DEAE Sephadex A-50使用说明
sephadex知识剖析
【操作步骤】
（1）A-50经酸碱处理，平衡至中性后，浸泡于0.1mol/L， pH7.4 PB中，置4℃冰箱储存备用。 （2）装柱：同DE52。 （3）平衡：松开出水口螺旋夹，以PB平衡，控制流速为 15滴/min，• 待洗脱液与流出液之pH值达到一致时，停止 平衡。 （4）加样、洗脱、收集与浓缩：基本上同DE52，以 0.1mol/L PB洗脱。 用过的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2HPO4洗 脱回收。洗至流出液中无蛋白（OD280nm<0.04）后再用 蒸馏水洗至中性，加入0.02％叠氮钠于4℃保存备用。
Sephadex系统知识
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶系列是当今生物大 分子分离、提取、纯化的重要分离材料， 按性能分包括 凝胶过滤、 离子交换、 疏水层析、 亲和层析，
主要用于蛋白质、核酸、多肽、多糖、酶的脱盐 与分离纯化中。 葡聚糖凝胶为葡聚糖和环氧氯丙烷交联而成的 珠状产品，化学性能稳定，在潮湿、中型ph、高 压120度，灭菌30min情况下，不影响色谱性能， 适用于柱色谱操作。用于蛋白质脱盐及不同分子 量蛋白在凝胶分离范围内的分离纯化，可在酶、 多糖、核酸和其它生物大分子的纯化中广泛应用。
葡聚糖凝胶LH
用途：分离水不溶物质。 葡聚糖凝胶LH-20/Sephadex LH-20 分离中 等大小生物分子，球蛋白分离范围100～ 4000 葡聚糖凝胶LH-60/Sephadex LH-60 分离 100～20000
葡聚糖凝胶C阳离子交换剂，吸附碱 性蛋白：
羧甲基葡聚糖凝胶C-25/CM葡聚糖凝胶C-25/CM Sephades C-25 应用：MW＞20000；载量4-5mmol/g 羧甲基葡聚凝胶C-50/CM葡聚糖凝胶C-50/CM Sephades C-50 应用：中等大小生物分子（30－200KD）；载量45mmol/g SP葡聚糖凝胶C-25/SP Sephades C-25 应用：MW>200 KD；载量：2.0-2.6mmol/g SP葡聚糖凝胶C-50/SP Sephades C-50 应用：中等大小 生物分子（30－200KD）；载量：2.0-2.6mmol/g
鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定
鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定目的探讨可溶性Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)的提纯方法。
方法以雏鸡胸软骨为原材料,酸性条件下经胃蛋白酶消化,离心后,应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析,透析,盐析,得到纯化的CⅡ。
结果自提的CⅡ样品与CⅡ标准品采用SDS-PAGE电泳显示条带一致。
结论本法提纯CⅡ具有材料丰富,操作简便,重复性好等优点。
标签：Ⅱ型胶原蛋白提取纯化胶原蛋白是结缔组织的重要成分之一,分20余种,其中CⅡ主要存在于软骨基质,占软骨干重的一半以上,研究表明类风湿关节炎(RA)的发病与CⅡ的自身免疫反应有关,国内外均于口服CⅡ诱导免疫耐受治疗RA的相关报道[1～3],该方法有可能成为安全、简便、有效的新型治疗方法。
因此,CⅡ的提纯是我们研究此方法的重要前提,目前国内外文献的报道中多采用盐酸胍来粗提胶原蛋白[4～5],盐酸胍是一种蛋白质变性剂且有一定的毒性,如果在提纯的过程中不能被完全清除,在一定程度上会限制CⅡ的临床应用。
本试验参照Trentham[6]及Miller[7]等方法,用胃蛋白酶法提取,操作简便,重复性好,且提取的CⅡ安全性大。
1临床资料1.1一般资料鸡胸软骨:取材于孵化场17d的雏鸡。
CⅡ:Sigma公司(来源于鸡),5mg/瓶。
1.2主要仪器离心机(日立高速冷冻离心机);层析柜(LKB2023,BROMMA minicoldlab)。
1.3主要试剂胃蛋白酶(Sigma 5g/瓶);DEAE-Sephadex A 50(Amersham);Tris(sigma 100g/瓶)。
1.4CⅡ的粗提将新鲜干净的鸡胸软骨捣碎成糊状,用缓冲液和蒸馏水分别洗涤2遍,然后将其悬浮于0.5mol/L的醋酸中(调pH为2.5),加入胃蛋白酶,4℃下消化72h,低温离心,取上清液-20℃保存。
沉淀物再次悬浮于0.5mol/L醋酸中,同样条件下胃蛋白酶重复消化,离心2次。
将3次上清液混匀,用pH7.6,0.05mol/L Tris-Hcl,0.2mol/LNaCl 溶液充分透析。
多糖的纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握多糖纯化的基本原理和方法。
2. 学习并运用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。
3. 通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。
二、实验原理多糖是一类重要的生物大分子，具有广泛的生物活性。
然而，天然多糖往往伴随着一些蛋白质、脂肪和色素等杂质，这些杂质会干扰多糖的结构鉴定和活性分析。
因此，对多糖进行纯化是研究多糖生物活性的关键步骤。
多糖的纯化主要包括以下步骤：1. 提取：采用热水浸提法或超声波辅助提取法等从植物、动物或微生物中提取多糖。
2. 净化：去除提取液中的蛋白质、脂肪和色素等杂质。
