甲醛滴定法测定氨基氮
甲醛滴定法测定食品中的氨基酸酸含量
食品中氨基酸含量的测定————甲醛滴定法一、原理氨基酸是具有氨基和羧基的氨基酸，在溶液中以两性离子形态存在，当向溶液中加入碱时，氨基上的氢离子解离出来与羟基结合生成水。
使溶液ph不会急剧上升，但当氨基上的氢离子全部解离时则溶液的pH急剧上升，氨基上氢离子的解离常数值通常在9以上，滴定终点pH在12以上，没有适当的指示剂，为此，可用甲醛与氨基酸作用，氨基上的两个氢原子被甲醛取代生成氨基酸的二羟甲基衍生物。
由于氨基上的氢被取代，氨基上氢离子的解离常数降至7左右，滴定终点pH在9左右，这样就可以用酚酞做指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定氨基上的氢离子。
此法滴定的是α-氨基的含量，准确度仅达氨基酸理论含量的90%。
二、材料仪器与试剂1、材料：白豆油或浅色饮料，色深样品需进行脱色处理2、仪器：锥形瓶、滴定管、10ml量筒和移液管，20ml量筒或移液管，100ml 容量瓶。
3、试剂：中性甲醛，酚酞指示剂（0.5%）（0.5克酚酞定容100毫升），0.01N 氢氧化钠溶液。
三、操作步骤1、制样：根据样品颜色及氨基酸含量将样品进行适当稀释，一般吸取20ml样品，稀释定容到100m l。
色泽深的样品先加入50ml水和活性炭5g，加热煮沸，过滤，用30ml水洗涤活性炭，洗涤水与滤液合并，然后转移至100ml容量瓶中定容至刻度。
固体样品需粉碎后称取5~10g，加50ml水和活性炭5g，加热煮沸，过滤，用30ml水洗涤活性炭，洗涤水与滤液合并，然后转移至100ml容量瓶中定容至刻度。
2、测定：准确吸取已稀释的样品溶液10ml于三角瓶中，加入10ml中性甲醛，滴加2~3滴酚酞指示剂，用0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定至溶液呈微红，30秒不褪色（8.2～10.0）即为终点。
3、空白滴定：用去除二氧化碳的蒸馏水替代样品进行滴定。
四、计算氨基氮（mg/ml或g样品）=[（V-V O）×C×0.14008]/10×100M或VC----氢氧化钠的当量浓度V-----滴定样品时消耗的氢氧化钠溶液的体积（ml）V O------滴定空白时消耗的氢氧化钠溶液的体积（ml）0.14008----氮的毫克当量。
氨基氮含量的测定—甲醛滴定法
氨基氮含量的测定—甲醛滴定法中性甲醛制备：量取200ml甲醛溶液至400ml烧杯中，用磁力搅拌器搅拌，边搅边用0.1mol/LNaOH溶液滴定至pH8.1。
取样品处理液1.0mL置于200mL烧杯中，加64mL去CO2水，开动磁力搅拌器，用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液滴定至pH8.2；加入20.0mL中性甲醛溶液，摇匀。
再用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积V l；取65ml水先用0.1mol／L氢氧化钠溶液调至pH 8.2，再加入20.0mL中性甲醛溶液，用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液滴定至pH 9.2，作为试剂空白试验。
按照下列公式计算：氨基酸态氮(g／L) =(V1-V0)×C×1.4/V式中：V1——测定样品加入甲醛后消耗0.1mol／L Na0H溶液的体积(m1)；V o——测定空白加入甲醛后消耗Na0H标准溶液的体积(m1)；C——标定的氢氧化钠标准溶液物质的量浓度[C(NaOH)](mol／L)；V——样品体积(m1)；0.014——C(NaOH)=lmol／L氢氧化钠标准溶液lmL相当的氮克数。
方法来自：赵新淮，冯志彪。
蛋白质水解物水解度的测定。
食品科学，1994,11公式来自：徐鑫，何佳易。
小黄鱼抗氧化肽制备条件的响应面优化。
食品科学，2011,32（21）：165—170。
标准NaOH溶液的配制：称取110克氢氧化钠，溶于100毫升去二氧化碳的水中，置于300毫升锥形瓶中，不时振荡，溶解后用橡皮塞塞紧并静置数日直到碳酸钠全部沉到底部时，倾出上面清澈液备用。
取以上氢氧化钠浓溶液5.5毫升，加水至1000毫升，混匀，制成0.1mol/l氢氧化钠溶液。
标准氢氧化钠浓溶液的标定：准确称取水解度=游离氨基酸/总氮×100﹪。
关于氨基酸的定量分析
• 再在冰浴中冷却3 min 以上,加碘化钾5mL , 立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定至淡 黄色,加入淀粉溶液2 mL ,继续滴定至蓝色 消失为终点,同时做空白试验。
x(v1 v2)c0.02403100 m 25 100
有吸收的衍生试剂。该方法的基本原理是 经阳离子交换柱分离出的氨基酸与茚三酮 混合,经加热反应后,一级胺与之生成蓝紫 色化合物,二级胺与之生成黄色化合物。两 种衍生物使用双通道紫外检测器同步检测, 检测波长分别为570nm 和436nm。
C OH
C
C
OH
O
茚三酮
O
C OH
C
C
OH
O
COOH
H 3N
C
关于氨基酸的定量分析
氨基酸的分析方法
化学分析法——甲醛滴定法 甲醛滴定法用于氨基氮的
测定, 可以测出样品中总氨基酸 的含量,其原理是在中性或弱碱 性水溶液中,氨基酸的α—氨基与醛类反应生成
Schiff碱:α—氨基酸与甲醛反应生成亚 甲基亚氨基衍生物
H
R C C O O
N H 3
