构建点突变质粒步骤

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构建点突变质粒步骤

基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。

三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复.突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp,我们建议引物长度为30～35 bp.一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11—12 bp。

若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11—12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物.（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40％）。

（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40％）。

（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

(5）最好使用经过纯化的引物。

Tm值计算公式:Tm=0。

41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC:引物GC含量。

四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’—CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T）设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5'-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC—3’Primer ＃2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5（Tm=0。

41×40-675/30+81.5）。

重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达

重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【摘要】目的：构建Tudor-SN蛋白的Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240（T240）和Threonine429（T429）的点突变质粒，并使该重组质粒能够在HeLa细胞中融合表达。

方法：利用定点突变技术，对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A点突变，通过双酶切的方法获得Tudor-SN.Mutants片段，最后将其连入到pCMV-N-Flag载体中。

在HeLa细胞中转染该质粒，利用Western blot技术检测质粒表达效率。

结果：（1）重组质粒经双酶切鉴定，可以观察到载体与Tudor-SN.Mutants的条带。

（2）转染突变质粒后可看出HeLa细胞中有Flag蛋白表达。

结论：质粒构建成功，可以用于下一步科学研究使用。

%Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag. Methods:The Serine426 (S426), Serine781(S781), Threonine240(T240)andThreonine429(T429)of Tudor-SN were transformed into Alanine by site-directed mutagenesis technique. Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion, and then inserted into pCMV-N-Flag vector. The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot. Results:(1)The vector and Tudor-SN. Mutants could be observed by restricting double enzyme digestion.(2)Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid. Conclusion:The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully, and may be useful for further study.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】4页(P5-8)【关键词】人类Tudor-SN蛋白;pCMV-N-Flag;重组质粒;融合蛋白【作者】杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【作者单位】天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070; ]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070【正文语种】中文【中图分类】Q7Abstract Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag.Methods：The Serine426（S426）,Serine781（S781）,Threonine240（T240）and Threonine429（T429）of Tudor-SN were transformed into Alanine by site- directed mutagenesis technique.Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion,and then inserted into pCMVN-Flag vector.The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot.Results：（1）The vectorand Tudor-SN.Mutants could beobserved by restricting double enzyme digestion.（2）Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid.Conclusion：The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully,and may be useful for furtherstudy.Key words human Tudor-SN；pCMV-N-Flag；recombinant plasmid；fusion protein人类Tudor-SN蛋白，又称SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）或p100，该蛋白首次以EB病毒细胞核抗原2（epstein-barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的转录共激活因子被发现[1]。

环状质粒 pcr 构建定点突变序列

环状质粒 pcr 构建定点突变序列标题：环状质粒PCR构建定点突变序列在遗传工程领域，环状质粒PCR技术被广泛应用于构建定点突变序列，以实现对目标基因的精确控制和调节。

本文将介绍环状质粒PCR构建定点突变序列的原理、步骤以及应用前景。

一、原理环状质粒PCR是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，通过引入特定的引物和模板DNA，可以在特定位点引发突变。

其原理主要包括以下几个步骤：1.设计引物：根据目标基因序列，在突变位点的上下游设计引物，确保能够选择性扩增目标序列。

2.扩增反应：将设计好的引物与模板DNA一起加入PCR反应体系，进行多轮的循环反应，使目标序列得以扩增。

3.定点突变：在PCR反应体系中加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列进行配对，从而引发突变。

4.纯化和检测：通过凝胶电泳或其他检测手段，验证突变序列的引入是否成功。

二、步骤环状质粒PCR构建定点突变序列的步骤如下：1.设计引物：根据目标基因序列，利用生物信息学工具设计引物，确保引物的特异性和扩增效率。

2.模板制备：从目标基因所在的质粒中提取模板DNA，确保模板的纯度和完整性。

3.反应体系准备：根据PCR反应的需要，准备好反应缓冲液、酶、引物和dNTP等试剂。

4.扩增反应：将模板DNA与反应体系混合，利用PCR仪进行循环反应。

根据目标序列的长度和复杂性，设置合适的扩增程序和循环次数。

5.突变引入：在PCR反应的合适环节，加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列发生配对，引发突变。

