α–淀粉酶活力测定

α-淀粉酶酶活力测定实验(碘比色法)

酶活力测定的定义（碘比色法——目视）
酶活力定义：在60℃下1小时内将1克淀粉转化为糊精的酶量称一个酶活力单位（5~10分钟反应完成）。计算公式：
60 48 N 酶活力单位 20 2% N 0.5 ( / mL) t t
ｔ——为反应达到终点需要的时间（分钟），要求反应时间在5~10内完成
酶活力测定的方法
碘比色法（有相应的国家标准）在一定反应条件下，1小时转化1g淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位 3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位注意：去除β-淀粉酶的干扰医学上的一些测定方法（专用试剂盒，通过生化仪器反应测定，需要微量快速）
标准终点色溶液
1、第一种标准终点色溶液取1mL标准糊精液和3mL标准稀碘液混合。 2、第二种标准终点色溶液 A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O） 40.2493g和重铬酸钾（K2CrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml。 B液：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml。同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。混合液在15天内使用有效。
酶活力的测定方法（两类）：单位时间内底物的减少量或产物的增加量反应完一定量底物的时间长短
淀粉酶的基本情况介绍 ——四大类
酶名别名
作用键类型作用键位置水解键长度跨越分支产物水解限度
α -淀粉酶
淀粉-1，4-糊精苷酶、液化酶 α -1，4 键内>键端 2或6糖单位跨越麦芽糖、糊精 30%-90%
Ｎ——为酶的稀释倍数（控制反应时间）
酶活力测定步骤
发酵液（酶液） 2%淀粉液20mL+5mLpH6.0缓冲液预热5min（60℃）预热5min（60℃）

α–淀粉酶活力测定[辅导]

α–淀粉酶活力测定----目视碘比色法一实验目的1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。

2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。

二、实验原理比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。

酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。

1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。

这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。

淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精（7分子以下）、麦芽糖不显色。

通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。

碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。

三、实验操作1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。

2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。

3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。

4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。

5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。

6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。

四、酶活性计算实验注意事项：（1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。

（2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。

（3）应时间大约在10-15分钟。

实验二十一固定化α-淀粉酶及活性测定

PART C 酶工程实验实验二十一固定化α-淀粉酶及活性测定一、实验目的和原理目的：学会交联法制备固定化酶的操作技术内容：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。

交联剂为戊二醛，载体为甲壳素。

二、实验器材1．恒温水浴锅2．恒温振摇仪三、实验试剂1. 5%戊二醛2. 甲壳素3. 碘原液：称取碘1.1g。

碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。

再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至50ml。

摇均后放于棕色试管中备用。

4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。

5. 2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。

然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。

6. pH6磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。

7. 标准终点色溶液，A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2493g和重洛酸钾（K2GrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml.B液:：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml.同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。

混合液在15天内使用有效。

四、实验操作（一）酶液的制备精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。

将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。

最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。

实验一 α-淀粉酶活力的测定

1. 结果要取平均值，并以标准差表示实验结果。 2. 要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或
颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里。
[实验报告书书写要求]
1. 实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。 2. 即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、
酶活力单位（g/ml）=(60/T×20×2%×N)÷0.5
60 —酶活定义中反应时间为60min； T —反应时间（min）； 20 —可溶性淀粉的毫升数； 2% —可溶性淀粉浓度； N —酶液稀释倍数； 0.5 —测定时所用的稀酶液量（ml）。
表 1 α-淀粉酶活力测定结果
X
[实验结果处理要求]
酶活力单位gml60t202n05实验结果计算实验结果计算重复数反应时间min酶活力gmlmin要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或颜色变化终点要照像并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里
实验一 α-淀粉酶活力的测定
[实验性质] 验证性实验 [实验学时] 2学时 [实验目的] (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理；
[实验步骤]
第一步：待测酶液的配制；第二步：标准色的配制；第三步：样品的酶解反应；第四步：计算。
1. 待测酶液的制备
α-淀粉酶
1.000 g
①
50 mL
2. 标准色的配制
150mL
60℃,30 min
250 mL