H C H O
O H
H
பைடு நூலகம்
R
O
C OH
C
C
H
NH3
CO2
O
O
C OH C
C OH
O
O C
C C O
O
C
NC
H
C
O
紫色化合物
RCHO
H
O C
CN C O
亮黄色化合物
甲醛滴定法测定溶液中的氨基酸含量
甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、1%酚酞酒精溶液称1g酚酞溶于100ml 95%酒精中。
2、%溴麝香草酚蓝溶液取溴麝香草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、氨基酸溶液4、标准L 氢氧化钠溶液5、中性甲醛溶液取甲醛溶液50ml，加1%酚酞指示剂2滴，滴加L NaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管3、移液管洗耳球4、天平5、容量瓶6、试剂瓶7、量筒8、玻棒与烧杯四、操作步骤1、取3只50ml锥形瓶，按下表加入试剂。
2、混匀后用标准L氢氧化钠溶液滴定至紫色（~）3、结果计算氨基酸溶液中含氨基酸的百分比浓度为C=（V1-V2）×C0×氨基酸分子量/（10×V样）式中：C：总酸含量（g/100ml）V1为滴定样品消耗标准氢氧化钠的体积（ml）；V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）；C0：标准氢氧化钠准确浓度(mol/L)V样：样品体积(ml)4 、氢氧化钠标准溶液的标定五、注意事项（1）利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
（2）氨与甲醛反应方程①铵根与甲醛反应生成六次甲基四胺盐及强酸：（氨的部分电离产生少量铵根，但由第二个反应大量消耗铵根后，氨电离方程就强烈地偏向右边了）②反应生成的六次甲基四胺盐及3个氢离子都可以跟碱反应，而溶液中正好有还未反应的氨水，因而第二个反应，中和反应发生(CH2)6N4H+ + NH3 = (CH2)6N4 + NH4+H++NH3=NH4+这第二组反应就是一个释放出中和热的过程，所以溶液就热起来。
甲醛滴定法测定溶液中的氨基酸含量演示教学
甲醛滴定法测定溶液中的氨基酸含量甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的一N+H3结合，形成一NH —CH2OH、一N（CH2—OH）2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+,测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、1%酚酞酒精溶液称1g酚酞溶于100ml 95%酒精中。
2、0.5%溴麝香草酚蓝溶液取0.5溴麝香草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、氨基酸溶液4、标准0.100mol/L氢氧化钠溶液5、中性甲醛溶液取甲醛溶液50ml，加1%酚酞指示剂2滴，滴加0.1mol/L NaOH 溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管3、移液管洗耳球4天平5、容量瓶6试剂瓶7、量筒8玻棒与烧杯四、操作步骤、混匀后用标准氢氧化钠溶液滴定至紫色(pH8.7~9.0)3、结果计算氨基酸溶液中含氨基酸的百分比浓度为C= （V i-V2）x C o X氨基酸分子量/ （10W样）式中：C :总酸含量（g/100ml）V i为滴定样品消耗标准氢氧化钠的体积（ml）;V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）;C o：标准氢氧化钠准确浓度（mol/L）V样：样品体积（ml）4、氢氧化钠标准溶液的标定4 i4.1 I IK懈取1 于io®沱i' 側的水中摆匀准人聚乙娇容器中理用敖賢竜常械清益 竝1削規魚聰料骨瞬上层静厨无二砒段射解至M 伽L.舶. +X JiOS 标框炳JE 附质国戡度肌WOH ）」」（欣I;U151 0.5 27 0.15,411.2标定2于IO5C-l ：0r 电也箱中+甥至恆重的工作塞准试期菲苯二印翳勿輒削无二氫It 碳的水常解旳2掃酎散指*釈10祸）用圧制好的氢軋化的裁陵稱定至諮液30 s*同时齢白试執站：用-紳二甲卿帥质鼬IM 数似戦为克妙v的皐飮单位为毫升（讥）：亂祉畴林定尉的 载畫肌WJH ）扒泅/打T 隣踰胖一甲魅剛好邢无二 |[|1T.5so 歆3XSao __—|0J0.7550^XIOOO E 疋)M空白试期統桶辎体积脯仏戦为JHKmLh曲数仏单也为克再庫尔【”mol}[M（KHGHQ）—2必?乩五、注意事项(1) 利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
甲醛滴定法测定氨基氮
实验二甲醛滴定法测定氨基氮一、目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。
二、原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：-NH3是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定-NH3所释放的H ＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使-NH3释放H＋，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（pH9.0左右）。
