多级逆流固液提取技术提取大豆分离蛋白

2011年4月 The Chinese Journal of Process Engineering Apr. 2011

收稿日期：2010−12−13，修回日期：2011−03−09

基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项基金资助项目(编号2008ZX07207-003-3)

作者简介：高建萍(1987−)，女，山东省潍坊市人，硕士研究生，主要研究方向为蛋白质分离纯化；通讯联系人，张贵锋，E-mail: gfzhang@,

王明林，E-mail: mlwang@.

多级逆流固液提取技术提取大豆分离蛋白

高建萍

1,2

， 刘 琳1， 张贵锋2， 王明林1， 黄永东2， 刘永东2， 苏志国2

(1. 山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190)

摘 要：采用液相色谱和生物质谱技术对豆粕中不同蛋白质在提取过程中的释放行为进行了研究，并将多级逆流固液提取技术用于大豆分离蛋白提取. 结果表明，豆粕中的2S 组分由于分子量低和高水溶性在提取过程中释放速率较快，提取2次总释放量超过80%, 3次提取7S 和11S 组分总释放量约为69%，提高固相和液相间7S 和11S 的浓度梯度或延长提取时间有助于7S 和11S 组分释放. 采用该提取技术可提高提取液中的总蛋白浓度，在相同蛋白质收率下可节水11%，同时较高的蛋白质浓度可增加酸沉过程中蛋白质收率.

关键词：大豆分离蛋白；高效液相色谱−质谱联用技术；蛋白质识别；释放；多级逆流固液提取 中图分类号：X522 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2011)02−0312−06

1 前 言

大豆分离蛋白(Soybean Protein Isolate, SPI)是从脱脂豆粕中提取的一种植物蛋白，总蛋白质含量超过90%，良好的保水性、乳化性、吸油性和凝胶性等使其广泛用作食品添加剂和食品原料[1]. 大豆中的蛋白质根据离心过程中的沉降系数可分为2S, 7S (Conglycinin), 11S (Glycinin)和15S 四种组分，所占比例约为9.4%, 34%, 42%, 4.6%[2,3]. 7S 组分中主要是7S 球蛋白(β-Conglycinin)，是由α(70.6 kDa), α′(80.2 kDa), β(48.4 kDa)三种亚基组成的三聚体结构糖蛋白，分子量约为180 kDa ，等电点5.2∼6.2[1,4,5]. 11S 组分中主要是11S 球蛋白，是一种由6个亚基对组成的多聚亚基蛋白，分子量320∼380 kDa ，每个亚基对由1个酸性亚基和1个碱性亚基通过二硫键连接而成，等电点为4.6[6,7]. 7S 和11S 组分的含量是影响SPI 功能特性的关键因素.

目前，我国普遍采用的SPI 提取工艺属碱溶酸沉工艺，即豆粕经pH 7.8 (NaOH 调节)的水溶液浸提后离心去除不溶物，提取液经酸沉处理后再进行离心以分离出凝乳，凝乳经水洗、中和后直接进行喷雾干燥，获得SPI 粉[8,9]，提取液去除凝乳后获得的乳清水属高浓度有机废水. 豆粕中蛋白质的提取多采用传统的罐式提取，存在用水量大、7S 和11S 组分提取率低等缺陷. 提取1 t SPI 需用豆粕约2.4 t ，用水量超过29 t ，产生24 t 高浓度乳清废水(COD>20%)；此外，低提取率导致豆渣中7S 和11S 残留量高，亚基解离导致SPI 性能降低. 因此，研究新型SPI 提取工艺以降低用水量并提高7S 和11S 组分收率具有重要的现实意义. 多级逆流固液提取 (Multi-stage countercurrent solid −liquid extraction)技

术是固相物料和溶剂运动方向相反、连续定量加入固相物料和溶剂、导出残留物和提取液的连续分离技术[10,11]. 根据提取设备差异，多级逆流固液提取工艺可分为罐组式、连通器式、螺旋式及离心式等多种形式. 在多级逆流固液提取过程中不同部位的溶剂存在浓度梯度，增加了溶剂和固相物料间的浓度差异，从而加快了目标物释放速率并获得较高的提取液浓度[12]. 多级逆流固液提取技术由于溶剂用量少、提取时间短和生产效率高等优点[13]，近年来在食品、中药、天然产物等领域中的应用日益增多.

针对SPI 提取过程中存在的用水量大、7S 和11S 提取率低并导致高浓度有机废水产生量大等共性问题，本研究以蛋白质释放行为研究为基础，比较了不同条件下蛋白质的释放速率差异，研究了多级逆流固液提取技术用于提取大豆分离蛋白以降低用水量的可行性.

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

脱脂豆粕由大庆日月星公司提供，胰蛋白酶(序列纯)购自美国Promega 公司，三氟乙酸(TFA)和乙腈购自美国Fisher 公司，其他试剂均为市售分析纯. 2.2 仪器

高效液相色谱−质谱联用系统(HPLC −MS)由美国Agilent 公司1100液相色谱和美国Thermo Fisher 公司LCQ Deca XP 电喷雾质谱组成，数据采集与处理软件为Xcalibur 1.3，数据分析软件为Biowork 3.1(含Turbosequest), Ultrospec 2000紫外分光光度计(瑞典Pharmacia 公司).