3. 纯化：利用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。
4. 测定：通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。
三、实验材料1. 实验药品：DEAE-Sephadex A-50柱层析材料、氨水、盐酸、无水乙醇、葡萄糖标准品等。
2. 实验仪器：层析柱、紫外可见分光光度计、离心机、移液器、容量瓶等。
四、实验方法1. 提取：称取一定量的多糖样品，加入适量蒸馏水，用超声波辅助提取法提取多糖。
提取液离心分离，取上清液作为待纯化样品。
2. 净化：将待纯化样品加入适量的氨水，调节pH值至7.0，静置一段时间。
离心分离，取上清液作为待纯化样品。
3. 纯化：将DEAE-Sephadex A-50柱层析材料预处理后，装入层析柱。
将待纯化样品上柱，用蒸馏水进行梯度洗脱。
收集洗脱液，利用紫外可见分光光度计检测洗脱液中的多糖含量。
4. 测定：配制葡萄糖标准溶液，绘制标准曲线。
将纯化后的多糖样品按照比色法进行测定，计算纯化前后多糖的浓度。
五、实验结果1. 提取：超声波辅助提取法提取多糖，提取率约为70%。
2. 净化：氨水处理去除蛋白质、脂肪和色素等杂质，纯化率约为90%。
3. 纯化：DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化，纯化率约为95%。
4. 测定：纯化前后多糖浓度分别为1.5 mg/mL和0.7 mg/mL，纯化效果良好。
DEAE sephadex A50
DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白撰稿欧阳笑梅原理试剂和器材操作步骤注意事项(一) 原理DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。
用NaOH将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。
血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。
在PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。
因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。
DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种。
(二)试剂和器材1、试剂:(1)盐析提取的人γ球蛋白；(2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3；(3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)；(4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分)；2、器材:(1)层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)；(2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度计，电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计；(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸；(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。
(三) 操作步骤1、DEAE-Sephadex A-50预处理称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克，悬于500ml蒸馏水，1小时后倾去上层细粒。
按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次。
处理完后，将A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中过夜。
植物多糖分离纯化方案
多糖提取物 的分离纯化
在多糖提取物中，常会有无机盐、蛋白质、色 素及小分子物质等杂质，必须分别除去．一般 是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级 ．
? . 除蛋白
? 蛋白的分离方法较多，如Sevag法、三氯乙酸沉淀法、ZnS04沉淀法、酶法等。 Sevag法为实验常用法，谚法以正丁醇与氯仿按4：l混合，再行革取。蛋白酶除蛋 白是目前认为较好方法，将蛋白水解，再透析除去。
取上清， 70°C减压浓缩 加3倍体积95％ 乙醇沉淀，至醇含量在 80％以上，不断搅拌
离心收集沉淀，将沉淀置于布氏漏斗中，分别用无水甲醇、丙醇和乙 醚洗涤，以除去水分和杂质 冷冻干燥，得粗多糖
多糖不同的植物中，有着不同的含量和 贮存位置，因此针对不同的植物有着不 同的分离方法。
溶剂提取法 水提 法
? 按图 2 所示 流程对 CGP 进行分离纯化。DEAE Cellulose 装柱 (1.6 cm×40 cm),0.02 mol/L PBS 平衡后上样 CGP 30 mg,进行洗脱收集。 流速 1.0 mL/min,每 10 min 收集一管;用过的 DEAE Sephadex A-50 柱经 再生处理后用 0.02 mol/L PBS 平衡,完毕后上样 CGP-c1 10 mg, 进一步分离纯化,流速 0.2 mL/ min,每 15 min 收集一管。