③可溶性淀粉 2.0g
酶液
2%淀粉液
A液
②
B液
8.0 mL 1.0 mL
3. 样品测定步骤
中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词、前言、材料与方法、结果与讨论、结论、参考文献等顺序。 2. 报告书的篇幅要求2000字以上。 3. 参考文献必须5篇以上，并至少有一篇英文。 4. 提交时间限为每周一下午3点。先交到课代表，由课代表汇总之后按时送到任课老师办公室。 5. 领取的报告书要妥善保管，期末考试时作参考。

二、α-淀粉酶活力的测定2010(精)

于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度值（A）
根据吸光度表C1，查得所测酶液的酶活力
5.1.3 计算酶活力
X=c×n
其中：X—样品的酶活力，单位为u/g c—测试酶液的酶活力，单位为u/g n—样品的稀释倍数
5.3 注意事项
✓ 酶反应时间应准确计算。 ✓ 试剂加入按规定顺序进行。
6.实验报告
✓ 记时器
每组 1台
3.2 器材（每组）
✓ 15ml大试管10支 ✓ 5ml移液管10支 ✓ 1ml移液管5支 ✓ 10ml移液管10支 ✓ 比色皿1套（4个） ✓ 双蒸水1瓶（50ml） ✓ 洗瓶1个 ✓ 玻璃平皿1套 ✓ 50ml小广口瓶（棕色）2个 ✓ 50ml 容量瓶 1个 ✓ 100ml 容量瓶 1个 ✓ 500ml 试剂瓶2个 ✓ 100ml 试剂瓶2个 ✓ 250ml 三角瓶2个 ✓ 200ml烧杯2个 ✓ 500ml烧杯1个 ✓ 记号笔1支、吸耳球、称量纸、药勺、试管架、
生物技术专业系统实验（四）
——酶（蛋白质）工程实验II
二、α-淀粉酶活力的测定
--国家标准GB 8275-2009
1.目的意义 2.实验原理 3.试剂和溶液 4.仪器和器材 5.实验方法 6.实验报告 7.思考题
1.目的意义
➢ 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的主要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。
➢ 例如，生产葡萄糖需要葡萄糖淀粉酶，但仅有葡萄糖淀粉酶作用，不能液化淀粉溶液，葡萄糖的生成速度非常慢。此时，α淀粉酶的使用就成为必要条件。
➢ α-淀粉酶的活性测定，在理论研究和实际应用中具有重要的意义。
➢ 通过本实验，学习一种测定α淀粉酶酶活力的方法，巩固并熟练分光光度计的使用方法。

DNS法测定α-淀粉酶活力的方法

3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂配制说明
21g 氢氧化钠（先加入溶解）； 182g 酒石酸钾钠（同上）； 6.3g DNS（3，5-二硝基水杨酸），加热完全溶于上述溶液中； 5g 重蒸苯酚（冷却后加入）； 5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）；完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越长越稳定。引自：朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城，袁厚积编著．生物化学实验．上海：上海科学技术出版社，1981．
比酶活力计算
定义：1mg蛋白质的酶活力单位。计算公式：
酶活力单位（U）比酶活力（U / mU/mL）和蛋白质含量（mg/mL）。可以反映样品中酶的纯度。
分光光度计介绍
原理：在一定条件下，遵循朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律组成：光源、单色器（棱镜、光栅）、吸收池、检测器（光电管、光电倍增管、光电二极管阵列）、显示系统
标准曲线法
取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处（通常为λ max），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（ OD）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标作图，得到一通过坐标原点的直线－标准曲线（工作曲线）。理想的标准曲线满足以下条件： 1、至少5个点，一般不超过7个点； 2、2个以上重复值； 3、重复值误差小于5%； 4、点与线的垂直距总和最小；注意：标准曲线不能任意延长！（有一定测定范围）
利用DNS法测定α-淀粉酶活力的方法
目的要求
了解生物学研究中针对糖含量测定的常用方法及相关原理。掌握一般标准曲线制作的意义及要求。掌握DNS比色法测定α-淀粉酶活力的原理、方法及操作步骤。掌握利用EXCEL分析工具库数据分析—— 回归分析，得到回归方程及相关分析结果。
糖的测定方法

