植物细胞悬浮培养技术PPT讲稿
胡萝卜愈伤组织悬浮培养体系的建立和再分化的诱导PPT课件
化的诱导
1
一、实验目的
• 学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法 和相关操作。
• 通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个 过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培 养技术生产有用次生代谢物这一个技术的 主要流程，技术体系和注意事项。
• 学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和 方法。
撰写
7
污染源: 细菌,霉菌?现象?
• 观察
生 有污染 长 反 应 无污染
原因: 外植体?环境?操作?
不生长,发白或死亡
不生长,不死亡,也无愈伤形成 发生部位
愈伤形成 颜色质地 差异原因?
• 拍照
• 分析
8
形式
综合性的一篇论文 分开的三次实验报告
实
验
结构上的完整性
报
文字 术语的正确使用
告
内容
图片
不同污染源导致的污染 不同生长情况的图片 不同愈伤组织的图片
悬浮振荡培养1周或更长
称重,计算细胞鲜重的增加(?g )
收集细胞,分离-提取-纯化胡萝卜素,并测定含量
10
2. 再分化诱导
• 8人/组 • 2-3瓶/人
建立起来的无菌培养物
无菌条件下切割分开
接种在分化培养基上
适当条件下培养1-3周 培养反应的观察
11
3 胡萝卜素的分离提取和含量测定
悬浮细胞的收集
细胞分裂、 分化调节
培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.5mg/L
单细胞或细胞细胞团块的获得
方法（机 械和酶法）
液体培养
细胞活力 细胞分裂和生长 分化和代谢调节
[讲解]植物细胞悬浮培养
![[讲解]植物细胞悬浮培养](https://img.taocdn.com/s3/m/e2a9e14da8114431b90dd8f8.png)
[讲解]植物细胞悬浮培养现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体;细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养(in vitro culture)，就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
?组织培养:是指从生物体内取出活的组织(多指组织块)在体外进行培养的方法。
?细胞培养:是指将活细胞(尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法。
?器官培养:是指从生物体内取出的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1.差异:细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化:分化现象减弱;形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡;或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2.分化:体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞(小鼠红白血病细胞)在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
悬浮细胞培养技术课件
悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。
进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。
从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3.首先观察培养板孔中培养液量。
用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。
再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。
4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。
吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。
7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。
8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。
9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。
二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
植物细胞悬浮培养与生长量的测定课件
的测定
植物细胞悬浮培养 技术 （Suspension culture）
概念：是指一种在受到不断摇动的液体培养 基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系 统。
特点： ? 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适
于大规模培养； ? 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生
长、分化创造方法和条件。 必须指出： 悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。
3 12
1 滞后期
(lag phase)
2 指数生长期
(exponential phase)
3 直线生长期
(linear phase)
培养时间 4 减慢期
培是养极由由细细少于胞胞于细生，细有所很培胞长甚胞毒处少养分几至生的分代基裂乎开生裂长谢中长活，处始和产某期其跃于死发物和时些，停亡育的转间营细止。最积入长养胞状快细短累物数态胞取的5，质数目决，时细量已于(d迅细静期pe胞r的c在经o速e胞止gl的多e继r耗er增数a期s增少代tsii尽ov加目n时e长，p增原h逐a或s种加e)
③将已接种的培养瓶置于旋转式摇床上， 在转速 100-120rpm ，25℃下进行震荡培养。
1、起始悬浮液的制备
转速30～150rpm
愈伤组织
防细胞破裂
液体培养基 摇床振荡
悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小， 不适于悬浮培养
（2）培养细胞的生长量测定 ① 鲜重测定 采用直接测量法，将悬浮培养的细胞用细 胞筛过滤，过滤后用水冲洗，除去培养基， 然后离心除去水分。将获得的沉淀细胞称 量即为悬浮细胞的鲜重。
② 干重测定 将鲜重测定得到的细胞置于 60℃烘箱内烘 12～24h（因材料大小、数量多少而定） 取出，冷却后立即称量，即为悬浮细胞干 重。
植物细胞组织培养(PPT)
2
06.10.2020
主要有:
➢ 原生质体（Protoplast）培养 ➢ 悬浮细胞培养 ➢ 组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培
养 ➢ 器官（胚，花药，子房，根和茎）培养
其中最常见的是愈伤组织培养。
06.10.2020
3
06.10.2020
植物细胞组织培养范畴：
（广义）又叫离体培养：指从植物体分离出 符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等， 通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养 以获得再生的完整植株或生产具有经济价值 的其他产品的技术。
06.10.2020
14
三、植物组织培养的生理依据
植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具 有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、 赤霉素、脱落酸、乙烯等
生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管 苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强 弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA。
细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老， 促进芽的产生等作用。常用的有Zip(异戊烯腺嘌呤)、KT、6BA、ZT等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>ZT。
赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。 常用的为GA3。
06.10.2020
15
四、植物组织培养的原理
★植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成
种子培养
10
06.10.2020
3. 组织或愈伤组织培养(tissue， callus culture) ：是对植物体的各部分
组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、 木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄 壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈 伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形 成植株.