凝胶色谱法鉴定纯度
多糖取2mg溶于水，上Sephadex G一200(15 mm X 80 cm)凝胶柱层析 ，以蒸馏水洗脱，体积流量l ml／10 min，按2ml每管分部收集，洗脱液 用0．1％蒽酮一硫酸法显色，紫外测定吸光度值，依吸光度对洗脱液体 积作图。
纸色谱 (PC)初步结构鉴定
酸水解：称取l0mg多糖RP置25 ml具塞试管中，加入6％硫酸3ml，封管，在 120°C烘箱中水解6 h，用CaCO3 中和至中性，过滤，用蒸馏水洗涤滤渣3～4次 ，每次3～5ml，滤液浓缩后点样于层析纸，并用标准单糖葡萄糖、D一半乳糖、D 一阿拉伯糖、D一木糖、D一甘露糖作对照，展开剂为乙酸乙酯一啶．冰乙酸．水 (5：5：1：2)，显色剂为苯胺．邻苯二甲酸，在1l0 喷雾显色10 min。
DEAE sephrose FF说明及使用
DEAE琼脂糖凝胶FF的详细资料：英文名称：DEAE Sepharose FFCAS号：57407-08-6级别：BR凝胶类型：离子交换填料，弱碱型结构成分：6%交联琼脂糖粒径： 45-165μm配基基团：diethylaminoethyl （二乙氨乙基）蛋白质吸附量：110mgHSA/ml凝胶总离子交换量：0.11-0.16mmol/ml凝胶交换载量：3.1mg Thyroglobulin/ml drained medium；110 mg HSA/ml drained medium；100mg α-lactalbumin/ml drained medium流速：300~600 cm/h;最大流速750 cm/h工作PH值：2-9工作温度：4-40℃PH稳定性：1~14 (短时间,在位清洗);2~12 (长时间）耐压：0.3MPa性状：白色微球,凝胶状、含20%乙醇，底部为乳白色胶体用途：生化研究、适用于各种带负性电荷生物大分子的浓缩纯化等、利用离子交换作用，应用于蛋白等生物分子的快流速高产量纯化等保存：2～8℃包装：100毫升/瓶，500毫升/瓶、1升/瓶等离子交换层析分离蛋白质【实验目的】通过分离蚓激酶的实验，学习和掌握离子交换层析法的工作原理和离子交换介质的选择；了解离子交换树脂的处理及转型；学习该实验方法的筛选和基本操作技术。
【实验原理】离子交换层析是一种吸附层析，利用不同蛋白质表面电荷的差异而达到分离、纯化蛋白质的目的。
阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电,因此这种交换剂可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应；阳离子交换剂则反之。
【实验材料】0.05M Tris-HCl pH7.5、1M NaCl 0.05M Tris-HCl pH7.5、蚓激酶粗提物、20%乙醇、1MNaOH、DEAE-Sepharose Fast Flow柱、AKTA purifier 液谱纯化系统、高速离心机、电子天平、试管、一次性滤器、2ml注射器、2ml Eppendorf管、冲洗瓶、玻璃滤器【实验方法】1离子交换介质：选用Hitrap DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析柱。
DEAE_sephadex处理方法
(一) 原理DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂.用NaOH将CL-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白.血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白.在PH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附.因此,通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG.DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种.(二)试剂和器材1、试剂:(1)盐析提取的人γ球蛋白;(2)0.5N NaOH,0.5N HCl 2M NaCl,10%NaN3;(3)DEAE-Sephadex A-50,聚乙二醇(PEG);(4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分);2、器材:(1)层析玻璃柱(1.3*40cm),滴定铁架,自由夹,螺旋夹,尼龙纱(200目);(2)普通冰箱,751桮型紫外分光光度计,电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶),PH计;(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸;(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等.(三) 操作步骤1、DEAE-Sephadex A-50预处理称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克,悬于500ml蒸馏水,1小时后倾去上层细粒.按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例,将A-50浸泡于0.5N NaOH中,搅匀,静置30分钟,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性;再以0.5N HCl同上操作过程处理,最后以0.5N NaOH再处理一次.