因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。
如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。
三、仪器、试剂、材料1.仪器25mL锥形瓶；碱式滴定管；吸管。
2.试剂（1）0.1mol/L标准甘氨酸溶液准确称取7.5g 甘氨酸，溶解后定容至1000mL。
（2）0.02mol/L标准氢氧化钠溶液（3）酚酞指示剂(0.5%酚酞乙醇溶液)：取0.5g酚酞，用95％乙醇溶解，并稀释至100mL，无需加水。
（4）400 mL中性甲醛溶液在50mL36～37％分析纯甲醛溶液中加入1mL0.5％酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
四、操作方法1.氢氧化钠溶液标定（1）准确称取0.08g邻苯二甲酸氢钾；（2）用量筒准确量取50mL纯净水，溶解完全；（3）加入2滴酚酞指示剂，（4）用氢氧化钠溶液滴定，记录体积；平行做2次。
（5）求消耗氢氧化钠溶液平均值，用公式计算氢氧化钠溶液浓度。
2.取3个25mL的锥形瓶，编号。
向1、2号瓶内各加入0.05mol/L标准甘氨酸溶液2mL和水5mL，混匀。
向3号瓶内加入7mL水。
然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2mL甲醛溶液再混匀，分别用0.02mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
甲醛滴定法测定氨基氮
甲醛滴定法测定氨基酸含量一、实验目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、实验原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、实验仪器与设备（一）试剂1、0.5%酚酞酒精溶液称0.5g酚酞溶于100ml60%酒精中。
2、0.05%溴麝香草酚蓝溶液取0.05溴麝行草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、1%甘氨酸溶液取1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。
4、标准0.100mol/L 氢氧化钠溶液5、中性甲本醛溶液取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/LnaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管1、移液管洗耳球4、天平5、容量瓶6、试剂瓶7、量筒8、玻棒与烧杯四、实验步骤1、取3只100ml 锥形瓶，按下表加入试剂。
2、混匀后用标准0.100mol/L 氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH8.7~9.0）3、结果计算每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为12() 1.40082V V mg -⨯= 式中：V 1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml ）；V 2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml ）；1.4008 为1ml 0.1mol/L 氢氧化溶液相当的氮量（mg ）五、注意事项利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
氨基态氮的测定
1、双指示甲醛滴定法
（1）原理氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。
它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。
当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。
这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。
（2）方法特点及应用此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。
在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。
普氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高;溶液中若有存在也可与甲醛反应，往往使结果高。
（3）试剂①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。
②0.1%百里酚酞乙醇溶液③0.1%中性红50%乙醇溶液④0.1%mol/L氢氧化钠标准溶液
（4）操作步骤
1）含氨基酸溶液20-30mg→250ml锥形瓶中→中性红指示剂2-3滴，滴0.01mol/lNAOH 滴定终点（红→琥珀色）
2）含氨基酸溶液20-30mg→250ml锥形瓶中→百里红酚酞3滴/中性甲醛20ml→摇匀，滴0.01mol/lNAOH滴定终点（淡蓝色）
