植物细胞悬浮培养技术PPT讲稿
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长， 则会引起细胞的大量死亡和解体。
操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团 （2～4细胞），使用吸管或注射器。
继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多 次，可建立良好的细胞悬浮培养物。
2.2 连续培养（Continuous culture）
加研磨介质
轻轻研磨 过滤、离心
研磨介质：40ml 20umol Sucrose 10umol MgCl2 20umol tris—HCL (三羟甲基氨基甲烷 ) PH 7.8
注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉
细胞才能取得成功。
注意：大麦、小麦和玉米很难通
过酶解法使细胞分离。 （叶肉细胞伸长，并在许多地方 收缩，细胞间形成一种互锁结构）
植物细胞悬浮培养技术课件
单细胞的分离
由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织（如愈伤组织）
中分离单细胞
1 由完整的植物器官分离单细胞
叶片是分离单细胞的最好材料
机械法 酶解法
1.1 机械法
方法A：用刀片刮叶片
(花生成熟叶片)
具体方法:
撕去表皮
露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞
方法B：叶片研碎、离心
养
细
胞
5
数 目
4
3 12
滞后期
1 (lag phase) 2 指数生长期
(exponential phase)
3 直线生长期
(linear phase)
4 培养时间
减慢期
(progressive
deceleration phase)
5 静止期
(stationary phase)
培
养
细
Hale Waihona Puke Baidu
胞
5
数 目
4
1 滞后期
12
培养时间
细胞生长和发育最快的时期
培
养
细
胞
5
数 目
4
3 12
4 减慢期
(progressive deceleration phase)
培养时间
由于培养基中某些营养物质已经耗尽，或是由于有毒代谢产物的积累，细 胞的增长逐渐减慢
培
养
细
胞
5
数 目
4
3 12
5 静止期
(stationary phase)
事例 分离篱天剑叶肉细胞的机械方法
叶片消毒
10ml培养基 1.5克1cm2叶片
75％酒精， 7％次氯酸钠
匀浆
植板
过滤
离心
低速，去碎屑，游离细胞 沉降
1.2 酶解法
Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞
加果胶酶 过滤 、离心
1.3 机械法和酶解法比较
机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。
的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并 移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进 行培养。 注意：要适当稀释
继代
最佳继代时期：
选择指数生长期和直线生长期。
2.1.4 细胞生长曲线
• 在整个培养过程中，细胞数目不断发
生变化，呈现出明显的由慢到快，再 到慢，最后增长停止的细胞周期。
细胞的生长呈S形曲线
培
在培养过程中除了气体和挥发性代 谢产物可以同外界空气交换外，一切都 是密闭的。
它是进行细胞生长和细胞分裂的生 理生化研究常用的培养方法。
2.1.2 特点
• 培养基体积固定 • 当培养基中的营养物质耗尽时，
细胞的分裂和生长也停止
• 必须适当搅拌
2.1.3 继代的方法和最佳时期
• 继代方法：用注射器或移液管吸取一定量
1. 细胞受到酶的伤害；
酶解法
2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高；
4. 细胞不易破。
2 由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
1 诱导产生愈伤组织 2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组 织的松散性；
继代
悬浮
摇床用于振荡
3 Subculture 将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培
紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗肿瘤药物。红豆杉树皮中紫杉醇 的含量为万分之二，其在国际市场上售价为20万美元/kg
由悬浮细胞再生植株的途径
• 由悬浮细胞直接形成体细胞胚 • 先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成
愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株
3 细胞悬浮培养的培养基
3.1 悬浮培养对培养基的要求 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组
培养时间
生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。
小结：
（1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细 胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
（2）加入条件培养基可以缩短滞后期。
条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。
（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细 胞一直保持指数生长期。
(lag phase)
3
12
培养时间
细胞很少分裂，其时间长短取决于在继代时原种 培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少
培
养
细
胞
5
数 目
4
2 指数生长期
(exponential phase)
3
12
培养时间
细胞分裂活跃，细胞数目迅速增加
培
养
细
胞
5
数 目
4
3 直线生长期
3
(linear phase)
加入培养基
二者体积相等 排出培养基及其培养物
分：开放式连续培养 封闭式连续培养
开放式和封闭式区别
➢封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集 后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不 断增加； ➢开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养 细胞随同培养液一起流出 。
连续培养意义： 植物细胞代谢调节的研究 某种生长限制因子对细胞生长的影响 次生物质的大量生产
长、分化创造方法和条件。 必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。
1、起始悬浮液的制备
转速30～150rpm
愈伤组织
防细胞破裂
液体培养基 摇床振荡
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
悬浮培养
2、悬浮培养的基本形式
分批培养 连续培养
2.1 分批培养（Batch culture） 2.1.1 含义：将细胞分散在一定容积 的培养基中进行培养。
养物
优点：细胞团成小细胞团或单细胞； 在培养基中均匀分布；有空气交流。
植物细胞悬浮培养 技术 （Suspension culture）
概念：是指一种在受到不断摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的 组织培养系统。
特点： • 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适
于大规模培养； • 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生