处理完后,将A-50浸泡于0.1M,PH 7.4 PB中过夜.2、装柱(1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上,柱底垫一园尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关.(2)将0.1M,PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50.待A-50凝胶沉降2-3cm厚时,启开出水口螺旋夹,控制流速1ml/分钟,同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度.(3)关闭出水口,待A-50凝胶完全沉降后,柱面放一园形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口,通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接.3、平衡:启开出水口螺旋夹,控制流速12-14滴/分钟,使约2倍床体积的洗脱液流出.并以PH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同.达到一致时关闭出水口,停止平衡.4、加样及洗脱:启开上口橡皮塞及下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积的2%,蛋白浓度以<100mg为宜).松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内,至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2-3次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数ml洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统.并控制流速12~14滴/分钟.5. 收集:开始洗脱的同时就以试管进行收集.每管收集3~5ml.共收集10~15管.6. 测蛋白:以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm,与OD260nm,按前述公式计算各管蛋白含量.并以OD280nm为纵座标,以试管编号为横座标,绘制洗脱曲线.7. 合并、浓缩:将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以PEG(MW6000)洗缩至所需体积,加入0.02%NaN3防腐剂,于4℃保存备用.8. A-50凝胶的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐.然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达再生.近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时,以无水酒精洗2次,再置50℃温箱烘干,装瓶内保存.(四) 注意事项1. 柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就得获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低.柱的直径增加,使液体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降.2. 纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度.样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析.3. 所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装.4. 洗脱过程中应严格控制流速,且勿过快.5. 上样的体积要小,浓度不宜过高.6. 加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干.。
DEAE凝胶使用说明
DEAE凝胶使用说明1.准备工作：-检查DEAE凝胶的质量：确保没有受到严重污染或老化，外观应为均匀的白色颗粒。
-确保实验室内的仪器和设备已经彻底清洁，并消毒所需的器具。
-准备所需的缓冲液和其他试剂，确保其符合实验目的和DEAE凝胶的使用要求。
2.DEAE凝胶的预处理：-使用1M氢氧化钠（NaOH）溶液将DEAE凝胶悬浊液平衡至碱性条件，通常使用10倍体积的溶液。
-在室温或较高温度下（取决于溶液性质），搅拌凝胶膏悬浊液约30分钟。
-通过过滤或离心凝胶悬浊液，将其与清洁的缓冲液或水相分离。
3.DEAE凝胶的装填：-将经过预处理的DEAE凝胶放入柱子中，确保填充均匀。
-起初，可以使用较低的流速将缓冲液通过凝胶柱，以避免凝胶的移位或破碎。
4.样品应用：-将待分离的样品溶解在适当的缓冲液中，并使用适当的浓度和pH值进行预处理。
-以缓慢的速度将样品注入DEAE凝胶柱中，以避免柱床破碎并确保样品均匀分布。
5.洗脱和洗涤：-使用适当的缓冲液进行柱洗脱，以清除非目标分子和其他杂质。
-可使用梯度洗脱，逐渐增加盐浓度或改变缓冲液的pH值，以逐步洗脱需纯化的目标分子。
-可使用电镜、紫外吸收光谱等方法监测样品的洗脱效果。
6.贮存和保养：-分离纯化后的目标物质，根据其特性选择适当的储存条件，并确保它们的稳定性和活性。