6.纯化和检测：通过凝胶电泳等方法，纯化扩增产物并进行突变检测，确认突变序列的引入是否成功。

三、应用前景环状质粒PCR构建定点突变序列具有以下应用前景：1.基因功能研究：通过引入特定的突变序列，可以研究目标基因的功能和作用机制，揭示基因与表型之间的关系。

2.基因工程改良：利用定点突变序列构建新的基因表达载体，可以实现对基因表达的精确调控，为基因工程改良提供技术支持。

DNA定点突变实验具体步骤及详细说明

DNA定点突变实验具体步骤及详细说明定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。

一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。

二、反应1. 使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。

2. 反应体系：（1）10x pyrobest Buffer：5 ul（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul（7）加无菌蒸馏水至50ul.三、产物沉淀纯化1. 加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离心弃上清。

2. 70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用DpnI 酶切）。

四、DpnI酶切1. 酶切体系（1）Buffer ：2 ul（2）BSA（100x）：0.2 ul（3）DNA ：x ul（4）DpnI：0.5 ul（5）加无菌去离子水至20 ul。

2. 30℃酶切1~4 h。

3. 65℃水浴15min 终止反应。

五、转化将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。

六、测序验证注意事项1. 引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。

2. Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChange®、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒、QuikChange®、XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。

突变型PUMA质粒的构建及表达

研究使用的ＰＵＭＡ基因来源于ｐＣＥＰ４一（ＨＡ）－Ｐｕ－ＭＡ质粒，通过野生型和突变型质粒的成功构建，旨在为突变型ＰＵＭＡ对肿瘤细胞的促凋亡功能研究
奠定基础。
隆到ｐＩＲＥＳ２．ＥＧＦＰ载体上，构建ＰＵＭＡ真核表达载体
ｐＩＲＥＳ２一ＥＧＦＰ一（ＨＡ）．ＰＵＭＡ，利用定点突变技术构建ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ一（ＨＡ），一ＰＵＭＡ— Ｔ２８Ｇ，行ＰＣＲ及测序鉴定；脂质体分别将两种质粒转染Ｈｅｌａ细胞，同时设未转染的阴性对照组及转染空载体组（４个实验组）；ＰＩ染色观察ＰＵＭＡ对细胞的促凋亡作用；流式细胞仪检测细胞凋亡率；ＲＴ — ＰＣＲ检测ＰＵＭＡ的表达；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测突变型ＰＵＭＡ蛋白和标签蛋白的表达。结果经ＰＣＲ及测序结果表明，正确构建野生型、突变型ＰＵＭＡ重组质粒，ＰＵＭＡ基因第１０位氨基酸的第２８～３０位碱基由丝氨酸（ＴＣＣ）突变为丙氨酸
ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ２０１３Ａｐｒ；４８（４）
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突变型ＰＵＭＡ质粒的构建及表达

质粒定点突变操作步骤

质粒定点突变
1.简介
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。

定点突变能迅速高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

本实验主要原理是设计一对包含突变位点的引物，和模板质粒退火后用高保真DNA聚合酶循环延伸后用Dpnl 酶切延伸产物。

由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经过dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切碎（Dpnl 识别序列为甲基化的GATC，GA TC在几乎各种质粒中不止一次出现），而体外合成的突变质粒没有甲基化不被消化因此得以在成功转化，随后得到突变的质粒克隆。

2.材料
2.1试剂
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（诺唯赞Vazyme Biotech，#P505-d1-AA）
2 × Phanta Max Buffer（诺唯赞Vazyme Biotech，#PB505）
dNTP Mix (10 mM each)（诺唯赞Vazyme Biotech，# P031-01/02）
DMSO
3.步骤
1、设计一对包含突变位点的互补引物。

2、反应体系
反应程序
所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分混匀，用完之后请及时放回-20℃保存。

3、反应产物加入0.5 μl Dpnl酶，37 ℃静置>2 hs。

4、静置后取2 μl加入100 μl Turbo进行转化，后面步骤同分子克隆。

质粒的构建

质粒的构建一、质粒构建的基本原理1.1 质粒结构质粒是一种环状DNA分子，通常大小在1-200 kb之间，其中包含了一个或多个基因编码序列，以及与复制、表达等相关的功能序列。