淀粉酶、α酶、β酶活力的测定

三、材料、仪器与试剂
(2) 0.1MOL/L PH=5.6的柠檬酸缓冲液A液：(0.1MOL/L柠檬酸)：称取C6H8O7·H2O 21.01克，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液： (0.1MOL/L柠檬酸钠)：称取NA3C6H5O7 · 2H2O 29.41克，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55毫升与B液145毫升混匀，即为0.1MOL/L PH=5.6的柠檬酸缓冲液。 (3)1%淀粉溶液：称取1克淀粉溶于100ML 0.1MOL/L PH=5.6的柠檬酸缓冲液中。
Α-淀粉酶活力的测定
一、实验目的二、实验原理三、材料、仪器与试剂四、操作步骤五、结果处理六、思考题
一、实验目的：
• 学习和掌握测定α-淀粉酶活力的原理和方法
二、实验原理：
总淀粉酶活力测定过程中提取的淀粉酶原液主要包括Α-淀粉酶和Β-淀粉酶两种。两种淀粉酶特性不同，A-淀粉酶不耐酸，在 PH=3.6的环境下以下迅速钝化。 Β 淀粉酶不耐热，在70°C环境下15分钟后就会钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另-种淀粉酶的活力。 • 实验二采用加热的方法钝化Β -淀粉酶，测出A-淀粉酶的活力。 • 实验三采用加酸的方法钝化A-淀粉酶，测出Β -淀粉酶的活力。
四、操作步骤：
1.淀粉酶液的制备：称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm)，置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容到100mL。在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟摇动1次，使其充分提取。取适量在3000r/min转速下离心10min，上清液即为淀粉酶原液，稀释后用于淀粉酶总活力测定(稀释倍数依具体情况而定)。
(2)还原糖测定：将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温。用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀。在分光光度计上(波长540nm)进行比色。

α-淀粉酶活力的测定

α-淀粉酶活力的测定α-淀粉酶活力的测定姓名___学号___ 一、实验目的:1. 掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理及其实验方法。

二、实验原理: α-淀粉酶- 是一种内切酶- 只能水解α-1, 4糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键附近的α-1,4糖苷键- 产物为糊精、低聚糖、麦芽糖和少量葡萄糖α-淀粉酶活力测定的方法1(反应底物: 可溶性淀粉2(反应环境: 60?，pH为6.0，常压。

3(产物: 还原性葡萄糖4(活力测定方法:1)测定还原糖产生速度2)测定淀粉遇碘显色力下降的速度3)测底物粘度下降的进度• 还原糖与黄色的 3,5- 二硝基水杨酸显色反应来测定.• 生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比.• 以每克酶在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小.三、试剂与仪器:1、仪器(1)电子天平(2)容量瓶 100mL(3)试管(4)恒温水浴锅(5)紫外可见分光光度计(6)烧杯 250 mL2(试剂(1)1% 可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉(以绝干计)1. 000g(精确至0.001g，用水调成浆状物(在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。

然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。

此溶液需要当天配制。

(2)0.4mol/L 氢氧化钠: 称取 1.6g 氢氧化钠，溶于少量蒸馏水，定容至100 mL.1(3)磷酸缓冲液(pH6.0): 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)45.23g、柠檬酸(C6H8O7?H2O)8.07g，用水溶解并定容至1000mL。

配好后用pH计校正。

(4)3,5- 二硝基水杨酸:精确称取 1g 3,5- 二硝基水杨酸溶于 20mL 1mol/L 氢氧化钠中,加入 50mL 蒸馏水,再加入 30g 酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水稀释至100mL ,盖紧瓶塞,防止CO2进入.(5)麦芽糖标准液(1mg/ml):称取0.100g麦芽糖,溶于少量蒸馏水,定容至100mL .(6)α-淀粉酶:枯草芽孢杆菌生成，最适pH 5.5-7.5,最适温度 50~70? 四、测定步骤:1. 麦芽糖标准曲线的制作:取25ml刻度试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液(lmg/ml) 0, 0.2, 0.6, 1.0,1.4, 1.8,2.0 ml ,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达 2.0ml ,再各加 3 , 5 -二硝基水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热5min .取出冷却,用蒸馏水稀释至25 m1 .混匀后用分光光度计在520 nm 波长下进行比色,记录吸光度.以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量(mg)为横坐标,绘制标准曲线.2. 待测酶液的制备:称取酶粉0.1g，精确至0.0002g，先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至100mL，摇匀。

