实验1拟南芥室内培养观察与农杆菌转化拟南芥

合集下载

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。

2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。

1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。

3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。

28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。

用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。

转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。

4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。

（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。

2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。

3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。

4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。

5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。

花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。

农杆菌侵染拟南芥花序的转化

农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。

2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。

3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。

4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。

一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。

4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。

5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。

6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。

7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。

转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。

Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。

农杆菌转化拟南芥

农杆菌转化拟南芥1．农杆菌感受态制备①从YEB平板培养基上挑取农杆菌单克隆，接种于5 mL YEB （含50µg/mL 利福平）液体培养基中，28ºC，200 rpm，过夜培养；②取2 mL过夜培养液接种于50 mL上述含有利福平的YEB液体培养基中，28ºC，200 rpm，摇床培养至OD达到0.5；③菌液冰浴30 min，转至预冷的50 mL离心管中，4ºC，5000 rpm，离心10 min，收集菌体；④ 2 mL预冷的50 mM 无菌CaCl2溶液（含15%甘油）悬浮菌体，即为感受态细胞；以100 µl/管分装，液氮速冻后，保存于-70ºC冰箱，备用。

2．质粒转化农杆菌感受态①吸取构建好的表达载体质粒5 µl，加入到100 µl感受态细胞中，混匀；②冰浴30 min，液氮冷冻5 min，37ºC热击5 min；③加入800 µl YEB液体培养基，28ºC，200 rpm，摇床培养5 h；④离心，留200 µl上清重悬沉淀，将菌液涂于YEB固体培养基（含质粒对应的抗生素），28ºC培养2 d，挑取单克隆，检测筛选阳性克隆，摇菌后-70ºC保存，用于下一步植物转化。

3．农杆菌侵染拟南芥花序①将筛选的阳性农杆菌在YEB（抗生素）固体培养基划板培养，至长出单克隆后挑3-5个单克隆，于5 mL YEB（抗生素）液体培养基中，28ºC，200 rpm培养16 h，（以培养基变得很浑浊为准），保菌之后全部接到250-500 mL的培养基中，培养16 h以上；②5000 rpm离心20分钟，然后用转化液（1/2MS（只用大量和微量元素），添加50 g/L的蔗糖，调pH为5.8左右，然后加200 ul/L的Silwet L-77混合），剧烈悬浮沉淀至完全悬起；③在拟南芥盛花期，将悬浮液直接浸泡地上部分约1分钟，然后用保鲜膜完全包裹以保湿，放回培养室12小时以上打开保鲜膜；④待种子成熟后（半个月左右），收取种子用于下一步筛选工作。

拟南芥

拟南芥种植花序浸染法转化拟南芥（1）种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1：1/2）作为拟南芥种植土壤。

直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗。

播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。

（2）去顶：在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。

适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。

（3）配制浸染液：在5%的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD=0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。

100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆（9cm）植株。

在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05%（500ul/L），如果产生表面活性剂的毒性现象（浸过部分发黄或死亡），将浓度降至0.02%。

（4）浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中2-3s，同时轻轻旋转。

（5）暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。

（6）浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。

（7）种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。

（8）转基因种子筛选：在含有Kan抗生素的平板上培养浸染后所得种子。

40mg的种子大约200颗于含kan 10-50μg/ml 的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。

根据生长状况判断是否为转基因种子。

成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。

非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。

（9）转基因植株转土栽培。

转基因种子在MS+kan平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。

转基因拟南芥纯合子筛选由于农杆菌介导的花序浸染法只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为后续生理性状实验需要，将T0代转基因种子培育至T2代，利用抗性筛选得到纯合子。

根据杂合子在发生性状分离时会产生野生型后代，而野生型种子不能在MS+Kanr（50μg/ml）平板上正常生长，进行转基因植株纯合子的筛选。

拟南芥培养及遗传转化

拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。

二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。

三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。

⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。

⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。

在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。

⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。

当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。

表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。

然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。

②调节PH至5.7~5.8。

表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。

拟南芥转基因实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。

2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。

3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。

二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。

转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。

本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。

实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。

2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。

4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。

三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。

将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。

将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。

将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

农杆菌介导植物的遗传转化实验报告

农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。

通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。

实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。

实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。

同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。

结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。

拟南芥遗传转化实验报告

一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。

二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。

2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。

3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。

4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。

5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。

四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。

2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。

3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。

4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。

5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。

五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。

2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。

拟南芥的种植,转化和筛选

拟南芥的种植，转化和筛选1 拟南芥的种植试剂配制人工土：3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合PNS营养液：每升含5ml 1M KNO3，2ml 1M Ca(NO3)2˙4H2O，2ml 1M MgSO4˙7H2O，2.5ml 20mM Fe.EDTA，2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），1ml MS 微量元素。

