基因工程：第四章-酵母基因工程

YEp质粒：
复制子：源自2质粒；
拷贝数：50-100；
不稳定：培养几代后 ，质粒丢失率高达 50-70%，主要由于 分配不均匀所致。
YRp质粒：
复制子：源自酵母染色体的ARS；
（二）酵母菌的宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
1、用作模式真核生物的酵母宿主菌
酿酒酵母(Saccharomyces cereviasiae)：
无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、 真核生物； 繁殖方式与原核类似，易于操作； 基因表达调控机理与高等真核类似。
2、用于外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：
最成熟的真核细胞表达系统； 表达水平低； 产物过度糖基化。
甲醇酵母：
巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris) 多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)
特点：
可利用甲醇作为唯一碳源； 表达水平高； 产物糖基化更合理。
其它酵母：
已有60多种酵母菌建立了转化系统。 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) 非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)
酿酒酵母的遗传学和分子生物学 研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达 外源基因最理想。
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因
表达。 UBI4突变株能正常生长，但细胞内游离
泛素分子的浓度比野生株低得多，是外源基 因表达的理想受体。
UBA1缺陷型：
UBA1编码泛素激活酶E1，是一种看 家基因。
UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，且能削弱泛素介 导的蛋白降解。
3、提高外源蛋白表达产率的突变宿主菌
能提高外源基因表达或分泌的突变类型
突变类型 生物效应 ssc1 改善外源蛋白分泌 ssc2 提高外源基因表达 rgr1 提高外源基因表达 ose1 提高外源基因表达 ssc11 改善外源蛋白分泌 rho 提高外源基因表达
作用位点 钙离子依赖型ATP酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
野生型质粒：2质粒（酿酒酵母） 人工构建质粒：
酵母附加型质粒（YEp） 酵母复制型质粒（YRp） 酵母着丝粒质粒（YCp) 酵母人工染色体（YAC） 酵母整合型质粒（YIp）
除酵母外，其它几种酵母的细胞内也 含有野生型的相似质粒。
结合酵母属：pSR1、pSB1、pSB2 克鲁维酵母属：pKD1
酿酒酵母中的2环状质粒：
野生型，双链、环状， 6318bp，拷贝数50-100。 RAF
STB
IRs: 反向重复序列，同源重组 FLP: 编码产物驱动IRs同源重组
REP1
FLP
IR
A ori IR
REP2
同源重组
REP: 编码产物控制质粒稳定性
B
STB: REP结合位点
人工构建酵母质粒的共同特点： 含有E.coli质粒复制起点，便于克隆操作； 含有多个单一酶切位点，便于克隆操作； 含有在酵母和E.coli中进行选择的双标记； 除YIp型质粒外均为穿梭载体。
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
如： rho突变株中人溶菌酶表达量提高10倍。
4、抑制超糖基化的突变宿主菌
酵母菌普遍拥有蛋白质糖基化系统， 但野生型酵母菌对外源蛋白的糖基化反应 很难控制，呈超糖基化倾向。
措施：构建超糖基化缺陷突变株。
抑制超糖基化的突变类型
突变类型
生物效应
mnn
甘露糖生物合成缺陷
alg
Asn侧链糖基化缺陷
och
外侧糖百度文库添加缺陷
如：人1-抗胰蛋白酶、人tPA在酿酒酵母 mnn9和och1突变株中高活性表达。
5、减少泛素依赖型蛋白降解的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白 Lys HOOC
泛素 76aa
泛素连接酶E3
靶蛋白 Lys 泛素连接酶E3
靶蛋白 Lys
蛋白 酶体
靶蛋白降解 泛素释放
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因：
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
1981 Hitzeman用酿酒酵母成功表达人IFN。
1983 我国首次用酵母菌表达HBV HBsAg基因。
1996 完成第一个真核生物--酿酒酵母全基因组测序。
（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征
酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
如果说E.coli是外源基因最成熟的 原核生物表达系统，Yeast则是最成熟 的真核生物表达系统。
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。