荧光显微镜构造和应用

抗体荧光技术（用免疫染色） :
利用特定的抗原 必然和特定的抗 体相结合这一个 事实，有意识地 使带荧光标记的 抗体和标本中的 抗原进行抗原/抗 体反应，这样两 者的结合体就能 通过抗体的荧光 观察到。
荧光的性质
• 吸收光 • 保持固有的荧光特性 • 荧光波长＞激发波长（STOKES 法则） • 荧光强度极小于激发光的强度 • 有不同程度的衰减 • 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓
.自发荧光（不加染色） ; .二次荧光（用化学染色） ; .抗体荧光技术（用免疫染色）;
自发荧光：有些物质不加染色，也能发出荧 光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生 物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。
发射光
激发光
二次荧光（用化学染色）
非荧光性的物质 （蛋白质、炭水化 合物）用荧光色素 染色，由荧光色素 产生荧光（二次荧 光），以便进行观 察。对特定物体选 择合适的荧光色素， 该物体就能和周围 的组织或细胞区别 出来而可以观察到。
优点： • 检出能力高 • 对细胞的刺激小 • 能进行多重染色 用途： • 物体构造的观察 • 荧光的有无、色调比较进行物质判别 • 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转 变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
Immersion objective with specimen
透射荧光显微镜
优点：
• 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因 此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 • 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。 • 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。
透射荧光显微镜
缺点：
• 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧 光像。 • 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。 • 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 • 厚的或不透明的标本不适用。
反射荧光显微镜
优点：
• 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 • 采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。 • 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高 分辨率的像。 • 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 • 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透 射微分干涉差法相结合。 • 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。
一种光化荧光
Basic idea of fluorescence microscopy: Stokes shift
excitation level 1
excitation level 2
E1 E = hn
E2 c = n
E~1/
base level
E0
E1
E2
1
2
Stokes shift
荧光的种类
water or oil immersion objective medium (water or oil) specimen
Light source
Emission
Excitation DM
refraction index (n)
air 1.00 water = 1.37
oil = 1.5 glass = 1.5
Objects with a sharp rise in refraction index
透射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱 激发滤色镜
落射荧光显微镜的构造
紫外线保护罩
吸收滤色镜 激发滤色镜
孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜
汞灯
Immersion objectives: Remember the refraction index!
反射荧光显微镜
缺点：
• 在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用 大数值孔径的物镜。 • 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光 。
落射荧光显微镜各部件特性和作用
• 汞灯光源: 提供激发光(U、V、B、G)
• 激发滤色镜: 波长选择
T%
nm
BAND PASS
落射荧光显微镜各部件特性和作用
• 分色镜: 反射激发光,透过荧光
Dark field • part-illumination of the specimen • scattered light collected by objective • bright object on dark background
Objects with high contrast
(with modification )
T%
＜A 反射
＞A 透过
A
nm
• 吸收滤色镜:
T%
透过荧光,阻挡杂光
Bright and dark field illumination
Bright field • total illumination of the specimen • direct light collection by objective • dark/colored object on bright background
Bright and dark field illumination
dark field without specimen
dark field with specimen
objective
object plane
specimen
condensor
- ring diaphragm (usually) - dark field condensor
荧光显微镜构造和 应用
Fluorescence microscopy
Mainly fluorescence detector systems are color-blind!
(Colors are based on a [pseudo-]color look-up table)
荧光显微镜的优点和用途
度、荧光效率
荧光显微镜的种类
ห้องสมุดไป่ตู้透射式
落射式
荧光显微镜的主要部件
透射式
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 暗场聚光镜 • 吸收滤色镜
落射式
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 分色镜 • 吸收滤色镜
暗视野照明方式
聚光镜中央有档 光片，使照明光 线不直接进入物 镜，只允许被标 本反射和衍射的 光线进入物镜， 因而视野的背景 是黑的，物体的 边缘是亮的。