质粒通常由多个功能区域组成，包括基因插入位点、选择标记、复制起点、多克隆位点等。

1.2 质粒构建方法质粒构建一般分为以下几个步骤：基因克隆、质粒挑选、连接反应、转化、筛选，这些步骤通常需要借助于PCR、限制性内切酶、DNA连接酶、转化试剂等。

1.3 质粒的应用质粒构建技术广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因敲除、基因组编辑等领域。

通过构建特定功能的质粒，可以实现对基因的操控和调控，对生物学功能进行研究。

二、质粒构建的方法与步骤2.1 基因克隆质粒构建的第一步通常是通过PCR扩增目的基因，得到目的基因片段。

基因片段的选择根据实验需要，可以是全长基因、部分序列、突变体等。

2.2 质粒挑选选择合适的质粒载体是质粒构建的关键一步。

通常质粒载体的选择考虑到基因插入位点、复制起点、选择标记等功能。

常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pET等。

2.3 连接反应将基因片段与质粒载体进行连接反应，通常需要利用DNA连接酶将两者连接起来。

连接反应后，通过热激酶等方法将连接产物转化到大肠杆菌等宿主细胞中。

2.4 转化转化是将连接后的质粒DNA导入到宿主细胞中的过程，通常采用化学转化、电穿孔转化、热激等方法进行。

2.5 筛选通过选择标记或多克隆位点等方法对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目的质粒的阳性克隆。

通常可以利用抗生素抗性筛选、荧光报告基因筛选等方法。

三、质粒构建的应用3.1 基因工程质粒构建技术可以用于将外源基因导入到宿主细胞中，实现基因的操控和表达。

通过构建携带感兴趣基因的质粒，可以实现对基因编码蛋白质的表达和研究。

3.2 蛋白质表达利用质粒携带外源基因序列，在宿主细胞中进行蛋白质表达。

通过构建携带目的基因的质粒，可以实现对特定蛋白质的大量表达和纯化。

定点突变过表达质粒

定点突变过表达质粒
定点突变过表达质粒指的是在基因序列中通过特定的突变点，引入一种转录或翻译水平上过度表达的质粒或载体。

这种质粒常用于研究特定蛋白质功能、鉴定关键结构域以及评估在不同病理条件下的功能改变等。

要构建定点突变过表达质粒，首先需要确定目标基因的突变位点，这可以通过文献研究、结构生物学信息分析等方法来确定。

随后，可以采取多种方法来实现定点突变，如PCR扩增、聚合酶链反应、酶切和连接等。

具体操作步骤如下：
1. 设计合适的引物：根据目标基因的序列，设计与突变位点相匹配的特异性引物。

引物的设计要遵循引物设计原则，确保产生所需的突变。

2. 进行PCR扩增：使用设计的引物进行PCR扩增，从模板DNA中扩增出包含突变位点的目标基因片段。

3. 纯化产物：将PCR产物进行酶切或其他纯化方法，以获得纯净的片段。

4. 进行定点突变：使用突变引物和PCR产物作为模板，采用引物延伸方法，将突变引物与目标基因片段连接起来，形成含有突变的目标基因片段。

5. 构建表达载体：使用适当的酶切和连接技术，将突变的目标基因片段连接到表达载体中，如质粒或病毒载体，以构建定点突变过表达质粒。

6. 进行转染和表达：将构建好的质粒导入宿主细胞，并进行适当的培养和条件优化，以实现目标蛋白质的过表达。

最后，通过适当的测量和分析方法，如Western blot、荧光显微镜等，对目标蛋白质的定点突变过表达进行验证和表征。

总结而言，定点突变过表达质粒的构建需要确定突变位点、设计引物、进行PCR扩增和突变、连接到表达载体中等多个步骤。

这种质粒广泛应用于蛋白质功能研究和疾病机制的探索，为相关领域的研究提供了重要的工具和平台。

巨噬细胞点突变构建

巨噬细胞点突变构建
巨噬细胞点突变构建是一种生物学技术，用于研究巨噬细胞的基因功能和疾病机制。

下面是一个简单的构建流程：
1. 定点切割DNA：使用CRISPR-Cas9技术，通过人为设计的sgRNA引导Cas9蛋白对靶位点处的DNA进行切割，产生DNA双链断裂。