3）分别记录两次消耗碱液的用量
（5）结果计算
氨基酸态氮% ＝（v2-v1）*c*0.014/m*100
式中:
c----氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L
V1----中性红指示剂滴定时消耗NaOH标准溶液体积，mL
V2----百里酚酞知己滴定是消耗NaOH标准溶液体积，mL
m-----测定用试样溶液相当于试样的质量，g
0.014----氮的毫摩尔质量，g/mmol。
发酵过程主要生化指标的测定氨基氮测定——甲醛滴定法
• 水溶液中的氨基酸并不是以游离的羧基或 氨基形式存在，而是兼性离子，既是质子 供体（酸），也是质子受体（碱）。
COOH
COO-
COO-
H3N+ C H
H3N+ C H
H2N C H
R
2p左K右1
R
9p左K右2
R
甲醛可与氨基酸上的NH3+结合，生成羟甲基衍生物，释放出H+ R-NH2＋2HCHO→R-N（CH2OH）2
• 为何两种显色剂？
• 6-7.6 溴酚兰变色范围（黄 蓝）
• 7.4-10 酚酞变色范围（无色 粉红）
• 酚酞终点淡红，不易观察，现在变色范 围是从黄色变为紫色，终点为紫色，易 观察。
• 用标准碱液滴定羧基，按标准碱的消耗 量求出氨基酸的含量。碱完全中和羧基 时的pH值约为8.5～9.5。
滴定注意事项：
• 沙伦逊甲醛滴定法(Sorensenformaltitration) 一种测定氨基或氨基氮的方法。氨基酸 分子中含有碱性氨基和酸性羧基，在固 态或水溶液中以双性离子（内盐）存在， 因此不能直接用酸滴定氨基，也不能用 碱滴定羧基。
• 沙伦逊提出了将氨基酸（水溶液）用中 性甲醛水溶液处理，将氨基“隐蔽”后 滴定羧基的方法。
三、大肠杆菌发酵种子的制备
菌种
接种量1-2环
接种量1%
斜面 一级种子 二级种子
30℃，18h ， 4℃长期保存
14h，32℃，
8h，32℃
按学号，4人一组，3组共用一支斜面种子 摇瓶装液量50ml 一级种子种龄在14h±2h内，二级种子7-8h内
时间安排
每一格必须由操作人签名！
一级种子
二级种子
• 甲醛有毒，滴定要快，必要时可戴口罩。 • 现配现滴，滴完盖紧瓶盖。 • 中性甲醛若长时间放置会变酸,滴定前要
实验八甲醛滴定法测定氨基氮
人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。
确指示终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，
使上述平衡右移，促进H+释放使溶液酸度增加，滴定终点移至 酚酞的变色域内（pH9.0左右）。因此可用酚酞做指示剂，用标 准NaOH溶液滴定。
❖ 如果样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定 的结果可算出氨基氮的含量；如样品是多种 氨基酸的混合物，如蛋白质水解液，则滴定 结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简 便快速，常用来测定蛋白质的水解程度。随 水解程度的增加滴定值也增加；滴定值不再 增加时，表示水解作用已完全。
实验八 甲醛滴定法测定氨基氮
一、 目的
❖ 初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理 和操作要点
二、 原理
❖ 氨基酸是两性电解质，在水溶液中存在如下
平衡：
R H3N+ CH
R0
-
COO
K'2
H2N
R CH R-
-
COO
+
H+
-NH3+是弱酸，完全解离时pH为11-12或更高，若用碱滴定-NH3+ 所释放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准
五、结果计算
❖ 甘氨酸氨基氮回收率（%）=实际测得量/加入理论量×100%
❖
=（V标准-V空白）/2×100%
氨基酸总量(氨态氮)的测定(甲醛滴定法)
氨基酸总量(氨态氮)的测定（甲醛滴定法）一、单指示剂甲醛滴定法：(一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。
由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。
当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式可能以下面三种形式存在。
（二）试剂(1) 40%中性甲醛溶液(2) 0.1%麝香草酚酞乙醇溶液。
(3) 0.100N氢氧化钠标准溶液。
(三)操作步骤：称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.100N NaOH溶液滴定至淡蓝色。
加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。
再用0.100NNaOH溶液滴定至淡蓝色。
记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算计算：氨基酸态氮(％)=( N V×0.014×100)/W式中：N：NaOH标准溶液当量浓渡。
V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)W：样品溶液相当样品重量(克)。
0.014：氮的毫克当量。