-要洗涤和存储DEAE凝胶柱，使用适当的缓冲液，并跟随厂家提供的建议来保持柱子的良好状态。
1.DEAE凝胶在潮湿环境中易吸湿结块，因此应储存在干燥的环境中，并避免接触水分。
2.在使用DEAE凝胶前，应仔细阅读和遵守产品厂家提供的操作手册和说明。
3.使用适当的防护设备，如手套和实验室外套，以避免对身体造成伤害。
4.避免直接接触凝胶材料，以免发生过敏或刺激。
5.处理使用过的DEAE凝胶时，遵循有关废弃物处理的当地法规。
DEAE凝胶是一种常用的分离纯化工具，但其使用需要严格控制各个步骤和条件。
正确使用和操作DEAE凝胶可以提高实验结果的可靠性和重复性，并提高样品纯度。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
膜的分离过程
时间的延长而逐渐降低，膜外观厚度减少， 膜由半透明变为透明。
影响因素：操作压力和温度。
2.膜的水解作用 醋酸纤维素是有机酯类化合物，比较容
易水解，水解的结果是乙酰基脱掉。 实际操作中，可控制进液pH和进料温度。
3.膜的浓差极化 • 在膜分离过程中，膜表面上溶质浓度高于主体溶质浓度的现象。如下图：
冲液中，用离心法除去杂质，收集上清液准备上柱。
操作步骤
• 先把DEAE-Sephadex A-50装入3×40厘米的柱中，用pH值为7.6、2.5微摩尔／升的缓冲液上柱，等 流出液的pH值为7.6时，然后将样品上柱，用pH值7.6、2.5微摩尔／升～50微摩尔／升的缓冲液进行 梯度洗脱(洗脱液浓度从2.5微摩尔／升开始逐渐加大至最终浓度达50微摩尔／升，这样便形成一个洗脱 梯度)，收集具有SOD的活性峰。
Millipore公司板式膜分离器（实验室用）
中空纤维膜分离器（工业用）
卷式膜分离器（工业用）
思考题
1. 何谓膜分离？主要有那几种膜分离方法？ 2. 膜在结构上可分为那几种？膜材料主要用什么？ 3.简述微滤、超滤膜、反渗透膜在膜材料、结构、性 能、分离机理及其应用等方面的异同点 3.膜分离的表征参数有那些？何谓膜截留分子量？ 4.何谓浓差极化现象？它是如何影响膜分离的？减少 浓差极化现象的措施？ 5.膜的清洗及保存方法有那几种？ 6.膜分离设备按膜组件形式可分为几种？相比较的优 缺点？
盐溶液 反渗透
2. 反渗透（reverse osmosis） • 在膜的两边造成一个压力差，并使其大于 渗透压，就会发生溶剂倒流，使浓度较高的 溶液进一步浓缩。 3. 超滤（ultrafiltration） • 按粒径选择分离溶液中所含的微粒和大分 子的膜分离操作； • 膜只阻挡大分子，大分子的渗透压不明显。
sephadex知识
【操作步骤】
（1）A-50的预处理：称取4～6g A-50悬浮于 500～1000ml蒸馏水中，1h后倾去上层细粒。然 后将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液（60～100ml） 中，搅拌后静置30min，• 以蒸馏水洗至中性，再 用0.• 1mol/L NaH2PO4同上操作过程处理• ，蒸馏 水洗至中性。最后用0.01mol/L，pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（PB）平衡，减压 抽干，保存备用。
（2）吸附提取：取15ml血清加等量0.01mol/L， pH6.5 PB稀释至30ml（也可不稀释• ），加入1/4 体积滤干的DEAE-Sephadex A-50（相当于干重 1g）混合。室温（或4℃）浸泡• 1 h后过滤，收 集滤液。再加入同样体积的DEAE-Sephadex A50重复上述处理过程共• 3次，亦可在血清内加入 过量DEAE-Sephadex A-50吸附处理一次。收集 滤液合并，• 即为提纯的IgG制品。或再透析去盐， 浓缩、冻干保存备用。
DEAE-Sephadex A-50提取法纯化 多克隆抗体
DEAE-Sephadex A-50（简称A-50）为弱 碱性阴离子交换剂，经过NaOH处理将Cl型转为OH-型后，可吸附酸性蛋白。γ1球蛋 白属中性蛋白，等电点为pH6.85～7.5，其 余均属酸性蛋白。在溶液为pH8.0时，酸性 蛋白均被A-50 吸附。从而可分离纯化IgG。
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葡聚糖凝胶QAE-A阴离子交换剂， 吸附酸性蛋白：
葡聚糖凝胶QAE-A25/QAE Sephades A-25 应用： MW>200 KD；载量2.6-3.4mmol/g 葡聚糖凝胶QAE-A50/QAE Sephades A-50 应用： 中等大小生物分子（30-200KD）；载量2.63.4mmol/g DEAE葡聚糖凝胶A-25/DEAE SephadexA-25 应 用：MW>200 KD；载量3-4mmol/g DEAE葡聚糖凝胶A-50/DEAE Sephadex A-50 应 用：中等大小生物分子（30-200KD）；载量34mmol/g
(完整版)DEAEsephroseFF说明及使用
