郑州大学2008年博士学位论文

郑州大学2008年博士学位论文

SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究

SV40T抗原基因在转基因小鼠

胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究

博士研究生陈辉

导师张钦宪

郑州大学基础医学院郑州450052

摘要

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居各种恶性肿瘤之首位。

近年来，随着分子生物学、免疫学、细胞生物学、病理学等高新技术的迅速发展，

国内外对胃癌的基础和防治研究取得了长足进步。但这些研究大部分是在临床基

础上对胃癌患者的回顾性研究，在时间和空间上存在许多局限性。如要验证各种

可疑的致癌、促癌因素，阐明胃癌发生的发病机制，探讨抗癌药物的作用机制并

对其进行筛选，则必须建立胃癌动物模型。

人类疾病动物模型在医学发展中起着十分重要的作用。多年来一般采用诱变

剂处理的方法来筛选建立肿瘤动物模型，但此方法诱变发生的不确定性、肿瘤产

生的随机性、动物无法在整体水平产生生物学效应等缺点，使其应用受到一定的

限制。而转基因动物模型则克服了以上缺点，能在动物整体水平观察所转入基因

的生物学效应，探讨其在动物体内的组织特异性表达或调控过程，为癌基因作用

机理、癌细胞发生、发展过程、基因表达调控等方面研究提供宝贵资料，并为建

立人类疾病动物模型开创新的科研途径。

转基因动物(transgenic animal)是用基因工程技术将外源基因通过生殖

细胞或早期胚胎导入动物胚胎染色体基因组中，使之稳定整合并传递给后一代的

动物。转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，在医学、分子生物学、分子

遗传学、畜牧兽医学等研究领域有无限广阔的前景。目前转基因技术大多采用受

精卵细胞的显微基因注射技术或电转移技术，其操作包括外源基因重组载体的构

建、受精卵细胞的采集、外源基因的显微注射、注射后受精卵(或胚胎)的移植、

转基因小鼠的检测等步骤。国外已建立了人遗传病和癌基因的转基因动物模型，

用于肿瘤和遗传学研究，但这方面的研究在我国尚属起步阶段。

转基因动物模型研究中广泛采用的SV40 (Simian Virus 40, SV40)属乳多郑州大学2008年博_l:学位论文SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究

空病毒科(papo va vi ri dae)多瘤病毒属(pol yoma vi rus)，在病毒DNA复制前编码

2种转化蛋白，即大T抗原(large T antigen, Tag)和小T抗原(small t antigen,

tag) o Tag是一种磷酸化蛋白，在细胞转化中起决定性作用，为细胞转化所必需。

tag是非磷酸化蛋白，对细胞转化并非必需，但可起加强作用。SV40基因编码的

大T抗原己广泛应用于转基因动物肿瘤模型的建立。如Santarelli等将SV40T

基因导入小鼠细胞构建了小鼠乳腺癌动物模型;Brister等将SV40T基因和含金

属筑基基因的融合基因质粒导入小鼠生殖系产生的转基因小鼠成年后可发生脑

脉络从乳头状瘤，Hochman建立了眼部肿瘤转基因小鼠模型。

胃壁细胞是胃底腺的主要细胞类型之一，能合成和分泌盐酸，从而刺激胃肠

道内分泌细胞和胰液的分泌。H丫K'ATP酶(H丫K"ATPase )基因在胃壁细胞中特异

性表达，和胃酸的合成与分泌有着直接关系。Gordon建立了在胃壁细胞中特异

性表达人生长激素(human growth hormone, hGH )、内在因子(intrinsic factor,

INF)的转基因动物模型，为研究胃薪膜上皮细胞的发生、演化过程奠定了基础。

我们构建胃壁细胞H丫K'ATPase亚基启动子驱动下的SV40T基因的真核表达

载体，并将其导入小鼠受精卵细胞建立转基因动物模型。该模型动物将实现

SV40T基因在胃壁细胞中的特异性表达，并诱发小鼠胃壁细胞增生，胃薪膜发生

癌前病变、癌变等一系列病理性改变，从而为胃癌发生机理的研究、胃癌的诊断

与治疗、胃癌特异性药物的筛选提供十分有用的实验动物模型。

方法

一、SV40T基因胃壁细胞特异性表达载体的构建

1.扩增H'/K'ATPase亚基启动子:采用酚一氯仿法从小鼠肝细胞中提取基因

组DNA, PCR扩增H'/K'ATPase亚基启动子，PCR产物命名为HK.