实验一α-淀粉酶活力的测定

结果处理与计算
数据处理
根据实验数据，我们计算了酶活力、反应速率等参数。
图表绘制
我们使用图表展示了实验结果，以便更直观地分析数据。
结果分析
酶活力比较
通过比较不同浓度酶液的酶活力，我们可以得出酶活力与酶浓度之间的关系。
反应速率分析
通过分析反应速率，我们可以了解酶促反应的动力学特征。
结论总结
综合以上分析，我们可以得出实验一α-淀粉酶活力测定的结论，并为其应用提供依据。
用紫外可见分光光度计在540nm波长处测定各管的吸光度值。
数据记录与处理
01
记录实验数据，计算α-淀粉酶活力。
02
根据实验数据绘制标准曲线和酶活性曲线。
04
结果分析
数据记录
实验数据
在实验过程中，我们记录了不同浓度酶液处理后的反应时间、温度、pH值等数据。
实验误差
在实验过程中，我们尽量减小误差，如使用精确的测量工具、多次测量取平均值等。
05
实验总结与讨论
实验总结
01
实验原理
本实验通过测定α-淀粉酶催化淀粉水解生成可溶性糖的速率，从而确定
酶活力的大小。
02 03
实验步骤
准确称取适量淀粉和底物溶液，加入试管中，加入适量酶液，在适宜温度下恒温水浴一定时间，然后加入碘液和氢氧化钠溶液终止反应，最后用斐林试剂进行滴定。
实验结果
通过滴定结果计算出α-淀粉酶活力的大小。
DNS溶液
称取3，5-二硝基水杨酸6.3g，溶解于50mL蒸馏水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液 16.8mL，再加入20%酒石酸钾钠溶液10mL和2mol/L硫酸溶液20mL，混合均匀后加热至80℃，不断搅拌，直至溶液呈透明。冷却后用蒸馏水定容至100mL，避光保存。

测定α-淀粉酶活力方法

实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。

二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。

酶催化的反应称为酶促反应。

生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。

能提高酶活力的物质，称为激活剂。

激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。

使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。

氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。

应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。

如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。

酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH 值。

温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。

同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。

食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、M曲霉等微生物产生。

但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。

α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。

α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。

本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。

测定α-淀粉酶活力的方法

实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。

二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。

酶催化的反应称为酶促反应。

生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。

For personal use only in study and research; not for commercial use能提高酶活力的物质，称为激活剂。

激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。

使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。

氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。

应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。

如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。

酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。

温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。

同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。

食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。

但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。

α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。

α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。

淀粉酶活的测定

α－淀粉酶活力的测定一、实验目的通过本实验，使学生掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。

二、实验原理α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。

三、实验试剂和仪器（一）试剂1. 原碘液称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

2. 稀碘液吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。

3. 20g／L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆状物．在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。

然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。

此溶液需要当天配制。

注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。

4. 磷酸缓冲液（pH6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。

配好后用pH计校正。

（二）仪器1. 分光光度计应符合GB 9721的有关规定2. 秒表3. 恒温水浴（60±0.2）℃4. 试管25mm×2000mm四、实验步骤1. 待测酶液的制备称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU／mL范围内），摇匀。

通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

2. 测定（1）吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于（60±0.2）℃恒温水浴中预热5min。

α-淀粉酶(α-AL)活性检测试剂盒说明书微量法

α-淀粉酶（α-AL）活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号：BC0615规格：100T/48S产品内容：试剂一：液体20mL×1瓶，室温保存。

若有黄色晶体析出，可适当加热溶解后再用。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。

临用前加入10mL蒸馏水，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解。

标准品：粉剂×1支，10mg无水葡萄糖，临用前加1mL蒸馏水，配成10mg/mL葡萄糖标准液。

产品说明：淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。

α-AL(EC 3.2.1.1)随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。

淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在540nm有吸收峰；通过测定540nm吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。