DEAE琼脂糖凝胶FF的详细资料：英文名称：DEAE Sepharose FFCAS号：57407-08-6级别：BR凝胶类型：离子交换填料，弱碱型结构成分：6%交联琼脂糖粒径： 45-165μm配基基团：diethylaminoethyl （二乙氨乙基）蛋白质吸附量：110mgHSA/ml凝胶总离子交换量：0.11-0.16mmol/ml凝胶交换载量：3.1mg Thyroglobulin/ml drained medium；110 mg HSA/ml drained medium；100mg α-lactalbumin/ml drained medium流速：300~600 cm/h;最大流速750 cm/h工作PH值：2-9工作温度：4-40℃PH稳定性：1~14 (短时间,在位清洗);2~12 (长时间）耐压：0.3MPa性状：白色微球,凝胶状、含20%乙醇，底部为乳白色胶体用途：生化研究、适用于各种带负性电荷生物大分子的浓缩纯化等、利用离子交换作用，应用于蛋白等生物分子的快流速高产量纯化等保存：2～8℃包装：100毫升/瓶，500毫升/瓶、1升/瓶等离子交换层析分离蛋白质【实验目的】通过分离蚓激酶的实验，学习和掌握离子交换层析法的工作原理和离子交换介质的选择；了解离子交换树脂的处理及转型；学习该实验方法的筛选和基本操作技术。
【实验原理】离子交换层析是一种吸附层析，利用不同蛋白质表面电荷的差异而达到分离、纯化蛋白质的目的。
阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电,因此这种交换剂可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应；阳离子交换剂则反之。
【实验材料】0.05M Tris-HCl pH7.5、1M NaCl 0.05M Tris-HCl pH7.5、蚓激酶粗提物、20%乙醇、1MNaOH、DEAE-Sepharose Fast Flow柱、AKTA purifier 液谱纯化系统、高速离心机、电子天平、试管、一次性滤器、2ml注射器、2ml Eppendorf管、冲洗瓶、玻璃滤器【实验方法】1离子交换介质：选用Hitrap DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析柱。
DEAE葡聚糖凝胶A-50
DEAE 葡聚糖凝胶 A-50DEAE-葡聚糖凝胶A-50是将二乙胺基乙基键合在葡聚糖凝胶上形成的一种弱阴离子交换介质。
广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。
1.外观本品呈白色，球状、无嗅、无味干燥粉末。
2.理化指标3．包装产品以试剂瓶密封包装，外贴标签，注明“品名、质量、颗粒大小”等内容。
4．运输运输中应避免日晒、雨淋、重压，严禁与有毒、有害物品混运。
5．贮存产品应密封贮存在室温，通风、干燥、清洁的地方。
6.注意事项本产品避免与氧化剂接触；避免在pH值< 4时长时间暴露(一周,20℃)。
7.保质期：2年。
8.使用方法：8.1 溶胀充分溶胀需要在室温1-2天或者在100 °C沸水中煮1个小时，一般在沸水中几分钟即可溶胀。
在高温中膨胀可以去除凝胶中的气泡。
溶胀过程中应充分搅拌。
8.2 装柱⑴让所有的材料和试剂达到室温。
配制初始缓冲液（平衡液）和洗脱缓冲液。
⑵根据柱子大小取所需量的凝胶，用初始缓冲液（按凝胶：缓冲液=3：1的比例）配成匀浆。
匀浆作脱气处理。
⑶将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。
⑷用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。
打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。
⑸打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。
用2~3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。
8.3平衡让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。
平衡液是低浓度的缓冲溶液，如Tris 、PBS等。
8.4上样⑴样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心和过滤后上样。
盐浓度太大的样品处理后再配。
⑵一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。
⑶介质对样品组分吸附的程度取决于样品的带电性质、流动相的离子强度和pH值。
盐浓度小，介质对样品组分吸附较牢。
用DEAE介质时，推荐的pH值是大于目标产品等电点1个单位。
蛋白质的离子交换层析
蛋白质的离子交换层析发布日期：2009-10-15 来源：生技网信息中心浏览次数：175离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
（一）原理在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。
如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。
在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。
当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。
纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。
反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。
溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。
反之则越少。
血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。