三、双指示剂甲醛滴定法：(一)原理：与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂。
从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。
PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH 值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。
(二)试剂：(1) 40%中性甲醛溶液(2) 0.1%麝香草酚酞乙醇溶液。
(3) 0.100N氢氧化钠标准溶液。
(4) 0.1%中性红(50%乙醇溶液)(三)操作步骤：取相同的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份加入中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOH溶液滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0.100N NaOH准溶液滴定至淡蓝色。
实验四甲醛滴定法测定氨基氮含量
试剂和器材
1．试剂： （1）0.1mol/L 标准甘氨酸溶液 准确称取750mg甘氨酸，溶解后定容至100mL。 （2）0.1mol/L 标准氢氧化钠溶液 （3）0.5%酚酞指示剂 称0.5g酚酞溶于100mL50%乙醇。 （4）中性甲醛溶液 甲醛溶液（36～37％，分析纯） 50mL，加入0.5％ 酚酞指示剂1 mL ，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴定至 微红，贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。
பைடு நூலகம்
2、氨基氮计算：
( V V ) 1 . 4008 对 未 氨基氮含量（ mg / mL ） 2
公式中： V 未 为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。 V 对 为滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平 均毫升数。
※1.4008
为1mL 0.1mol/L标准氢氧化钠溶液相当于氮的毫克数。
试剂和器材 1．试剂：
（5）待测样品 未知浓度的甘氨酸溶液。
2．器材 ：
100mL锥形瓶、25mL微量滴定管 、吸量管。
实验四甲醛滴定法测定氨基氮含量甲醛滴定法测定氨基氮甲醛滴定法测定氨基酸氨基氮的测定氨基态氮的测定氨基氮测定氨基氮的测定方法氨基态氮测定甲醛滴定法甲醛滴定法测水解度
实验八 甲醛滴定法测定氨基氮含量
一、目的
掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和方法
二、原理
水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直 接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸, 甲醛与氨基结合,可形成羟甲基衍生物，使 NH3+上的H+游离出来，这样就可用碱滴定 NH3+放出的H+，从而计算出氨基氮含量。
四、结果计算
1、回收率计算：
实际测得量 甘氨酸氨基氮回收率 % 100 理论加入量
氨氮和氨基氮测定(甲醛法)
3.2 发酵液中氮含量测定（甲醛法）3.2.1 原理：利用甲醛法测定，测定结果是发酵液中氨基氮和氨氮量的总和。
氨氮：一分子铵盐与甲醛作用，生成环六次甲基四胺及二分子无机酸，后者以标准碱滴定，以此算出氨氮的含量。
氨基氮：氨基酸之氨基与甲醛结合后，使氨基酸之碱性消失，再用标准碱液来滴定羧基，算出氨氮的含量。
化学反应及副反应式如下：2(NH4)2SO4 + 6HCHO (CH2)N4 + 2H2SO4 + 6H2OH2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2OR-CHNH2CHOOH + HCHO RCN-N=CH2CHOOH + H2ON=CH2 N=CH2R C H + NaOH R C H + H2OCOOH COOH3.2.2 仪器和设备25ml滴定管、5ml吸量管、1000ml容量瓶、250ml三角瓶、100ml量筒。
3.2.3 试剂和溶液3.2.3.1 0.03569mol/L氢氧化钠标准溶液：取0.3569mol/L NaOH标准液100ml于1000ml 容量瓶中，加纯化水稀释至刻度摇匀即可。
3.2.3.2中性甲醛：40%甲醛加二倍水稀释，临用前0.03569mol/L NaOH调至微红色，用酚酞作指示剂。
3.2.3.3 0.5%酚酞指示剂：称2.5g酚酞溶于500ml 95%乙醇中，摇匀即可。
3.2.3.4 0.1%甲基红指示剂：称0.1g甲基红溶于100ml 95%乙醇中，摇匀即可。
3.2.4 操作步骤：吸取发酵液滤液(或离心上清液)2.5ml于250ml三角瓶中，加纯化水约50ml，加0.1%甲基红指示剂2-3滴，加1mol/L盐酸1-2滴。
使其成红色，放置3分钟，然后再以0.03569mol/L的NaOH标准溶液调至橙黄色，加入中性甲醛5-10ml，放置10分钟，再加0.5%酚酞指示剂3-5滴。
用0.03569mol/L 的NaOH标准溶液滴定至微红色半分钟不褪色为终点。
甲醛滴定法测定溶液中的氨基酸含量
甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的—N+H3 结合，形成—NH—CH2OH、—N（CH2 —OH）等羟甲基衍生物，使上的H游离出来，这样就可以用碱滴定NH放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、1%酚酞酒精溶液称1g酚酞溶于100ml 95%酒精中。
2、%溴麝香草酚蓝溶液取溴麝香草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、氨基酸溶液4、标准L 氢氧化钠溶液5、中性甲醛溶液取甲醛溶液50ml,加1獅酞指示剂2滴，滴加L NaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶 2 、碱式滴定管3、移液管洗耳球 4 、天平5、容量瓶 6 、试剂瓶7、量筒8 、玻棒与烧杯四、操作步骤1、取3只50ml锥形瓶，按下表加入试剂2、混匀后用标准L氢氧化钠溶液滴定至紫色（~）3、结果计算氨基酸溶液中含氨基酸的百分比浓度为C= (V1-V2)x GX氨基酸分子量/ (10X V样)式中：C :总酸含量(g/100ml)V1为滴定样品消耗标准氢氧化钠的体积( ml)；V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积( ml)；C 0：标准氢氧化钠准确浓度(mol/L)V样：样品体积(ml)4 、氢氧化钠标准溶液的标定4 i 定帝港4.1.1配制屎取IMgSaOtST 100 ml JL- mi 的水中摆匀准人聚乙焼容器中至統 清杀1削規名用塑料骨躲上翩淋用无二砒段射解至M 伽L,播厘*包氧㈱庙駝耶盹度WWOHM 血曲U纺It 胭躺紳V?皿1540. $270.15U4.1-2标定林2側定般于I05J11代电弾中栈至桓重的工作基准试剂孵二甲购輒剧无二 氯It 碳的水落解旳2清酹故指*釈10丽)用朮制好的1［丸化前犁J 稱定至裕液星输虹色冲保荐 30 s ＜同时做空白试轨 ^武札用一淋二甲闕齬的质訓杯数値单也为克側；V —諫化般就删械仏軸为毫升(mL);*一空白网諒化輔就的蘇的数仏軸为勘(mLh«2■卿姊标林定尉的 ftSWKdUHJ^Cmol/L)胖二碑肆的演打"无二 m^WWRVrtiL| [|1 15 800 3 XS S J10J0.7550]魏伽OSOKffi 度［dMOID ］威值鼎滴fl (mol 儿)折凌期1)廿筋HW0H ）二X1000_ ①孑W肘——紳二甲舱傑的躬倾輛数优单也为克W^(i/moD［M(KHQKOi)-M ?2］.五、注意事项(1)利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
双指示剂甲醛滴定法测定氨基酸态氮方法原理
双指示剂甲醛滴定法测定氨基酸态氮方法原理下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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甲醛滴定法测定氨基酸含量
实验4 甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、0.5%酚酞酒精溶液称0.5g酚酞溶于100ml60%酒精中。
2、0.05%溴麝香草酚蓝溶液取0.05溴麝行草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、1%甘氨酸溶液取1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。
4、标准0.100mol/L 氢氧化钠溶液5、中性甲本醛溶液取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/LnaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管1、移液管洗耳球4、天平5、容量瓶6、试剂瓶7、量筒8、玻棒与烧杯四、操作步骤2、混匀后用标准0.100mol/L氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH8.7~9.0）3、结果计算每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为12() 1.40082V V mg -⨯= 式中：V 1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml ）；V 2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml ）；1.4008 为1ml 0.1mol/L 氢氧化溶液相当的氮量（mg ）五、注意事项利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
六、实验报告根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的优缺点。
甲醛滴定法测定氨基酸含量
实验4甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的竣基。