α-AL耐热，但是β-淀粉酶可在70℃钝化15min。

因此粗酶液经过70℃钝化15min，就只有α-AL能够催化淀粉水解。

需自备的仪器和用品：酶标仪或可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96孔板/微量比色皿、研钵和蒸馏水。

操作步骤：一、粗酶液提取：称取约0.1g样本，加0.8mL蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取15min，每隔5min振荡1次，使其充分提取；6000g，室温离心10min，吸取上清液并且加蒸馏水定容至10mL，摇匀，即为淀粉酶原液。

二、测定步骤和加样表（在EP管中依次加入下列试剂）：1、分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，蒸馏水调零。

2、将葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078和0.0039mg/mL的标准溶液。

3、按操作表依次加入各试剂：试剂（μL）对照管测定管标准管空白管α-淀粉酶原液7575--蒸馏水---75标准溶液（mg/mL）--75-70℃水浴15min左右，冷却试剂一150---将以上对照管、测定管和试剂二置于40℃恒温水浴中保温10min左右试剂二75757575在40℃恒温水浴中准确保温5min试剂一-150150150混匀，90℃水浴10min，取200μL至96孔板或微量比色皿中，540nm处读取对照管、测定管、标准管、空白管的吸光度，分别记为A对照、A测定、A标准和A空白，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。

α-淀粉酶检测操作规程

α-淀粉酶活力检测操作规程1酶活定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），于60℃、pH=6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。

2原理在一定温度和PH值条件下，α-淀粉酶将淀粉分子链中的α-1，4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。

3仪器和设备3.1 分析天平：感量0.0001g3.2 精密pH计：精确至0.013.3 分光光度计：应符合GB9721有关规定3.4 电热恒温水浴锅：30～100℃，±0.2℃3.5 计时器：每小时误差不超过5秒4试剂与溶液4.1 原碘液：称取碘（I2）11g、碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

4.2 稀碘液：吸取原碘液2.00ml，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。

4.3 20g/L可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉2.000g，精确至0.001g，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，然后，以30ml水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。

此溶液需要当天配置。

4.4 磷酸缓冲液（pH=6.0）称取磷酸氢二钠（Na2PO4·12H2O）45.03g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，使水溶解并定容至1000mL。

配好后用pH计校正。

5 分析步骤5.1待测酶液的制备：称取酶粉1 g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mlL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上请液小心倾入容量瓶，沉渣部分在加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入100mL容量瓶中，用缓冲液定容到刻度（将估计酶活力除以4，即酶活理应在3.7～5.6u/mL范围内），摇匀，通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

α-和β-淀粉酶活性的测定

α-和β-淀粉酶活性的测定α-淀粉酶能将淀粉分子的α-1.4糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精及少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。

β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末段分解2个葡萄糖单位的α-1.4糖苷键生成麦芽糖。

因此可用DNS法测定溶液中还原糖的含量。

1.仪器设备分光光度计、恒温水浴等。

2.操作方法1）粗酶液制备取新鲜植物材料10g，洗净、剪碎，按1：2（w/v）比例加20ml0.1mol/L NaAc缓冲液（含6mmol/L CaCl2，pH5.0）及少量石英砂研磨，一层尼龙布过滤。

滤液在20000r/min离心20min，取上清液用10mmol/L NaAc缓冲液透析。

过夜后用20000r/min离心10min，取上清液定容，备用。

2）绘制β-极限糊精标准曲线称取100mgβ-极限糊精，加少量水调成糊状，倾入10ml沸蒸馏水，不断的搅拌、加热，煮至透明。

流水冷却后定容至10ml，即每毫升含10mgβ-极限糊精。

取25～200μlβ-极限糊精（0.25～2.0mg）加水定容至0.5ml，再加5.0ml0.01%I2-KI溶液于560nm处测定其光密度（OD）值。

以光密度为纵坐标，β-极限糊精含量为横坐标绘制β-极限糊精标准曲线。

3.α-淀粉酶活力测定（植物生理学通讯，1986，4：63）取0.1~0.5ml粗酶液（相当于含0.1～0.2g鲜重），加0.5mlβ-极限糊精，加10mmol/L NaAc缓冲液定容至1.0ml，摇匀后在30℃保温。