PNS营养液母液配方①1M KNO3101.1g②1M Ca(NO3)2˙4H2O 236.15 g③1M MgSO4˙7H2O，246.48 g ④20mM Fe.EDTA：FeSO45.57g EDTA 7.45g注意先各自配成溶液，在混合。

⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：磷酸二氢钾 130.4g磷酸氢二钾 9.12g⑥MS 微量元素硼酸 0.434g硫酸锰（MnSO4 H2O） 1.7626gCuSO4˙H2O 0.0798gZnSO4˙7H2O 0.172gNaMoO4˙2H2O 0.0432gNaCl 0.585gCoCl˙6H2O 0.00129g以上母液均配至1L种植步骤将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。

两天后光照，三天后揭膜。

人工培养室条件：相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8 h黑暗﹑16 h光照培养。

2 拟南芥的转化试剂配制渗透培养基（一升中）：1/2xMurashige-Skoog；5% 蔗糖；0.5克 MES；用KOH 调至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA 母液；200微升Silwet L-77）注意：6-BA 母液配制时用乙醇溶解。

1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本组分配制，但大量元素减半。

另：经转化的拟南芥，种子收获后需在相应的抗性平板上筛选转化子转化步骤(1) 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。

拟南芥转化

拟南芥的遗传转化（花序浸泡法）
1.培养基
YEP培养基：蛋白胨10g/L 酵母提取物10g/L
NaCl 5g/L 固体琼脂粉15g/L
2.拟南芥材料
培养拟南芥直到它们开始抽苔并产生花序（为了让植株产生更多不成熟的花序，需要推迟转化实验，将抽出的第一个苔剪去，以便于莲花座上腋芽分化出的第二花序的增值）。

3.拟南芥的遗传转化
1)含有目的基因的双元载体转化农杆菌，并接种当菌斑到5ml含有
适当抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天。

2)再将这一培养基内注入500ml带有适当抗生素的YEP液体培养
基，并在28℃条件下培养16-24小时，使用生长达到稳定期的细胞（OD=1.0-1.6）
3)室温下4000rpm离心10分钟，收集农杆菌细胞，然后加入新制的
5%蔗糖，轻轻悬浮细胞，使OD =0.6-0.8
加入Silwet L-77至浓度0.05%，立刻混匀。

将农杆菌悬浮细胞转移到大的平皿中，用于侵染。

注：Silwet L-77可能有毒，腰带手套保护皮肤。

4)倾斜植株，使所有的花序都浸泡在农杆菌溶液中，浸泡时间1.5-2
分钟，取出后轻轻煽动10秒，控干3-5秒，将植株横放，暗处培养16小时，再恢复光照。

5)为了提高转化效率，可以浸泡植株两次，中间相隔7天。

6)分株收种子，并在含有合适抗生素的MS培养基上萌发，筛选得
到T1转基因拟南芥。

农杆菌转化的实验报告

一、实验目的1. 掌握农杆菌转化法的基本原理和操作步骤。

2. 将抗虫基因导入植物细胞，观察转化效果。

二、实验原理农杆菌转化法是一种将目的基因导入植物细胞的方法。

该方法利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）将目的基因转移到植物细胞中，并整合到植物细胞染色体DNA上，从而实现目的基因的遗传表达。

三、实验材料1. 植物材料：拟南芥种子、生长培养基、诱导培养基、选择培养基。

2. 农杆菌：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。

3. 抗虫基因：Bt基因。

4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶。

5. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素、CaCl2、DNA标记染料等。

四、实验步骤1. 目的基因克隆（1）设计引物：根据Bt基因序列设计一对引物，用于扩增Bt基因。

（2）PCR扩增：以Bt基因的DNA为模板，进行PCR扩增。

（3）克隆：将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。

2. 农杆菌工程（1）制备感受态农杆菌：将根癌农杆菌接种于LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例接种于新鲜的LB液体培养基，37℃培养3小时，加入IPTG和CaCl2，使农杆菌进入感受态。

（2）目的基因转化：将克隆有Bt基因的载体与感受态农杆菌混合，在冰浴中孵育30分钟，然后将混合液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

3. 植物转化（1）种子处理：将拟南芥种子用70%酒精消毒后，用无菌水冲洗干净。

（2）农杆菌感染：将处理好的种子接种于含有农杆菌的培养基上，28℃恒温培养3天。

（3）筛选转化植株：将感染后的种子接种于选择培养基上，筛选出转化植株。

4. 抗虫鉴定（1）PCR检测：提取转化植株的DNA，进行Bt基因的PCR检测。

（2）生物测定：将转化植株与抗虫性差的拟南芥进行抗虫性比较，观察转化植株的抗虫效果。

农杆菌实验报告

一、实验目的1. 掌握农杆菌介导的植物基因转化方法。

2. 学习基因转化过程中的操作技巧。

3. 研究农杆菌介导的基因转化在植物遗传育种中的应用。

二、实验原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤细菌，它具有将T-DNA（转移DNA）片段转移到植物细胞中的能力。