2. 同源重组修复DNA：将人为合成的含有突变位点的DNA序列作为同源修复模板，与sgRNA和Cas9蛋白一起转染进细胞。

3. 阳性细胞筛选：使用稀释法将细胞池细胞稀释转移到96孔板中，形成单克隆细胞。

然后收集单克隆细胞进行大量测序，以得到预期的纯合子细胞。

巨噬细胞点突变构建是一个复杂的过程，需要对基因组编辑、细胞培养和分子生物学等方面有深入的了解和丰富的经验。

如果你需要构建巨噬细胞点突变模型，建议咨询专业的生物技术公司或实验室。

构建点突变质粒步骤

构建点突变质粒步骤
一、引言
本文旨在介绍构建点突变质粒的具体步骤。

点突变是指在DNA的序列中改变单个碱基，通常用于研究蛋白质结构和功能。

点突变可以通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术实现。

二、材料和方法
2.1 PCR扩增
PCR（聚合酶链式反应）是指在高温下使DNA变性，然后利用Taq聚合酶进行DNA扩增。

PCR扩增需要设计两个引物，引物的长度一般为20-30bp，引物的浓度一般为0.1uM。

PCR扩增的反应条件如下：94℃变性2min→94℃ 30s→58-65℃ 30s→72℃ 1min/kb（循环30-35次）→72℃5min停止反应。

PCR扩增的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。

2.2 DNA纯化
将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。

将样品加入吸附柱，再加入洗涤缓冲液将杂质洗掉，最后加入洗脱缓冲液使DNA从柱子中洗脱出来。

2.3 定向克隆
定向克隆是指利用限制性内切酶切割DNA，然后进行质粒载体的克隆。

先将PCR产物与质粒载体酶切后连接，然后转化到大肠杆菌中，通过筛选获得阳性克隆子。

在定向克隆的过程中需要注意引物的合成和酶切位点的选择，以保证克隆效率和准确性。

2.4 测序
测序是指对克隆子的DNA序列进行测定和分析。

将克隆子的DNA片段进行扩增和纯化后送到生物技术公司进行二代测序，得到测序结果后进行序列比对和分析。

三、结论
通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术，可以实现构建点突变质粒的目的。

本文介绍了具体的步骤和注意事项，希望能够对相关科研工作者提供一定的参考。

质粒点突变技术

质粒点突变技术：从原理到应用全面解析质粒点突变技术是分子生物学研究中常用的一种技术手段。

质粒点突变是指针对质粒中的一个或多个位点进行特定的改变，因此可以用来研究基因功能、蛋白质结构、信号转导、免疫调节等多个方面。

在本文中，我们将会从质粒点突变的基本原理开始，阐述质粒点突变的具体步骤和常见方法，并通过实例探讨质粒点突变在实验室中的应用。

首先，我们需要了解质粒点突变的基本原理。

质粒点突变可以通过多种方法进行实现，如撤除、插入、替换等。

这些操作都会改变质粒中某一位点的氨基酸序列，从而影响蛋白质的结构和功能。

由于生物体正常运转需要复杂的协同作用，单点突变往往可以引起基因表达、蛋白质活性等方面的变化。

在研究药物靶标、疾病机制、代谢通路等方面，质粒点突变技术都可以发挥重要作用。

具体地，质粒点突变需要经过以下步骤：1.设计点突变目标；2.合成突变引物；3.进行PCR反应；4.纯化PCR产物；5.用突变质粒构建大肠杆菌；6.筛选突变质粒；7.验证点突变效果。