实验：植物细胞的悬浮培养技术
• • • •
三、实验器材与材料
• 器材 • 超净工作台，酒精灯，镊子，高压灭菌锅
• 材料 前面实验诱导的豇豆的愈伤组织。
四、实验方法
• 1.用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织(注意愈 伤组织的选择)，放入试管中并轻轻夹碎。 • 接种密度：每毫升培养基接0.1克愈伤组织。以保 证最初培养物中有足够量的细胞。 • 2.将已接种的试管置于旋转式摇床上。在 100r/min，25~28℃条件下，进行振荡培养。
• 3.经6—10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养 瓶中加新鲜培养基4ml，必要时，可用移液管将培 养物分装成两管，继续培养。 • （若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当， 应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）。可 进行第一次继代培养。
五、注意事项： 注意事项：
• 1.上述步骤均灭菌操作，培养基、用具、 器皿等要高压灭菌后方可使用。 2.如培养液混浊或呈现乳白色，表明已污 染。 • 3.实验报告每人写一份。实验讨论部分记 得首先评价自己之前培养的愈伤组织的生 长情况。
植物细胞的悬浮培养技术
一、实验目的
• 1.掌握植物悬浮细胞系建立的方法，原理。 • 2. 巩固组织与细胞培养的无菌操作技术。
二、实验原理
• • 将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进 行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。 植物离体培养可产生愈伤组织。将疏松型的愈伤组织 县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散县浮培养物。 良好的县浮培养物应具备以下特征： （1）主要有单细胞和小细胞团组成； （2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快； （3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们 多呈等径形，核质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。
植物细胞的悬浮培养技术
毕业论文(设计)中国·武汉二○一二年四月目录摘要 (3)关键词 (3)Abstract (3)Key words (3)前言 (4)1.细胞悬浮培养的定义 (4)2.单细胞制备的方法 (4)2.1 机械法 (4)2.2酶解法 (4)2.3 愈伤组织诱导法 (4)3.悬浮培养的条件 (5)4.细胞初始培养 (5)5.细胞悬浮培养的类型 (5)5.1分批培养 (5)5.2连续培养 (6)6.悬浮培养细胞的同步化 (6)6.1 物理方法 (6)6.1.1 体积选择法 (6)6.1.2低温处理法 (6)6.2 化学方法 (6)6.2.1 饥饿法 (6)6.2.2抑制法 (6)7.规模化培养 (7)8.存在问题与前景展望 (7)8.1植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势 (7)8.2植物细胞培养过程中存在的困难 (7)8.3前景展望 (7)参考文献 (8)致谢 (8)植物细胞的悬浮培养技术摘要悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛的应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低，生产成本高，劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现在生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学Plant cell suspension culture technologyAbstractBecause plant cells are gathered together for the characteristic, therefore, in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with cell clusters form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technologyKey words.Plant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology前言将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术,称为植物细胞悬浮培养.它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术.50年代起,米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究,得到了万寿菊,烟草单细胞和细胞团的悬浮液.1958年斯图尔德等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养,并得到了完整的再生植株.三十多年来,从试管的悬浮培养发展到太空量的发酵罐培养,从不连续培养发展到半连续和连续培养.80年代以来,作为生物技术中的一个组成部分,正在发展成为一门新兴的产业体系.悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料,也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础外,还在育种、快速繁殖、原生质体培养,体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用.由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.1 细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