2. pMT/HK的制备:将PCR产物纯化回收后与pMT18一载体相连，转化感受态E.

coli DN5Q细胞，从转化平板上随机挑取8个单菌落，37℃摇菌过夜培养，

取菌液提取质粒DNA, Xba I , BamH I双酶切鉴定出阳性克隆，命名为pMT/HK

并进行测序鉴定。

3.构建pcDNA3. 1 /HK质粒:将pMT/HK用Xba I, BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电

泳，切胶回收约1060bp的DNA片段。将回收产物与用Xba I, BamH I双酶切的

pcDNA3. 1(一)质粒连接，转化感受态DH5 a细胞，从转化平板上挑单菌落，

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提取质粒DNA，限制性内切酶消化鉴定出阳性重组克隆，记作pcDNA3. 1 /HK o

4.构建pcDNA3.l/HKSV质粒:将pLITAg(含SV40T基因片段)质粒用BamH I酶

切，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约2700bp的DNA片段，将回收产物与用Bamff I 酶切的pcDNA3. 1/HK连接，转化感受态细胞DH5 a，从转化平板上挑取单菌落，37℃摇菌过夜培养，取菌液提取质粒DNA，酶切鉴定重组体，并测序鉴定SV40T 基因插入的方向及DNA序列，插入方向正确的重组体记为pcDNA3.1/HKSV o

5.构建pcDNA3. 1/SV质粒:将pLITAg质粒用BamH I酶切，琼脂糖凝胶电泳，切

胶回收约2700bp的DNA片段，将回收产物与用BamH I酶切的pcDNA3. 1(一)连

接，提取质粒DNA，酶切鉴定重组体，经测序鉴定插入方向正确的重组体记

为pcDNA3. 1/SV o

二、特异性表达SV40T基因转基因小鼠的建立

1.制备转基因用DNA:提纯pcDNA3.1/HKSV质粒DNA，用限制性内切酶Xba I,

l(pn I双酶切。反应产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收3. 7kb

H'/K+ATPase亚基启动子//SV40T基因片断，用于显微基因注射。

2.准备结扎雄鼠、供体雌鼠、假孕雌鼠等实验动物，采集受精卵，进行受精卵

雄原核的显微基因注射，将注射后形态良好的胚胎移植到假孕雌鼠输卵管中。

三、特异性表达SV40T基因转基因小鼠的鉴定与繁殖

1. PCR检测转基因阳性首建鼠与Fl代仔鼠:剪取出生仔鼠尾尖，提取基因组DNA,

PCR扩增鉴定转基因阳性首建鼠与F1代仔鼠。

2. Southern blot检测F1代转基因阳性鼠:取PCR检测阳性F1代鼠的肝组织，提

取基因组DNA, Southern blot鉴定转基因阳性F1代仔鼠。

3. RT-PCR检测SV40T mRNA的表达:Trizol试剂盒提取68"首建鼠、未转基因B6阴

性鼠胃及转基因阳性鼠胃、食管、十二指肠、盲肠、空肠、肝脏、心脏、肺、

肾、脾、骨骼肌等组织的RNA，进行逆转录PCR，检测SV40T mRNA的表达。

4.免疫组化检测SV40T蛋白表达:取F1代阳性鼠与未转基因B6阴性鼠胃、食管、

十二指肠、盲肠、小肠、肝脏、心脏、肺、肾、脾等组织进行石蜡包埋与常