在植物基因转化实验中，利用农杆菌将目的基因导入植物细胞，进而实现基因的遗传转化。

本实验采用农杆菌介导的方法，将目的基因导入拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞中。

三、实验材料1. 拟南芥植株2. 农杆菌菌株（E. coli DH5α和Agrobacterium tumefaciens C58）3. 载体DNA（含目的基因）4. 限制性内切酶和连接酶5. 载体质粒（含T-DNA序列）6. 抗生素（卡那霉素和壮观霉素）7. 培养基和试剂四、实验方法1. 构建重组载体：将目的基因克隆到载体质粒中，并构建重组载体。

2. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共同培养，使目的基因转移到农杆菌中。

3. 农杆菌感染：将转化后的农杆菌与拟南芥植株进行共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。

4. 抗性筛选：将感染后的拟南芥植株在含有抗生素的培养基上培养，筛选出含有目的基因的植株。

5. 基因表达检测：通过PCR、RT-PCR等方法检测目的基因在转化植株中的表达情况。

五、实验结果与分析1. 重组载体的构建：通过PCR和测序验证，成功构建了含目的基因的重组载体。

2. 农杆菌转化：经过共培养和感染，拟南芥植株表现出明显的抗性。

3. 抗性筛选：在含有抗生素的培养基上，成功筛选出含有目的基因的植株。

4. 基因表达检测：通过PCR和RT-PCR实验，证实目的基因在转化植株中得到了表达。

六、实验结论1. 成功构建了含目的基因的重组载体。

2. 农杆菌介导的基因转化方法在拟南芥中取得了较好的效果。

3. 通过抗性筛选和基因表达检测，验证了目的基因在转化植株中的稳定遗传和表达。

拟南芥转化

拟南芥转化1农杆菌感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于5 ml含100 μg/ml利福平(Rifampicin)，50 μg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 μg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 μl接种于 50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的 20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的 20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 μl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。

2.质粒转化农杆菌 GV3101将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化 (冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：1) 从-80℃冰箱中取出 GV3101 感受态细胞 (100 μl)，置于冰上解冻；2) 加入 5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴 5 min； 3) 液氮冷冻8 min； 4) 37℃水浴热激 5 min；5) 加入 900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于 28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏；6) 复苏结束后于 4000 r/min 室温离心 5 min；7) 吸去 800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于 LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；8) 28℃倒置培养 2 d 直至长出阳性菌落；9) 挑取单克隆菌落，经 LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落 (液) PCR 验证，以确认是否成功转化。

