实验室操作手册

1微生物鉴定

1.1 显微镜相关操作

1.1.1 简单染色

实验步骤：

涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴蒸馏水，用接种环取菌涂在载玻片上，做成菌悬液。

晾干：让载玻片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用火缓慢烘干。

固定：拿住载玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。染色：将固定过的载玻片加复红染色1～2min。

水洗：用蒸馏水洗去载玻片上的染色液。

干燥：将载玻片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

镜检：先用低倍镜观察，再切换到高倍镜观察，并在找到视野后，将高倍镜转出，在载玻片上加入一滴香柏油，将油镜浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

1.1.2 革兰氏染色

实验步骤：

涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴蒸馏水，用接种环取菌涂在载玻片上，做成菌悬液。

晾干：让载玻片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用火缓慢烘干。

固定：拿住载玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。结晶紫染色：在载玻片上加适量（盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min。水洗：用蒸馏水洗去结晶紫染液。

媒染：滴加碘液，媒染1min。

水洗：用蒸馏水洗去碘液。

脱色：将载玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。复染：滴加番红复染5min。

水洗：用蒸馏水洗去番红染液。

晾干：将染色好的载玻片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

镜检：先用低倍镜观察，再切换到高倍镜观察，并在找到视野后，将高倍镜转出，在载玻片上加入一滴香柏油，将油镜浸入油滴中仔细调焦观察细菌的革兰氏染色反应性。

1.1.3 扫描电镜样品制备

取材：选取培养良好的微生物菌液约5～7mL。分装到1mL离心管中，12000rpm 离心5min，弃置上清液，收集菌体。

清洗：用PBS缓冲液（pH=7.2）清洗菌体，12000rpm离心5min，弃置上清液，收集菌体，重复5～7次，确保菌液中没有残留培养基。

固定：常用固定剂有 2.5%戊二醛，1%四氧化锇。在4℃下固定一晚上。次日用PBS缓冲液（pH=7.2）清洗样品。

脱水：用40%、70%、90%和100%的乙醇分别依次脱水，每次15min。经脱水后的样品应马上干燥，若无法进行干燥操作，应当将脱水后的样品放置在－80℃冰箱中保存。

干燥：菌体样品一般采用真空冷冻干燥法、临界点干燥法对菌体进行干燥处理。镀膜：将菌体样品放在真空镀膜机内，把金喷镀到样品表面后。镀膜完成后取出样品制备完毕。

1.1.4 透射电镜样品制备

超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术,广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。

样品制备步骤：

取材：选取培养良好的微生物菌液约5～7mL。分装到1mL离心管中，12000rpm 离心5min，弃置上清液，收集菌体。

清洗：用PBS缓冲液（pH=7.2）清洗菌体，12000rpm离心5min，弃置上清液，

收集菌体，重复5～7次，确保菌液中没有残留培养基。

前固定：将菌体样品浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液，离心沉淀后送到电镜平台（农业微生物学国家重点实验室C座1楼），由平台工作人员负责抽真空和块状处理。

注意：泡在2.5％戊二醛固定液的菌体材料最多可以放2周。

漂洗：用PBS缓冲液（pH= 7.2）冲洗3次，每次15mins。

后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。真菌、细菌一般处理2h。

注意事项：a，锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。b，锇酸比较昂贵，需特别节约使用。

漂洗：用PBS缓冲液（pH= 7.2）冲洗3次，每次15mins。

脱水：室温下，依次用30％，50％，70％，80％，90％丙酮作用30mins，再用100%纯丙酮脱水3次，每次30mins。

渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入细胞内。植物样品需要的渗透梯度多、渗透时间长。其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以水稻叶片为例，其渗透流程如下：

a, 无水丙酮/包埋剂＝5：1作用12h;

b, 无水丙酮/包埋剂＝3：1作用12h;

c, 无水丙酮/包埋剂＝1：1作用12h;

d, 无水丙酮/包埋剂＝1：3作用12h;

e, 无水丙酮/包埋剂＝1：5作用12h;

f, 纯包埋剂45℃作用12h。

注意事项：包埋剂为强致癌剂，特别要注意规范操作！

包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45℃聚合12h，60℃聚合36～48h。超薄切片：在超薄切片机上进行超薄切片，切片面积最大不能超过0.5mm×0.3mm。

正染色：超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟；去二氧化碳的双蒸水清洗3次；醋酸铀染色30分钟；双蒸水清洗3次；等超薄切片干燥后，即可上透射电镜观察。注意事项：a，醋酸铀具有放射性，使用时要特别注意。b，柠檬酸铅染液极易和空气中的二氧化碳反应形成不溶解的黑色颗粒，污染切片。柠檬酸铅染液一定要

现用现配，所用的双蒸水一定要煮沸除去二氧化碳。c，由于染色不可控制因素较多，产生污染的几率有40％，所以每个样品的切片一定要留出铜网作备份。

1.1.5 相差显微镜样品制备

实验步骤：

涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴蒸馏水，取少量菌体涂在载玻片上，做成菌悬液。

盖片：盖上盖玻片，确保无起泡产生。用吸水纸吸去周围多余水分，制片完成。

1.2 16s rRNA检测

实验步骤：

提取菌体总DNA。

利用16S rRNA通用引物用PCR扩增出其16S rRNA。

取出部分扩增产物进行跑胶验证，测试其纯度与大小，一般目的基因是1500bp 左右。

将其余部分扩增产物送去基因测序公司测序，把测序后的16S rRNA目的序列拿到NCBI上进行序列搜索，就可以大致上知道该菌体和什么细菌亲缘关系较近。

1.3 G+C mol%测定

实验步骤：

提取待测菌体和E.coli K-12的DNA，并分别用0.1×SSC溶液溶解并稀释，使测定用DNA的最终浓度为A260nm = 0.15~0.30，纯度为A260：A280：A230 ≥ 1：0.515：0.450。

将待测菌体的DNA和参比菌株E.coli K-12的DNA分别装入两只石英比色杯中，比色杯塞好带有热敏电阻探头温度计的塞子，另一带塞子的石英比色杯装入0.1×SSC作空白对照。

比色杯放入带有加热装置的分光光度计比色架内，将固定波长设定为260nm。

迅速将比色杯内的温度上升到50℃左右，取出比色杯检查有无气泡，如有气泡