其中，点突变目标的设计需要结合DNA序列以及蛋白质建模和序列比对等手段，合成突变引物则需要根据基因序列中的具体信息进行设计。

在实验室中，常见的质粒点突变方法包括 PCR突变法、限制性酶切法、自发突变法等。

PCR突变法是目前应用最广泛的突变技术，它能够在短时间内完成突变并且效率较高，但其需要添加较高浓度的引物和热稳定酶，容易出现扩增产物杂乱和酶切失效的情况。

而限制性酶切法是一种选择性突变方法，适合进行小段区域的突变，但是其扩增产物的长度往往较短，需要经过特殊的操作才能转化进入大肠杆菌进行筛选。

自发突变法是一种自然的基因突变方法，能够“随机”产生大量的突变体，但是其突变率低，突变类型也比较复杂。

因此，在具体操作的时候需要根据研究需求、样本和测量方法等要素进行选择。

最后，我们需要关注质粒点突变在实际应用中的一些注意事项。

首先，突变质粒的产生需要严格的质量控制，避免杂质的干扰。

质粒点突变实验步骤

质粒点突变实验步骤
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲质粒点突变实验步骤。

这可真是个有趣又有点挑战性的事儿啊！
咱先得准备好各种材料和工具，就好像战士上战场得把武器装备齐全咯。

质粒那可是咱的主角，还有各种酶啊、缓冲液啥的，一个都不能少。

接下来，设计突变引物可太关键啦！这就好比给房子画设计图，得精确又巧妙。

可别小瞧了这小小的引物，它决定着咱能不能成功引入突变呢。

然后呢，就该PCR 扩增啦。

这就像是搭积木，一块一块地把咱需要的片段给搭建起来。

这个过程可得细心再细心，温度啦、时间啦都得把握好，不然可就功亏一篑啦。

扩增完了，就得处理产物啦。

把那些不需要的东西去掉，留下咱的宝贝突变片段。

这感觉就像是沙里淘金，得有耐心呀。

之后，把突变片段和质粒连接起来。

这就像是把两块拼图完美地拼在一起，得严丝合缝的。

再接着，把连接好的产物转化到细菌里。

细菌就像是小货车，带着咱的突变质粒到处跑。

然后就等着细菌们长大啦。

看着它们一点点繁殖，就好像看着自己的孩子慢慢长大一样，心里充满了期待。

等细菌长好了，还得筛选出咱要的带有突变的细菌。

这可不容易呢，得仔细甄别。

最后，验证突变是否成功。

这就像是验收成果，要是成功了，那可真是让人开心啊！
你说这质粒点突变实验是不是像一场冒险？每一步都充满了未知和挑战，但也正是这样才有意思呀！只要咱认真对待每一个步骤，就一定能取得好结果。

加油吧，朋友们，让我们在质粒点突变的世界里畅游，创造出属于我们的精彩！。

构建点突变实验报告

构建点突变实验报告1. 引物设计：根据需要验证的基因序列，设计需要扩增的基因片段引物。

引物设计方法如下：（1）引物F：5’端- 保护碱基序列+ 限制性内切酶1 酶切位点序列+ 基因正向引物序列- 3’端（2）引物R：5’端- 保护碱基序列+ 限制性内切酶2 酶切位点序列+ 基因反向引物序列- 3’通过加入基因组 DNA 模板以及设计好的引物进行目的基因的扩增，得到 PCR 产物后进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物。

由于加入保护碱基，回收产物需要进行限制性内切酶切从而暴露黏性末端。

2. 线性化质粒：将原始的质粒载体，比如pcDNA3.1 质粒，选择合适的酶切位点，比如NheI/KpnI 进行酶切，获得线性化的质粒酶切体系一般选择50ul，试剂加好之后37°C 孵育6~8 小时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。

每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。

酶切后载体通过切胶回收线性化载体3. 质粒连接：将线性化的载体与目的基因的连接，推荐在10~20μl 反应体系中进行连接反应，可以选择T4 酶进行黏性末端的连接4. 转化涂板：将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a），涂板，培养过夜。

次日，挑取平板上单克隆菌落进行摇菌, 送菌液测序，得到野生型质粒。

第二阶段: 突变型质粒构建在得到野生型质粒之后，下一步就是对目的基因片段进行突变啦，即将目的基因上面的一个碱基或多个碱基换成另外的碱基质粒突变的原理: 即通过设计引物, 并利用PCR 将模板扩增出来, 待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR 扩增得到的质粒不会被甲基化这样用甲基化酶DpnI 酶处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR 扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。