第二章(4)植物悬浮细胞培养
第二章(4)植物悬浮细胞培养技术1 单细胞的分离1.1由完整的植物器官分离单细胞1.1.1 机械法只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。
1.1.2酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞。
1.1.3 机械法和酶解法比较机械法：①细胞不受到酶的伤害；②不用质壁分离；③细胞产量低；④细胞易破。
酶解法：①细胞受到酶的伤害；②要质壁分离；③细胞产量高；④细胞不易破。
1.2由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞1.2.1 诱导产生愈伤组织1.2.2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；1.2.3 Subculture(将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物)。
2 Suspension culture2.1 概念是指一种在受到不断摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统。
2.2 特点2.2.1细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2.2.2能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。
2.3 起始悬浮液的制备2.4 悬浮培养的基本形式2.4.1分批培养（Batch culture）2.4.1.1 含义将细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。
在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。
它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。
2.4.1.2 特点①培养基体积固定；②当培养基中的营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长也停止；③必须适当搅拌。
2.4.1.3继代的方法和最佳时期继代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。
在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。
细胞的生长呈S形曲线。
CHO细胞大规模悬浮培养流程简介ppt课件
1
一 悬浮培养特点 （suspension culture)
非贴壁依赖型细胞的一种培养方式 细胞悬浮于培养基中生长或者维持 某些贴壁依赖型细胞经过适应和选择后也可
用此方法培养 使用振荡或者转动装置使细胞始终处于悬浮
状态
2
二 CHO细胞大规模悬浮培养工艺流 程
9
补碱、补糖、补料
当反应器内pH值低于6.8左右时，需要进行补碱 当反应器内糖含量低于2g/L时，需要进行补糖 当反应器内营养物逐渐耗尽，需要根据工艺进行补料
10
收获细胞液
在培养末期，细胞密度及活力都开始下降，此时应该进行细 胞液的收获，收获时保证细胞活力高于60%
预先准备好深层过滤膜包及管路的安装和保压 将反应器降温至18℃左右，连接深层过滤夹具进E或者种子罐
收货细胞液
反应器培养
3
1 细胞复苏
将水浴锅温度调至37℃ 从液氮罐中取出冻存管，用镊子夹住迅速放入水浴锅中晃动，
直至完全溶解后将冻存管表面消毒转移至超净工作台内进行 操作 将细胞悬液转移至15ml离心管内，加入约10ml培养液，轻 轻吹打混匀 将细胞悬液经800-1000rpm离心5分钟，弃去上清液 向细胞沉淀加入10ml培养液，吹打均匀后将细胞悬液转移至 摇瓶内，加入适量培养液，开始培养
4
细胞复苏注意事项
注意全程无菌操作 溶解冻存细胞时速度一定要快，避免缓慢升温细胞内形成冰
晶，对细胞造成损伤 计算合适的接种密度，一般CHO细胞培养的接种密度范围在
3.0-6.0*10E5个/ml 注意安全：取出冻存管时防止冻伤，同时注意有无液氮渗透
进入冻存管，防止液氮迅速气化导致冻存管爆炸造成人员危 险
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
由悬浮细胞再生植株的途径
• 由悬浮细胞直接形成体细胞胚 • 先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成
愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株
3 细胞悬浮培养的培养基
3.1 悬浮培养对培养基的要求 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组
长、分化创造方法和条件。 必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。
1、起始悬浮液的制备
转速30～150rpm
愈伤组织
防细胞破裂
液体培养基 摇床振荡
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
悬浮培养
2、悬浮培养的基本形式
分批培养 连续培养
2.1 分批培养（Batch culture） 2.1.1 含义：将细胞分散在一定容积 的培养基中进行培养。
养物
优点：细胞团成小细胞团或单细胞； 在培养基中均匀分布；有空气交流。
植物细胞悬浮培养 技术 （Suspension culture）
概念：是指一种在受到不断摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的 组织培养系统。
特点： • 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适
于大规模培养； • 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生
(lag phase)
3
12
培养时间
细胞很少分裂，其时间长短取决于在继代时原种 培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少