甲醛可与氨基酸上的TOL结合，形成一NH-CHQH、一N(CH L OH)：等疑甲基衍生物，使2乩上的H•游离出来，这样就可以用碱滴定冋3放出测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸(如蛋白质水解液)，测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具(―*)试剂1、％酚酿酒精溶液称酚瞅溶于100ml60%酒精中。
2、％溟麝香草酚蓝溶液取澳麝行草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、1%甘氨酸溶液取lg甘氨酸溶于100ml蒸饰水。
4、标准L氢氧化钠溶液5、中性甲本醛溶液取甲醛溶液50ml,力嗎酚酿指示剂约3ml,滴加LnaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管1、移液管洗耳球4、天平5、容量瓶6、试剂瓶7、量筒8、玻棒与烧杯四、操作步骤1、取3只100ml锥形瓶，按下表加入试剂。
2、混匀后用标准L氢氧化钠溶液滴定至紫色（〜）3、结果计算每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为(V-K)x 1.4008吨= --- ---- "3 -----式中：百为滴定样品消耗氢氧化钠的体积(ml)；也为滴空白消耗氢氧化钠的体积(ml)；为lml L氢氧化溶液相当的氮量(mg)五、注意事项利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
六、实验报告根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的优缺点。
，七、思考题1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么/2、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的一2乩基上的H',不能用一般的酸碱指示剂。
氨基氮检测 甲醛滴定法
氨基氮化验方法（甲醛滴定法）1 原理氨基与中性甲醛反应，生成中强酸，可用氢氧化钠标准溶液滴定。
反应式：4NH4 ＋+ 6HCHO = (CH2)6N4H＋+ 6H2O + 3H＋RCHNH2CH2 + HCHO+ = RCH(NCH2)COOH + H2OOH- + H＋= H2O2 试剂配制2.1 18％中性甲醛溶液：量取分析纯甲醛溶液2000ml于2000ml试剂瓶中，加入2000ml 纯化水，摇匀。
临用前倒入1000ml的试剂瓶中，以酚酞为指示剂，用0.03569mol/l的Na OH溶液滴定至微红色。
2.2 甲基红指示剂：称取0.1g甲基红，用无水乙醇溶解并稀释至100ml。
2.3 酚酞指示剂：称取1.0g酚酞，用无水乙醇溶解并稀释至100ml。
2.4 盐酸(0.1mol/l)、氢氧化钠(0.03569mol/l)标准溶液：略。
3 测定精密量取样品2.50ml至250ml锥形瓶中，加入20ml纯化水，甲基红指示剂3滴，用0.1m ol/l盐酸滴定至红色，放置3min，用0.03569mol/l氢氧化钠溶液滴定至黄色。
加入18%中性甲醛5 ml，摇匀放置3～5min。
加入3滴酚酞指示剂，用0.03569mol/l氢氧化钠标准溶液滴定，到达滴定终点时溶液由黄色变为微红色，记录消耗的氢氧化钠标准溶液体积。
4 计算N(μg/ml)＝M×VNaOH÷V样品×m×1000 ≈ 100VNaOH式中： M 为氢氧化钠标准溶液浓度，mol/l；VNaOH 为滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml；V样品为量取样品的体积，ml； m 为氮原子摩尔质量，14。
氨基酸总量(氨态氮)的测定(甲醛滴定法)
氨基酸总量(氨态氮)的测定（甲醛滴定法）一、单指示剂甲醛滴定法：(一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH 基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。
由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。
当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式可能以下面三种形式存在。
（二）试剂(1) 40%中性甲醛溶液(2) 0.1%麝香草酚酞乙醇溶液。
(3) 0.100N氢氧化钠标准溶液。
(三)操作步骤：称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.100N NaOH溶液滴定至淡蓝色。
加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。
再用0.100N NaOH溶液滴定至淡蓝色。
记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算计算：氨基酸态氮(％)=( N V×0.014×100)/W式中：N：NaOH标准溶液当量浓渡。
V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)W：样品溶液相当样品重量(克)。
0.014：氮的毫克当量。
三、双指示剂甲醛滴定法：(一)原理：与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂。