经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。

（3拟南芥的转化在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。

拟南芥转化流程

拟南芥转化流程拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，被广泛用于植物生物学研究。

拟南芥转化是指将外源基因导入拟南芥的过程，通过转化技术，可以使拟南芥表达特定的基因，从而研究基因功能、调控机制以及植物生长发育等方面的问题。

下面将详细介绍拟南芥转化的流程。

一、前期准备工作在进行拟南芥转化之前，首先需要准备一些实验材料和试剂。

这些包括拟南芥种子、培养基、细菌菌株、质粒载体等。

同时还需要准备一些实验器材，如离心管、琼脂糖凝胶、PCR仪等。

二、质粒构建在进行拟南芥转化之前，需要构建含有目标基因的质粒。

质粒通常由多个部分组成，包括启动子、目标基因、选择标记等。

在构建质粒时，需要使用PCR技术扩增目标基因，并经过酶切、连接、转化等步骤，最终得到完整的质粒。

三、细菌转化和筛选构建好的质粒需要通过细菌转化来扩增。

将质粒导入适当的细菌菌株中，利用培养基和培养条件培养细菌，使其扩增质粒。

之后，通过筛选等手段，得到含有目标质粒的细菌菌落。

四、DNA提取和验证从筛选出的细菌菌落中提取质粒DNA，可以使用商业化的DNA提取试剂盒进行提取。

提取得到的DNA需要进行酶切鉴定，通过PCR扩增目标基因进行验证。

同时，还可以使用限制性片段长度多态性（RFLP）等技术对质粒进行进一步的验证。

五、拟南芥转化得到验证合格的质粒后，就可以进行拟南芥转化了。

常用的转化方法有农杆菌介导法和冷冻法。

在农杆菌介导法中，将构建好的质粒导入农杆菌中，然后将农杆菌与拟南芥叶片进行共培养，利用农杆菌的侵染能力将质粒导入拟南芥细胞中。

而冷冻法则是将拟南芥种子与农杆菌共同处理，通过冷冻和解冻的过程，使质粒导入拟南芥种子中。

六、筛选和培养转化完成后，需要对转化成功的拟南芥进行筛选和培养。

通常会在培养基中添加适当的选择标记，如抗生素等，以筛选出含有目标基因的拟南芥植株。

筛选出的植株可以继续培养，在适当的生长条件下进行生长发育观察和功能验证。

实验六、农杆菌介导转化拟南芥

科植物，二年生草本，高7～40厘米，花期3～5 月。广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于这种植物具有以下特点：
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植物基因组中最小的，但是具有完成“复杂”的植物生长发育的所有基因；
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜YEB液体培养基（50 g/ml Kan，125 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h，使OD值达到0.8左右。
3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min，弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
Hale Waihona Puke • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾花蕾。
说明
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。
• 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中（在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后，放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于 -20℃冰箱内长期保存。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

拟南芥模拟植物实验报告(3篇)

第1篇一、实验背景拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种重要的模式植物，在植物遗传学、分子生物学和发育生物学等领域的研究中发挥着举足轻重的作用。

由于其生长周期短、繁殖速度快、基因组相对较小、易于转化和遗传操作等特点，拟南芥成为科学家们研究植物生命现象的理想材料。

本实验旨在通过模拟拟南芥的生长过程，了解其生物学特性，并掌握相关实验技术。

二、实验目的1. 了解拟南芥的生长周期和生物学特性。

2. 掌握拟南芥种子萌发、移栽、生长和观察的基本实验技术。

3. 熟悉拟南芥的遗传转化和基因编辑方法。

三、实验材料1. 拟南芥种子2. 培养基（MS培养基）3. 培养皿、移栽盘、水培箱等容器4. 电转化仪、PCR仪、凝胶成像系统等仪器5. 相关试剂（如DNA提取试剂盒、PCR试剂等）四、实验方法1. 种子萌发（1）将拟南芥种子用70%乙醇消毒2分钟，然后用无菌水冲洗3次。

（2）将消毒后的种子接种到MS培养基上，置于培养箱中，保持适宜的温度和光照条件。

（3）观察种子萌发情况，记录萌发时间和生长状况。

2. 移栽（1）待拟南芥幼苗长到2-3片真叶时，将其移栽到移栽盘中。

（2）在移栽盘中加入适量的营养土，保持土壤湿润。

（3）观察移栽后的生长状况，记录生长时间和生长情况。

3. 生长和观察（1）将移栽后的拟南芥放置于水培箱中，定期更换营养液。

（2）观察拟南芥的生长状况，包括叶片、茎、根的生长速度和形态变化。

（3）记录生长数据，分析生长规律。

4. 遗传转化和基因编辑（1）利用电转化法将目的基因导入拟南芥细胞。

（2）通过PCR和DNA测序验证基因转化成功。

（3）利用CRISPR/Cas9技术对拟南芥基因进行编辑，观察基因编辑效果。

五、实验结果与分析1. 种子萌发实验结果显示，拟南芥种子在消毒后2-3天内开始萌发，5-7天内大部分种子萌发，生长状况良好。

2. 移栽移栽后的拟南芥生长迅速，叶片展开，茎、根生长良好。

3. 生长和观察实验过程中，观察到拟南芥在适宜的生长条件下，生长速度较快，叶片、茎、根的生长状况良好。

拟南芥的抗盐抗碱过表达实验流程设计

拟南芥的抗盐抗碱过表达实验流程设计下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!拟南芥抗盐抗碱过表达实验流程设计一、实验背景与目的拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为模式植物，因其生命周期短、基因组小且易于遗传操作，常被用于研究植物对环境胁迫的响应机制。

农杆菌侵染拟南芥花序的转化

农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。

2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。

3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。

4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。

一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。

4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。

6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。

7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。

转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。

Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。

实验农杆菌转化烟草和拟南芥

活化
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养至菌液OD600为1-2
诱导
• 5000 rpm离心5 min收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，乙酰丁香酮120µmol/L)，将菌液稀释至OD600为0.6-0.8
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
• 拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前受体材料一天去除已开花蕾和果荚
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL，接种 Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 活化 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200rpm振荡过夜培养至菌液OD600为1-2
• 收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，0.015% Silwet L-77)，将菌液稀释诱导至OD600为0.6-0.8
操作要点
侵染烟草叶片无菌操作注意事项抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验新鲜的叶片转化效率高侵染前去除拟南芥已开花和果荚侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长侵染后共培养一般为暗培养，1~2d，使农杆菌繁殖迅速，提高转化效率。
实验ห้องสมุดไป่ตู้告
实验目的实验原理（简略写）实验方法实验结果及分析（最重要）思考题（最后一次课给）