1．突变引物设计: 向质粒进行单点或者多点突变，只需要设计一对引物，进行PCR 的扩增，替换掉野生型基因的突变位点碱基。

点突变实验报告

一、实验目的1. 理解点突变的概念和特点。

2. 掌握点突变实验的基本原理和方法。

3. 学习利用点突变实验研究基因功能和蛋白质结构。

二、实验原理点突变是指基因序列中单个碱基的改变，导致编码的氨基酸发生变化或终止密码子的出现。

点突变实验通常采用DNA测序、蛋白质分析等方法来研究突变对基因功能和蛋白质功能的影响。

本实验以某种基因的DNA序列为研究对象，通过人工合成带有突变碱基的DNA片段，将其导入宿主细胞，观察突变对细胞生长、蛋白质表达和功能的影响。

三、实验材料1. 实验菌株：大肠杆菌DH5α2. 基因DNA模板：某基因的DNA序列3. 突变引物：针对目标基因的突变位点设计的引物4. 限制性内切酶：用于切割基因DNA5. 连接酶：用于连接突变DNA片段和基因DNA6. 载体质粒：含有T7启动子和荧光素酶基因的质粒7. DNA聚合酶：用于DNA合成8. 氨苄青霉素：用于筛选含有突变基因的细胞9. 细胞培养试剂：LB培养基、酵母提取物、葡萄糖等四、实验方法1. 突变引物设计：针对目标基因的突变位点，设计一对突变引物，分别位于突变位点的上下游。

2. 突变DNA片段合成：利用PCR技术，以基因DNA为模板，突变引物为引物，合成突变DNA片段。

3. 基因DNA切割：利用限制性内切酶，切割基因DNA和突变DNA片段。

4. DNA连接：将切割后的基因DNA和突变DNA片段连接起来，形成含有突变基因的重组质粒。

5. 质粒转化：将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，筛选出含有突变基因的细胞。

6. 蛋白质表达：在含有突变基因的细胞中表达突变蛋白，检测突变对蛋白质功能的影响。

7. 细胞生长实验：比较突变前后细胞的生长速度和生长曲线，观察突变对细胞生长的影响。

8. 荧光素酶活性检测：通过荧光素酶活性检测，观察突变对蛋白质功能的影响。

五、实验步骤1. 突变引物设计：根据基因序列，设计一对突变引物，确保突变位点的准确性。

2. 突变DNA片段合成：以基因DNA为模板，利用PCR技术合成突变DNA片段。

全质粒pcr点突变怎么成环

全质粒PCR点突变怎么成环一、引言全质粒PCR（polymerase chain reaction）是一种重要的分子生物学技术，它可以通过体外扩增DNA片段，其中最常见的应用就是进行点突变。

点突变是指DNA序列中的单个碱基发生变化，这种变化可能导致蛋白质结构和功能的改变。

全质粒PCR可以精确、快速地制备全长质粒，为后续的实验提供了丰富的材料。

本文将深入探讨全质粒PCR点突变的成环过程，并介绍一种实验方法。

二、全质粒PCR点突变的成环过程全质粒PCR点突变的成环过程包括以下几个关键步骤：引物设计、PCR反应、酶切和连接、转化和筛选。

2.1 引物设计在进行全质粒PCR点突变之前，首先需要设计合适的引物。

引物设计应满足以下几个要求：能够扩增目标质粒的全长序列，带有点突变的引物单链序列应长度一致，点突变位点在引物中靠近片段中间，周围没有相同碱基，避免非特异性扩增。

2.2 PCR反应PCR反应是全质粒PCR点突变的核心步骤，它可以扩增目标质粒DNA。

PCR反应通常包括4个基本组分：DNA模板、引物、dNTPs和聚合酶。

PCR的参数设置包括反应体系、循环条件和温度梯度等。

温度程序一般包括3个步骤：变性、退火和延伸。

2.3 酶切和连接在PCR反应后，需要对扩增产物进行酶切和连接，以插入目标突变的DNA序列。

酶切方法可以选择约束酶切或独立酶切，要针对目标序列进行设计。

连接前需要进行充分的酶切酶消化来去除不被酶切的杂交产物，然后根据接头设计连接限制酶切的背景载体。

2.4 转化和筛选在连接完成后，需要将连接产物转化到宿主细胞中。

转化可以选择化学方法或电击法。

选取合适的宿主细胞进行转化后，可以通过筛选和鉴定来确定目标突变质粒。

三、实验方法下面以全质粒PCR点突变的实验方法为例，具体介绍一种常用的实验步骤。

3.1 材料准备1. 目标质粒DNA。

2. 引物：正向引物和反向引物，其中反向引物带有点突变。

3. PCR试剂盒：包括dNTPs、聚合酶等。

AOPE基因定点突变质粒的构建及qPCR鉴定

AOPE基因定点突变质粒的构建及qPCR鉴定作者：覃鸿妮谢钰珍杜雅馨来源：《科技风》2018年第31期摘要：随机选取5份待检测老年痴呆症的唾液标本，等量混合后提取基因组DNA并通过PCR扩增人第19号染色体上的载脂蛋白E（AOPE）基因，再与PMD19T质粒连接构建重组质粒，转入DH5α感受态细胞中。