在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。
由于各种蛋白质所带的电荷不同。
它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。
交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。
DEAE-sepharoseFF说明书准确翻译版
离子交换柱说明书翻译目录1. 简介2. 所需材料3. 处理填料4. 组装柱子5. 填料装柱6. 平衡7. 样品处理8. 操作流速9. 吸附10. 洗脱11. 再生12. 在位清洗（CIP）13. 清洁14. 保存附录A附录B附录C15. 订货须知1. 简介CM Sepharose Fast Flow, DEAE Sepharose Fast Flow, Q Sepharose Fast Flow和SP Sepharose Fast FloW这些都是离子交换色谱的填料，高效且具有优良的流动性能。
以下说明以在推荐柱子XK 16/20 中填充填料为例，不同尺寸的柱子请参考“附录A”修改填柱方案。
Sepharose FF填料也可以装在Tricorn 高性能层析柱中。
请阅读并遵循装柱指示手册。
技巧详情请翻阅"Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing: Principles and Methods"2. 所需材料填料、柱子、泵、梯度混合器、进样阀、量筒、烧杯、真空瓶、注射器、玻璃棒、缓冲液填料缓冲液应与初始缓冲液相同，缓冲液推荐见附录 C 中的表 2 和表3。
装柱时应避免使用高粘度的缓冲液，若使用，则需降低流速。
3. 处理填料1) 所有材料至室温2) 倾倒填料，洗掉存储液，替换为缓冲液，配成的匀浆总体积为32.5ml(75%的填料，25%的缓冲液)注意：Sepharose Fast FloW离交柱CM, DEAE 和Q存储在20%的酒精中，SP Sepharose Fast Flow存储在20%的乙醇和0.2M的醋酸钠中3) 给匀浆脱气4. 组装柱子1) 装柱前确保每个组件完好无损，特别是网2) 柱底连接注射器或者泵3) 柱底浸没在缓冲液，用泵或注射器将缓冲液润洗整柱体，确保装柱无气泡4) 塞上出口，装上柱底5) 用缓冲液冲洗柱子，使柱底保持一小段液位，并保持柱垂直5. 填料装柱以下说明以XK 16/20 柱为例，不同尺寸的柱子请参考“附录A”。
DEAE凝胶使用说明
D E A E凝胶使用说明(总3页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除DEAE-琼脂糖凝胶FF产品说明书DEAE-琼脂糖凝胶FF是将二乙胺基乙基键合在快流速琼脂糖凝胶上形成的一种弱阴离子交换介质。
广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。
1. 外观本品呈白色，球状、无嗅、无味、无肉眼可见杂质。
2. 理化指标项目指标离子交换基团-O-CH2CH2-N+（C2H5）2H离子交换类型弱阴离子，可交换离子Cl-基质6%交联琼脂糖蛋白质吸附容量110mgHSA/ml介质总离子交换容量~ mmol/ml 介质形状球形粒径45~165 μm流速*300~600 cm/h；最大流速750 cm/h工作温度4~40℃耐热pH7水中120℃30min耐压MPapH稳定性1~14 （短时间,在位清洗）;2~12 （长时间）pH工作范围2~9化学稳定性在以下液体中稳定：所有常用的水相缓冲液；1mol/L 氢氧化钠；8mol/L 尿素；6mol/L 盐酸胍；70% 乙醇*检测条件：层析柱10mm×300mm *柱床高15cm,25℃, 流动相为LNaCl 3．包装产品以聚胺酯瓶密封包装，外贴标签，注明“品名、体积、颗粒大小”等内容。
4．运输运输中应避免日晒、雨淋、重压，严禁与有毒、有害物品混运。
5．贮存产品应密封贮存在4℃~25℃（保存溶液为20% 乙醇），通风、干燥、清洁的地方。
不能冷冻。
用过的柱子贮存在4℃（20% 乙醇）。
6.注意事项本产品避免与氧化剂接触；避免在pH值< 4时长时间暴露（一周,20℃）。
7.保质期：5年。
8.应用本产品具有高化学稳定性、高流速、高载量、好的机械性能、可在位清洗、多次重复使用等特点，非特异性吸附低，回收率高，适用于工业规模生产，适用于在pH工作范围内可形成负离子的生物大分子的分离纯化，广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。
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DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白
原理
试剂和器材
操作步骤
注意事项
(一) 原理
DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。
用NaOH将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。
血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。
在PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。
因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。
DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种。
