荧光显微镜构造和应用
荧光显微镜的原理和应用
荧光显微镜的原理和应用1. 原理1.1 荧光的基本原理•荧光是一种由物质吸收能量而产生的特殊形式的发光现象。
•荧光分为荧光激发和荧光发射两个过程。
•在荧光激发过程中，物质吸收光子能量，并将电子从基态激发到激发态。
•在荧光发射过程中，激发态电子从高能级跃迁至低能级，放出能量并发射荧光光子。
1.2 荧光显微镜的构成荧光显微镜由以下部分组成：•激发光源：通常使用荧光灯或激光器作为激发光源，激发样品发出荧光。
•滤光器：用于选择合适的波长以激发样品，并屏蔽其他波长的光。
•物镜：用于聚焦激发光和荧光光。
•感光器件：用于检测和记录荧光光。
•显示器或相机：用于显示和记录荧光图像。
2. 应用荧光显微镜广泛应用于生物医学领域和材料科学领域中的研究和实践。
2.1 生命科学研究•细胞和组织成像：荧光显微镜可以用于观察活体细胞和组织的形态、结构和功能。
通过标记特定蛋白质或染料，可以研究细胞生理、细胞信号传导、细胞分裂等过程。
•药物研发：荧光显微镜可以用于药物的输送、靶向和释放的研究。
将药物标记荧光染料，可以追踪药物在细胞和组织中的分布和代谢。
•基因编辑：荧光显微镜可以用于观察基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）的效果。
通过标记特定基因或DNA序列，可以追踪基因编辑的结果和效率。
2.2 材料科学研究•纳米材料研究：荧光显微镜可以用于观察和研究纳米材料的结构、形态和光学性质。
通过将纳米材料标记特定染料或荧光蛋白，可以研究纳米材料的生长、聚集和相互作用。
•薄膜研究：荧光显微镜可以用于观察和研究薄膜的表面形态和荧光特性。
通过标记特定染料或荧光分子，可以研究薄膜的结构、厚度和质量。
•光电器件研究：荧光显微镜可以用于观察和研究光电器件的结构和性能。
通过标记特定荧光染料或有机分子，可以研究光电器件的光学响应和电子传导。
3. 总结荧光显微镜以其独特的原理和广泛的应用领域在生物医学和材料科学研究中发挥着重要作用。
通过荧光显微镜的使用，研究人员能够观察并了解细胞、组织和材料的结构、形态和功能。
荧光显微镜的基本原理及应用PPT课件
未来荧光显微镜的发展将更加注重个性化定制，根据不同 领域和不同需求，定制特定的光学系统和成像方案，以满 足不同用户的需求。
06 参考文献
参考文献
参考文献1
介绍荧光显微镜的基本原 理，包括激发光、发射光 和滤色片的原理和作用。
参考文献2
介绍荧光显微镜的应用， 包括生物学、医学、化学 等领域的应用案例和效果。
荧光显微镜的基本原 理及应用ppt课件
目录
CONTENTS
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的基本原理 • 荧光显微镜的应用 • 荧光显微镜的优缺点 • 荧光显微镜的发展趋势与未来展望 • 参考文献
01 荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，科学家开始研 究荧光现象，并尝试将其 应用于显微镜中。
多色观察
荧光显微镜可以同时观察多个 荧光标记物的表达，通过不同 的荧光颜色来区分不同的标记 物。
非破坏性
荧光显微镜观察样本时不会对 样本造成破坏，因此可以观察
同一样本的不同层面。
缺点
01
02
03
04
光毒性
荧光显微镜需要使用高强度光 源来激发荧光，长时间观察会
对样本造成光毒性损伤。
光漂白
荧光标记物在受到高强度激发 光照射时容易发生光漂白，导
环境化学
荧光显微镜用于检测环境中的有害物 质和污染物。例如，利用荧光标记的 探针检测水体中的重金属离子或有机 污染物。
04 荧光显微镜的优缺点
优点
高灵敏度
荧光显微镜能够检测到非常微 弱的荧光信号，因此可以用于
观察低浓度的荧光标记物。
高对比度
荧光显微镜能够通过选择合适 的激发和发射波长，获得高对 比度的荧光图像。
荧光显微镜技术在生物学研究中的应用
荧光显微镜技术在生物学研究中的应用荧光显微镜是一种常用的实验工具，用于生物学和药学等领域的研究。
它使用荧光染料，将样品的细胞、分子等部分标记为荧光颜色，使得这些部位在显微镜下更加明显，方便观察研究。
这种技术在现代生物学中的地位越来越重要，本文将详细介绍荧光显微镜技术的应用。
一、荧光显微镜的介绍荧光显微镜的原理是利用某些化学物质（荧光染料）具有荧光特性，即将长波长的光（通常是紫外线）转换为短波长的光，形成可见的荧光颜色。
荧光染料对特定的物质具有亲和力（比如只结合某种蛋白质），所以荧光显微镜可以被用来标记特定的分子或细胞等。
荧光显微镜的优点在于，它提供了非常高的分辨率和灵敏度，使得微小的细胞或分子可以被清晰地看到。
此外，荧光显微镜还有许多其他的应用，包括流式细胞术、免疫组织化学和细胞培养等。
二、荧光显微镜在细胞学中的应用荧光显微镜技术在细胞学中得到广泛应用，因为它可以帮助科学家研究细胞的结构和功能以及细胞内分子的交互作用。
例如，荧光显微镜可以用来观察细胞骨架、细胞器和膜系统的形态。
此外，荧光显微镜还可以用来研究细胞内的互动作用，比如某些蛋白质的相互结合、信号传导和运输等。
三、荧光显微镜在神经科学中的应用荧光显微镜在神经科学中也得到了广泛应用。