隔不同时间取0.1ml反应液加5.0ml0.01%的I2-KI试剂，0.4ml H2O，摇匀后在560nm处测其光密度。

按OD值查标准曲线。

计算单位为：mgβ-极限糊精降解/g（鲜重）·h。

4.β-淀粉酶活力的测定（麦芽糖浆生产工艺，上海市轻工业局科技情报研究所出版1989,171)。

1)酶反应在具塞试管中加5ml2%可溶性淀粉，1ml0.1mol/L NaAc（pH5.0）缓冲液，3.9ml H2O，在37℃预热5min，加0.1ml酶液，保温30min后煮沸10min。

淀粉酶活力的测定

淀粉酶活力测定一、实验目的以所筛选出的芽孢杆菌为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。

通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。

通过本实验要掌握测定酶活的方法。

二、实验原理淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖与DNS试剂共热呈阳性反应，产生红棕色；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。

通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。

酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。

本实验是以一定量的淀粉酶液，于37°C、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。

这里规定，一个淀粉酶活力单位定义为在37°C、pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需的酶量。

三、实验材料及设备1、筛选出来的产淀粉酶芽孢杆菌。

2、菌种：从商丘师院土壤中分离出的产淀粉酶的芽孢杆菌3、种子培养基：蛋白胨1 % ,酵母浸出物0. 5 % ,氯化钠1 % , pH自然4、发酵培养基：按正交试验所选的最佳方案来配置5、仪器：控温摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、分光光度计、烧杯、玻璃棒、锥形瓶、离心机、刻度试管：25mL×4、容量瓶： 100mL×1、烧杯：250mL×1、滴管 2支、洗耳球2支、洗瓶、试管架、移液管架、移液管、玻棒：各1支四、试剂的配制1、培养基的配制按上述配方称量、溶解、灭菌2、淀粉溶液（0.5%）称取5g可溶性淀粉，溶于1000mL热水中。

实验一α淀粉酶活力测定

1. 结果要取平均值，并以标准差表示实验结果。 2. 要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或
颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里。
[实验报告书书写要求]
1. 实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。 2. 即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、
缓冲液
④
5 mL
淀粉液
20 mL
混合液
2.0 mL
⑥
酶液
0.5 mL
50mL
10 mL 溶解
煮沸
冷却 100 mL
30 s
⑦
60 s
⑤
1. 5 mL
碘液
90 s 120 s
0.5 mL
60℃ 60℃,5 min
60℃
180 s 210 s
[实验结果计算]
α-淀粉酶活力
1 g酶粉(或l mL酶液)在60℃、pH6.0条件下，以1 h(60 min) 液化可溶性淀粉的克数(或毫克数)为1酶活力单位，即1IU，单位为可溶性淀粉量(g) /mL·min。
[器皿及耗材]
[试剂配制]
(1) 原碘液称取分析纯结晶碘ll g，分析纯碘化钾22 g。先用少量蒸馏水使碘化钾完全溶解，再溶解结晶碘，最后用蒸馏水定容至500 mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。 (2) 稀碘液取原碘液2 mL，加碘化钾20 g，加蒸馏水溶解定容至500 mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。 (3) 0.02 mol/L磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲溶液(pH6.0) 称取磷酸氢二钠45.23 g和柠檬酸8.07 g，用蒸馏水溶解定容至1000 mL，配好后应以酸度计校正pH值为6.0，置试剂瓶冷藏。 (4) 标准终点色溶液 A液：称取分析纯氯化钴12.0732 ｇ和分析纯重铬酸钾0.1463 g，以蒸馏水溶解定容至150 mL，置250mL试剂瓶暗藏。 B液：称取络黑T 8.0000 mg，以蒸馏水溶解定容至100 mL，置250 mL试剂瓶暗藏。

α-淀粉酶酶活力测定实验(碘比色法)