培
养
细
胞
5
数 目
4
2 指数生长期
(exponential phase)
3
12
培养时间
细胞分裂活跃，细胞数目迅速增加Leabharlann 培养细胞
5
数 目
4
3 直线生长期
3
(linear phase)
在培养过程中除了气体和挥发性代 谢产物可以同外界空气交换外，一切都 是密闭的。
它是进行细胞生长和细胞分裂的生 理生化研究常用的培养方法。
2.1.2 特点
• 培养基体积固定 • 当培养基中的营养物质耗尽时，
细胞的分裂和生长也停止
• 必须适当搅拌
2.1.3 继代的方法和最佳时期
• 继代方法：用注射器或移液管吸取一定量
1. 细胞受到酶的伤害；
酶解法
2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高；
4. 细胞不易破。
2 由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
1 诱导产生愈伤组织 2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组 织的松散性；
继代
悬浮
摇床用于振荡
3 Subculture 将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培
加研磨介质
轻轻研磨 过滤、离心
研磨介质：40ml 20umol Sucrose 10umol MgCl2 20umol tris—HCL (三羟甲基氨基甲烷 ) PH 7.8
注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉
细胞才能取得成功。
注意：大麦、小麦和玉米很难通
过酶解法使细胞分离。 （叶肉细胞伸长，并在许多地方 收缩，细胞间形成一种互锁结构）
事例 分离篱天剑叶肉细胞的机械方法
叶片消毒
10ml培养基 1.5克1cm2叶片
75％酒精， 7％次氯酸钠
匀浆
植板
过滤
离心
低速，去碎屑，游离细胞 沉降
1.2 酶解法
Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞
加果胶酶 过滤 、离心
1.3 机械法和酶解法比较
机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。
养
细
胞
5
数 目
4
3 12
滞后期
1 (lag phase) 2 指数生长期
(exponential phase)
3 直线生长期
(linear phase)
4 培养时间
减慢期
(progressive
deceleration phase)
5 静止期
(stationary phase)
培
养
细
胞
5
数 目
4
1 滞后期
植物细胞悬浮培养技术课件
单细胞的分离
由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织（如愈伤组织）
中分离单细胞
1 由完整的植物器官分离单细胞
叶片是分离单细胞的最好材料
机械法 酶解法
1.1 机械法
方法A：用刀片刮叶片
(花生成熟叶片)
具体方法:
撕去表皮
露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞
方法B：叶片研碎、离心
培养时间
生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。
小结：
（1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细 胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
（2）加入条件培养基可以缩短滞后期。
条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。
（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细 胞一直保持指数生长期。
12
培养时间
细胞生长和发育最快的时期
培
养
细
胞
5
数 目
4
3 12
4 减慢期
(progressive deceleration phase)
培养时间
由于培养基中某些营养物质已经耗尽，或是由于有毒代谢产物的积累，细 胞的增长逐渐减慢
培
养
细
胞
5
数 目
4
3 12
5 静止期
(stationary phase)
的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并 移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进 行培养。 注意：要适当稀释
继代
最佳继代时期：
选择指数生长期和直线生长期。
2.1.4 细胞生长曲线
• 在整个培养过程中，细胞数目不断发
生变化，呈现出明显的由慢到快，再 到慢，最后增长停止的细胞周期。
细胞的生长呈S形曲线
培
加入培养基
二者体积相等 排出培养基及其培养物
分：开放式连续培养 封闭式连续培养
开放式和封闭式区别
➢封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集 后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不 断增加； ➢开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养 细胞随同培养液一起流出 。
连续培养意义： 植物细胞代谢调节的研究 某种生长限制因子对细胞生长的影响 次生物质的大量生产
织的培养基，一般也适用于建立该物种的 悬浮培养。
（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长， 则会引起细胞的大量死亡和解体。
操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团 （2～4细胞），使用吸管或注射器。
继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多 次，可建立良好的细胞悬浮培养物。
2.2 连续培养（Continuous culture）