疫学三大工具比较
• 免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧 光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行
定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组
4．吞噬功能测定 （1）硝基蓝四氮唑试验：硝基蓝四氮唑（NBT）是 一种水溶性的淡黄色染料。由于在杀菌过程中产生 反应性氧中间物（ROI），其中超氧阴离子（O2-） 能使被吞噬进细胞内的 NBT 还原成不溶性蓝黑色甲 臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数 NBT 阳性细胞 ，可反应中性粒细胞的吞噬功能。
假阴性结果。
• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大
分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原，因其不能形成两位点夹心 。
间接法测抗体
☆ 间接法是检测抗体最常用的方法。 ☆ 原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的
受检抗体，故称为间接法。
☆ 操作步骤：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ相抗原，
洗涤。
（2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固相抗原
结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。
（3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而
使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量
。
☆间接法的特点 • 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病 的诊断。 • 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一 酶标抗体检测相应抗体。 • 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意 除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗 原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被 效果。
2．B细胞功能测定
B 细胞受多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，
活化、增殖，最后分化为浆细胞，产生抗体。抗体
可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定 B
细胞功能的最主要的方法。 （1）B淋巴细胞增殖试验：LPS或PWM刺激
（2）B细胞产生抗体能力的检测：
1）ELISA检测培养上清中抗体的量。
2）ELISPOT（酶联免疫斑点法）可检测抗体分泌
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
双抗体夹心法测抗原（常用） • 夹心法 双抗原夹心法测抗体 • 间接法测抗体（常用）
竞争法测抗原
• 竞争法 竞争法测抗体 • 捕获包被法测抗体 • 亲和素-生物素 ELISA法
双抗体（原）夹心法测抗体
双抗原夹心法
双抗体夹心法
*
待测抗体
*
酶标抗原
酶标抗体
待测抗原
包被抗原 包被抗体
Anti-HIV, Anti-HBs
HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2
☆双抗体夹心法测抗原步骤
包被特异性抗体
洗涤
加入待测样品
孵育 洗涤
加酶标特异性抗体
孵育 洗涤
底物显色
☆双抗体夹心法测抗原特点
• 抗原浓度过高出现钩状效应（Hook effect）: 所得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现
或细胞毒药物；
4．培养结束后，每孔加入20微升MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育3－6小时； 5．孵育结束后，每孔加入100微升甲簪溶解液，在37℃细胞培养箱内再继续孵育， 直至在镜下观察甲簪全部溶解。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。 如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时 间会略长。 6. 在570nm测定吸光度。如无570nm滤光片， 560-600nm范围的滤光片均可使用。