从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。
PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。
(二)试剂：(1) 40%中性甲醛溶液(2) 0.1%麝香草酚酞乙醇溶液。
(3) 0.100N氢氧化钠标准溶液。
(4) 0.1%中性红(50%乙醇溶液)(三)操作步骤：取相同的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份加入中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOH溶液滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0.100N NaOH准溶液滴定至淡蓝色。
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实验二甲醛滴定法测定氨基氮
一、目的
初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。
二、原理
氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：
-NH3是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定-NH3所释放的H＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使-NH3释放H＋，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（pH9.0左右）。
因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。
如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。
三、仪器、试剂、材料
1.仪器
25mL锥形瓶；碱式滴定管；吸管。
2.试剂
（1）0.1mol/L标准甘氨酸溶液
准确称取7.5g 甘氨酸，溶解后定容至1000mL。
（2）0.02mol/L标准氢氧化钠溶液
（3）酚酞指示剂(0.5%酚酞乙醇溶液)：
取0.5g酚酞，用95％乙醇溶解，并稀释至 100mL，无需加水。
（4）400 mL中性甲醛溶液
在50mL36～37％分析纯甲醛溶液中加入1mL0.5％酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
四、操作方法
1.氢氧化钠溶液标定
（1）准确称取0.08g邻苯二甲酸氢钾；
（2）用量筒准确量取50mL纯净水，溶解完全；
（3）加入2滴酚酞指示剂，
（4）用氢氧化钠溶液滴定，记录体积；平行做2次。
（5）求消耗氢氧化钠溶液平均值，用公式计算氢氧化钠溶液浓度。
2.取3个25mL的锥形瓶，编号。
向1、2号瓶内各加入0.05mol/L标准甘氨酸溶液2mL和水5mL，混匀。
向3号瓶内加入7mL水。
然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2mL甲醛溶液再混匀，分别用0.02mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。
取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。
3.取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。
计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。
五、结果处理
1.氢氧化钠溶液标定
C NaOH=m/(G邻*V)
注解：m：g；
G邻：204.2；
V：ml
2.回收率计算：
甘氨酸氨基氮回收率％＝实际测得量
×100 加入理论量
公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。
3.氨基氮计算：
氨基氮（毫克/毫升）= （V未－V对）×N NaOH×14.008
2
公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。
V对为滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。
N NaOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。
六、注意事项
1.标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。
不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。
2.中性甲醛溶液在临用前配制，若已放置一段时间，则使用前需要重新中和。
3.本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学要求进行。
4.脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。
而酪氨酸的滴定毫升数结果偏高。
七、思考题
甲醛滴定法为什么不能准确测定含有多种氨基酸的样品中的氨基氮？。