经菌液PCR和测序鉴定为阳性的克隆抽取其质粒，以此重组质粒为模板通过PCR对AOPE基因的rs7421位点G突变为T，构建的突变质粒经qPCR鉴定，得到相应的荧光值，不同基因型的结果分成三类聚类图：CC型（野生纯合），CR型（杂合突变）和RR型（纯合突变），将得到的荧光数据值上传到生物信息数据库当中，以此为依据可以从AOPE基因层面上对待检测对象的阿尔茨海默病发病风险做出评估。

关键词：AOPE基因；定点突变；重组质粒；qPCR鉴定阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），又称老年痴呆，是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。

[1]临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。

[2]近十年内，大量研究显示，对AD 的防治虽已展现出良好的发展前景，并研发出许多有效药物。

但中国的情况不容乐观，中国有将近1000多万的AD患者，未来这一数字还将不断增加。

也正因為AD问题的严峻性，早期干预，早发现，早治疗对于延缓AD病情发展甚至治愈具有极大的重要性[2，3]。

影响患者患阿尔茨海默病风险的危险因素有很多，年龄占主要位置，患阿尔茨海默病的危险随着患者年龄的每增加五岁而增加一倍，且低受教育程度可明显增加该病患病风险。

[4]基因突变居于其后，第14号染色体上的早老素Ⅰ基因、第1号染色体上的早老素Ⅱ基因、第21号染色体上的淀粉样前体蛋白基因以及第19号染色体上的载脂蛋白E基因，是目前能够确定的突变基因，与遗传性阿尔茨海默病有关的突变基因为前三者，与发散性阿尔茨海默病有关的则为aopE4基因，是最强遗传性危险因素[5，6]。

质粒构建流程

质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。

3）4）选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000 Hl裂解液RL加入细胞中，混合5min。

2）加200 Hl氯仿混合，震荡15$,室温孵育3min。

3）4℃, 12000rpm 离心 10min。

4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550 H1）5）加入1倍体积（550 H1） 70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃, 10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500 Hl去蛋白液RE, 12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700 H l去漂洗液RW, 12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500 H l去漂洗液RW, 12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50 Hl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃, 12000rpm 离心 60s13）点样：5Hl RNA+ 1 H l 10X14）-20℃保存2. RNA反转录试剂盒： TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser （-20℃保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10Hl体系）② 5XgDNA eraser buffer 2Hl① gDNA eraser 1HlTotal RNA 4Hl （可根据RNA浓度调整）⑥ RNase free water 3HlPCR仪中进行，程序：42℃, 2min f4℃注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20Hl体系）④5XprimerScript buffer 2 4ul⑤primerScript RT enzyme mix I 1ul⑥RT primer mix 1ul⑦RNase free water 4ul1）反应液10 HlPCR 仪：37℃, 15min—85℃, 5s―4℃注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中-20℃长期保存3.PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50 Hl体系如下：5XPS buffer 10Hl PCR程序：dNTP 4Hl 95℃5minHl 95℃30sHl 56℃30s , 35cyclecDNA 1 H l（可变）72℃1minR-primer 1Hl 72℃10minF-primer 1 H l 注：可根据不同基因调节退货温度，延伸时点样：5Hl PCR 产物+ iHl 6X4.PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol（OMEGA bio-tek） D6293-01①②转移至HiBind MicroElution DNA柱（套收集管），室温离心10000g, imin。

环状质粒pcr构建定点突变序列

环状质粒pcr构建定点突变序列环状质粒PCR构建定点突变序列是分子生物学研究中常用的技术手段之一。

通过人为干预质粒结构，可以实现对目标基因的特定突变，从而进一步研究基因在生物体内的功能及调控机制。

本文旨在探讨环状质粒PCR构建定点突变序列的方法及应用，以期为相关研究提供参考。

一、环状质粒PCR构建定点突变序列的基本原理环状质粒PCR构建定点突变序列的基本原理是利用PCR技术在已有的环状质粒载体上引入特定的突变，从而改变载体上的目标基因序列。

