昆虫细胞培养手册

昆虫细胞系的生长和维持

细胞系

简介：

本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。

运输与储存：

运输：置于干冰上。

储存和传代：置于液氮储存。收到细胞即可开始，详见14页。

细胞系比较：

下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。订购信息见下页。

细胞 倍增时间 细胞外观 初始培养基

Sf9 72h 规则的带有颗粒球

形。贴壁紧。

TNM-FH

Sf21 24h 不同大小带有颗粒

球形。贴壁紧。

TNM-FH

H5 18h 不同大小带有颗粒

球形。贴壁松。

Express Five SFM

重要事项：

Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。更多信息请联系技术支持。

用途：

仅供研究使用。禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。

Sf9和Sf21细胞系：

来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。

特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。 大小不同：Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。

用途：两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。

H5细胞系：

来源：H5细胞系源于博伊斯汤普森研究所对植物的研究，伊萨卡、纽约和源于白菜尺蠖卵巢细胞，粉纹夜蛾。

特性：此细胞系有如下特性:

●倍增时间小于24h；

●适于贴壁培养，但易形成不整齐的单层，导致空斑鉴别困难；

●适于悬浮培养和无血清培养；

●提供5-10个折叠（针对选择的蛋白）分泌表达量比Sf9细胞高。

用途：H5细胞表达重组病毒性能优越。也经常用于转染和空斑纯化；然而，如果重组体不是蓝色分离重组的空斑就比较困难。

昆虫表达系统：

大量从Invitrogen获得的表达系统在Sf9、Sf21或H5昆虫细胞中能便利的表达重组蛋白。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统适于用杆状病毒来表达重组蛋白，同时InsectSelect适于用无细胞溶解素的系统来表达蛋白。更多关于表达系统的信息请访问或致电技术服务。

哪个细胞系最好用?

推荐Sf9或Sf21细胞用于转染、纯化和增殖重组病毒。Sf9细胞大小一致，易于操作，能形成良好的单层细胞用于空斑实验。Sf9和Sf21细胞也能用于重组蛋白的表达，但是H5细胞系的生产量更高。

推荐用H5细胞系来表达分泌型重组蛋白。其能在无血清培养基中培养，适应悬浮培养以及能生产大量的重组蛋白。

注意：一般来说易于用一种细胞系来表达蛋白达到最优化的程序。一旦确定用一种细胞来表达重组蛋白，其它细胞系可以尝试优化表达水平。

注意:

当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。

订购信息：见下表从Invitrogen获得冻存细胞信息

细胞 冻存

Sf9 货号：B825-01

1×107细胞/ml 60％Grace's培养基，30％胎牛血清，10％DMSO

Sf21 货号：B821-01

1×107细胞/ml 60％Grace's培养基，30％胎牛血清，10％DMSO

H5 货号：B855-02

3×106细胞/ml 添加90mL/L谷氨酰胺的Express Five® SFM需要92.5％ 7.5％DMSO

培养基

昆虫细胞培养基：

Sf9，Sf21和H5能在含血清或无血清培养基中生长（更多信息见12页培养基注意事项）。推荐如下培养基用于每个细胞系（见下表）。

细胞 含血清培养基 无血清培养基

Sf9 Grace's昆虫培养基 Sf-900ⅡSFM

Sf21 Grace's昆虫培养基 Sf-900ⅡSFM

H5 Grace's昆虫培养基 Express Five® SFM

培养基订购信息：

从Invitrogen获得的GIBCO®昆虫培养基用于培养Sf9，Sf21和H5昆虫细胞。订购信息见下表。

产品 数量 货号

非悬浮Grace's昆虫培养基 500mL 11595-030

悬浮Grace's昆虫培养基 500mL 11605-094

500mL 10902-096 Sf-900ⅡSFM

1L 10902-088 Express Five® SFM 1L 10486-025

方法

细胞操作技术

无菌技术：

需在层流罩无菌条件下进行昆虫细胞培养。

传代培养：

传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。

贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。

例如：T75方瓶装12mL培养基长成单层。将细胞吹下来，取2mL移入新的装有8mL培养基的T75方瓶，这就是1:5稀释（最终10mL体积中含2mL细胞）。

悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。

例如：在装有50mL细胞培养基的100mL摇瓶中细胞密度达到2.0×106细胞/mL。移取25mL 含细胞的培养基再加入25mL新完全培养基使细胞终浓度达到1.0×106细胞/mL。

融合：

融合是细胞进行传代培养的标志。

定义：贴壁细胞汇集成单层布满整个获得的生长表面。在形成第一层或开始从壁面悬起后，一旦细胞形成团簇，就要开始进行传代。

传代融合细胞：细胞在旧的融合表现倍增时间较少或活率降低以及减少贴壁时应立即传代。细胞培养以及认为不太健康了。

融合前传代：未形成融合前的细胞不易移除，需较大的机械力。在未融合前传代，细胞表现倍增时间较短或活率降低（更多信息参见30页疑难解答）。细胞培养以及认为不太健康了。

漂浮物：