(二)试剂和器材
1、试剂:
(1)盐析提取的人γ球蛋白；
(2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3；
(3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)；
(4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分)；
2、器材:
(1)层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)；
(2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度计，电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计；
(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸；
(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。
(三) 操作步骤
1、DEAE-Sephadex A-50预处理
称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克，悬于500ml蒸馏水，1小时后倾去上层细粒。
按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次。
处理完后，将A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB 中过夜。
2、装柱
(1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
(2)将0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。
待A-50凝胶沉降2-3cm厚时，启开出水口螺旋夹，控制流速1ml/分钟，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
(3)关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一园形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3、平衡:启开出水口螺旋夹，控制流速12-14滴/分钟，使约2倍床体积的洗脱液流出。
并以PH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同。
达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4、加样及洗脱:
启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积的2％，蛋白浓度以<100mg为宜)。
松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2-3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数ml洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。
并控制流速12～14滴／分钟。
5.收集：开始洗脱的同时就以试管进行收集。
每管收集3～5ml。
共收集10～15管。
6.测蛋白：以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm，与OD260nm，按前述公式计算各管蛋白含量。
并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。
7.合并、浓缩：将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG(MW6000)洗缩至所需体积，加入0.02％NaN３防腐剂，于4℃保存备用。
8.A-50凝胶的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。
然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达再生。
近期用时泡于洗脱缓冲液中４℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
(四) 注意事项
1.柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就得获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。
柱的直径增加，使液体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
2.纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度。
样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。
3.所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。
4.洗脱过程中应严格控制流速，且勿过快。
5.上样的体积要小，浓度不宜过高。
6.加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。