该过程主要分为以下几个步骤：1.设计引物：首先需要设计能够引导PCR扩增特定基因片段的引物。

引物的设计要求准确，确保能够特异性地扩增目标基因序列。

2. PCR扩增：将设计好的引物与环状质粒载体中的目标基因DNA进行PCR扩增，得到包含突变的基因片段。

3.目的基因突变：通过引入特定的核苷酸序列，实现目标基因的定点突变。

突变可以是单个碱基改变，也可以是插入或缺失。

4.验证突变效果：最后需要进行测序验证，确保目标基因的突变已经成功引入，并且不会对其他基因产生不良影响。

二、环状质粒PCR构建定点突变序列的优势及应用环状质粒PCR构建定点突变序列相比传统的突变方法具有以下几点优势：1.操作简便：无需借助复杂的分子克隆技术，通过PCR扩增和突变酶的作用即可实现目标基因的突变。

2.高效率：PCR扩增技术可以迅速扩增目标基因序列，突变效率较高，能够快速得到大量突变体。

3.精准度高：通过引物设计和突变验证，可以保证突变的准确性和特异性，避免出现误突变。

环状质粒PCR构建定点突变序列在生物学研究中具有广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1.疾病模型：通过构建特定突变的基因，可以模拟某些疾病的发生机制，有助于疾病的研究和治疗。

2.基因功能研究：可以通过引入不同的突变体，研究基因在生物体内的功能及调控机制，揭示基因与表型的关系。

3.遗传改良：通过定点突变，可以改良植物、动物的遗传特性，实现育种的目的。

修饰组学点突变质粒构建

修饰组学点突变质粒构建在研究领域，大家常说“科学是个漫长的过程”，但在我看来，这句话的意思是“科学是一场持久战，考验的是耐心与毅力。

”今天咱们聊点儿有趣的——修饰组学点突变质粒构建。

别被这几个词吓到，咱们慢慢捋清楚，绝对让你瞬间明白是个啥意思。

说白了，它就是用一种高大上的方法，在实验室里研究基因怎么变、怎么转变、怎么活跃。

你可以把它想象成给基因换装，让它穿上新的“衣服”，然后看看它的表现如何。

你肯定会想，“怎么做到的？”呵呵，别急，咱这就开始给你讲一讲。

你得知道“质粒”是啥。

质粒其实就是一种细菌里的小小“工具箱”，它自带一堆基因信息，可以帮助细菌快速生产需要的物质。

科学家们聪明得很，发现质粒这个东西既然能在细菌里自如地“走来走去”，那也能让它变身成一种载体，帮忙运送某些基因到细胞里。

这时候的质粒就不单纯是个“小帮手”，它变成了科学实验中的“大明星”了。

不过，质粒要做“点突变”，可不简单。

你要理解，点突变就是在基因的某个地方做个小手脚。

就好像你平常打字时，不小心把“b”打成了“p”，这就是个突变——没啥大不了，效果差异小。

但要是让“b”变成了“x”，那可就麻烦了。

基因也是一样，哪里出点差错，可能就能让细胞的工作方式发生天翻地覆的变化。

这就要求科学家得精准地去改动，不能差一点点。

为了达到这个目的，首先你得有个“质粒载体”。

这种载体上有一堆小小的“插口”，你可以在这里插入新的基因，或者把原本的基因“修一修”。

听起来挺简单，实际上就像是给手机换个内存卡一样，你得找到对的插槽。

然后，再用一些工具，比如PCR扩增、酶切技术，把你想要的基因片段插进去。

好比你往盒子里装东西，得保证东西能完美fit进去，不然怎么盖上盖子？关键的步骤来了，那就是“点突变”了。

点突变的过程听起来有点像是神奇的魔法。

科学家会通过一种叫做“定点突变”的技术，改变质粒上的特定基因位置。

就像你想修个电路，得去准确地找到坏掉的那根电线。

你可以通过化学方法，或者使用一些叫做“引物”的小工具，把目标区域的基因给“换掉”，然后看看它会不会变得更厉害或者更弱。