2.3 实验方法

2.3.1 蛋白质释放过程分析

称取100 g 豆粕，加入800 mL pH 7.8的NaOH 溶液，50℃摇床中连续振荡10 min ，快速抽滤，收集滤液；向残余豆粕中加入400 mL pH 7.8的NaOH 溶液，重复上述过程4次. 将收集到的滤液离心(10000 r/min, 5 min)，上清液用HPLC 分离，收集分离出的各色谱峰，酶解后进行液质联用分析以进行蛋白质识别；通过HPLC 各色谱峰面积研究不同蛋白质释放过程.

将上述实验获得的蛋白质提取液合并，调节pH 值至4.5，冷却至4~6℃，以10000 r/min 离心5 min ，收集上清液，酶解处理后用液质联用技术进行蛋白质种类分析.

2.3.2 多级逆流固液提取实验

多级逆流固液提取工艺实验装置系统图见图1. 在提取过程中清水从右向左移动，豆粕相对于提取液从左向右移动，整体上豆粕与提取液运动方向相反，其中S 0为新鲜豆粕，S 1, S 2和S 3分别为提取一、二和三次后的豆粕，W 为清水，提取液E 1为豆粕S 2与清水混合后的提取液，提取液E 2为豆粕S 1与E 1混合后的提取液，提取液E 3为新鲜豆粕S 0与E 2混合后的提取液. 多级逆流固液萃取实验启动时3个提取罐装满水溶液，向第1个罐中加入新鲜豆粕，连续搅拌并离心分离，洗涤后的豆粕依次导入第2和第3个提取罐直至稳态操作；在稳态多级逆流固液萃取过程中，清水W 与提取过2次的豆粕S 2均匀混合，

通过旋流分离器分离后产生的豆粕残渣S 3不再使用，产生的提取液为一次蛋白提取溶液E 1；该提取液与提取过1次的豆粕S 1混合均匀，

连续离心后的豆粕残渣为2次提取的残渣S 2，

产生的提取液为二次蛋白提取溶液E 2；该提取液与新鲜的豆粕S 0均匀混合，连续离心后产生豆粕残渣S 1，产生的提取液为3次蛋白提取溶液E 3.

图1 多级逆流固液提取实验装置系统图

Fig.1 Schematic diagram of experimental apparatus for multi-stage countercurrent solid −liquid extraction

2.4 分析方法 2.4.1 蛋白质含量测定

蛋白质含量测定采用福林酚法. 2.4.2 凝胶过滤色谱分析

大豆蛋白提取溶液用凝胶过滤色谱法(HPSEC)分析，色谱柱为TSK3000SW[300 mm×7.5 mm (I.D.), 10 µm]，流动相为0.02 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0)，流速0.4 mL/min ，检测波长280 nm ，进样量10 µL. 2.4.3 HPLC 分析

大豆蛋白提取溶液用去离子水稀释后用HPLC 分析，色谱条件：色谱柱Zorbax 300 SB C 18[250 mm×4.6 mm (I.D.), 5 µm]，流动相A 为水(含0.1% TFA)，流动相B 为乙腈(含0.1% TFA)，梯度：0~45 min 5%~60% B ，45~50 min 60%~90% B ，流速0.75 mL/min ，波长280 nm. 2.4.4 酶解方法

将上节分离出的色谱峰在100℃下热变性处理10 min ，真空干燥，然后溶于200 µL 0.05 mol/L NH 4HCO 3溶液(pH 8.0)中，加入50 µg 胰蛋白酶[溶于50 µL 0.05

mol/L NH 4HCO 3 (pH 8.0)中]，混合均匀后于37℃恒温8 h ，酶解产物直接进行HPLC −MS 分析. 蛋白质提取液经酸沉淀处理后的上清液于100℃下热变性处理10 min ，将pH 值调至8.0后加入胰蛋白酶，酶解条件同上. 2.4.5 HPLC −MS 分析

色谱柱为Zorbax SB C 18[150 mm×2.1 mm (I.D.), 5 µm]；流动相A 为水(含0.1% TFA), B 为乙腈(含0.1% TFA)；梯度0~80 min 10%~90% B ，进样量30 µL. 质谱条件：离子源喷雾电压4.5 kV ，毛细管温度300℃，扫描范围m /z 300~2000. 精确质量数扫描和二级质谱扫描(MS/MS)均为数据依赖型扫描，MS/MS 碰撞能量为35%. 质谱数据用Turbosequest 软件进行检索，数据库为从Swiss-Prot 下载的包括大豆中已发现的全部蛋白质的氨基酸序列.

3 结果与讨论

3.1 豆粕提取液中蛋白质种类识别

采用HPLC

对豆粕提取液及其后续处理样品进行

S 0. Fresh soybean meal

S 1, S 2, S 3. Soybean meal after extraction by

one, two and three times

W. Fresh water

E 1. Supernatant from the mixture of W with S 2E 2. Supernatant from the mixture of E 1 with S 1E 3. Supernatant from the mixture of E 2 with S 01. Extraction container 2. Pump

3. Cyclone separator