织的培养基，一般也适用于建立该物种的 悬浮培养。
操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团 （2～4细胞），使用吸管或注射器。
继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多 次，可建立良好的细胞悬浮培养物。
2.2 连续培养（Continuous culture）
加研磨介质
轻轻研磨 过滤、离心
研磨介质：40ml 20umol Sucrose 10umol MgCl2 20umol tris—HCL (三羟甲基氨基甲烷 ) PH 7.8
注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉
细胞才能取得成功。
注意：大麦、小麦和玉米很难通
过酶解法使细胞分离。 （叶肉细胞伸长，并在许多地方 收缩，细胞间形成一种互锁结构）
植物细胞悬浮培养技术课件
单细胞的分离
由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织（如愈伤组织）
中分离单细胞
1 由完整的植物器官分离单细胞
叶片是分离单细胞的最好材料
机械法 酶解法
1.1 机械法
方法A：用刀片刮叶片
(花生成熟叶片)
具体方法:
撕去表皮
露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞
方法B：叶片研碎、离心
养
细
胞
5
数 目
4
3 12
滞后期
1 (lag phase) 2 指数生长期
(exponential phase)
3 直线生长期
(linear phase)
4 培养时间
减慢期
(progressive
deceleration phase)
5 静止期
(stationary phase)
培
养
细
Hale Waihona Puke Baidu
胞
5
数 目
4
1 滞后期
12
培养时间
细胞生长和发育最快的时期
培
养
细
胞
5
数 目
4
3 12
4 减慢期
(progressive deceleration phase)
培养时间
由于培养基中某些营养物质已经耗尽，或是由于有毒代谢产物的积累，细 胞的增长逐渐减慢
培
养
细
胞
5
数 目
4
3 12
5 静止期
(stationary phase)
事例 分离篱天剑叶肉细胞的机械方法
叶片消毒
10ml培养基 1.5克1cm2叶片
75％酒精， 7％次氯酸钠
匀浆
植板
过滤
离心
低速，去碎屑，游离细胞 沉降
1.2 酶解法
Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞
加果胶酶 过滤 、离心
1.3 机械法和酶解法比较
机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。
的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并 移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进 行培养。 注意：要适当稀释
继代
最佳继代时期：
选择指数生长期和直线生长期。
2.1.4 细胞生长曲线
• 在整个培养过程中，细胞数目不断发
生变化，呈现出明显的由慢到快，再 到慢，最后增长停止的细胞周期。
细胞的生长呈S形曲线
培
在培养过程中除了气体和挥发性代 谢产物可以同外界空气交换外，一切都 是密闭的。
它是进行细胞生长和细胞分裂的生 理生化研究常用的培养方法。
2.1.2 特点
• 培养基体积固定 • 当培养基中的营养物质耗尽时，
细胞的分裂和生长也停止
• 必须适当搅拌
2.1.3 继代的方法和最佳时期
• 继代方法：用注射器或移液管吸取一定量
1. 细胞受到酶的伤害；
酶解法
2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高；
4. 细胞不易破。
2 由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
1 诱导产生愈伤组织 2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组 织的松散性；
继代
悬浮
摇床用于振荡
3 Subculture 将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培
紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗肿瘤药物。红豆杉树皮中紫杉醇 的含量为万分之二，其在国际市场上售价为20万美元/kg
由悬浮细胞再生植株的途径
• 由悬浮细胞直接形成体细胞胚 • 先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成
愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株
3 细胞悬浮培养的培养基
3.1 悬浮培养对培养基的要求 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组
培养时间
生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。
小结：
（1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细 胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
（2）加入条件培养基可以缩短滞后期。
条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。
（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细 胞一直保持指数生长期。
(lag phase)
3
12
培养时间
细胞很少分裂，其时间长短取决于在继代时原种 培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少
培
养
细
胞
5
数 目
4
2 指数生长期
(exponential phase)
3
12
培养时间
细胞分裂活跃，细胞数目迅速增加
培
养
细
胞
5
数 目
4
3 直线生长期
3
(linear phase)
加入培养基
二者体积相等 排出培养基及其培养物
分：开放式连续培养 封闭式连续培养
开放式和封闭式区别
➢封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集 后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不 断增加； ➢开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养 细胞随同培养液一起流出 。
连续培养意义： 植物细胞代谢调节的研究 某种生长限制因子对细胞生长的影响 次生物质的大量生产
长、分化创造方法和条件。 必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。
1、起始悬浮液的制备
转速30～150rpm
愈伤组织
防细胞破裂
液体培养基 摇床振荡
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
悬浮培养
2、悬浮培养的基本形式
分批培养 连续培养
2.1 分批培养（Batch culture） 2.1.1 含义：将细胞分散在一定容积 的培养基中进行培养。
养物
优点：细胞团成小细胞团或单细胞； 在培养基中均匀分布；有空气交流。
植物细胞悬浮培养 技术 （Suspension culture）
概念：是指一种在受到不断摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的 组织培养系统。
特点： • 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适
于大规模培养； • 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生
织的培养基，一般也适用于建立该物种的 悬浮培养。