例如，荧光染料可以用来标记和观察单个神经元甚至单个神经元的突触。
荧光标记还可以用来观察神经元之间的联系和体内物质的转运。
荧光显微镜的成像技术也使得我们能够更好地理解人类认知和学习等重要的神经过程。
四、荧光显微镜在医学研究中的应用在医学研究方面，荧光显微镜技术可以用来研究疾病的发生和发展。
例如，它可以用来观察生物标志物、病原体等在细胞和组织中的行为和分布。
此外，荧光显微镜标记的蛋白质、抗体等可以被用来检测和诊断疾病。
五、荧光显微镜在环境科学中的应用荧光显微镜在环境科学中的应用主要是在观察水质、土壤和大气中的微生物和微粒。
科学家可以用荧光染料来标记水中或土壤中的某些细菌、真菌或病毒，然后通过荧光显微镜来观察它们在水或土中的分布情况和数量。
荧光显微镜的基本原理及应用
六、荧光组化实验中应注意的几个问题
1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。 当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因 此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。 2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常 出现温度猝灭。 3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰 竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进 行观察，需照相时再适当增强激发光。 4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一， 也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的 浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由 于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
2.药物筛选
荧光探针分布是利用信号传 导中信号分子的迁移功能，将 一荧光蛋白与信号分子相偶联， 根据荧光蛋白的分布情况即可 推断信号分子的迁移状况，并 推断该分子在迁移中的功能。 由于GFP分子量小，在活细胞 内可溶且对细胞毒性较小，因 而常用作荧光探针
八、使用注意事项
1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。
A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2)
三、荧光显微镜的操作
(1)安装紫外防护罩。
(2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。
(3)插入挡光板，中断光路。
七、荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离 的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的 技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连 接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接 免疫荧光技术(direct immunofluorescent technique)”。 用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体 复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent technique)”。
荧光显微镜的原理与应用
荧光显微镜的原理与应用前言荧光显微镜是一种利用荧光现象进行观察和显示样品细胞或分子结构的显微镜。
它的原理和应用使得生物学、医学、材料科学等领域的研究变得更加准确和深入。
本文将介绍荧光显微镜的原理、构成和其在不同领域的应用。
一、荧光显微镜的原理荧光显微镜的成像原理基于光的荧光现象和酵素固有荧光物质本身的特性。
1.光的荧光现象当物质受到一定波长的光照射后，能量被吸收并再次散发出去。
荧光显微镜利用激发光的波长激发标记在样品中的荧光物质，使其发出荧光信号。
这种荧光信号可以被荧光显微镜所捕获和放大，进而产生图像。
2.酵素固有荧光某些分子具有自身固有的荧光性质。
这些分子可以从基态跃迁到激发态，并在激发态上持续存在一段时间后再跃迁回基态。
通过观察这些分子的荧光信号，可以获得关于样品的信息。
二、荧光显微镜的构成荧光显微镜通常由以下几个主要部件组成：1.光源：用来提供激发样品的激发光，常用的光源有氘灯、汞灯、激光器等。
2.激发光滤镜：用于选择性地过滤或选择激发光的特定波长。
3.物镜：用来放大样品并收集由荧光物质发出的荧光信号。
4.荧光筛选器：用来选择特定的荧光波长，并阻挡其他波长的光线。
5.观察系统：包括目镜、眼镜或摄像机等设备，用于观察和记录荧光信号。
三、荧光显微镜在不同领域的应用荧光显微镜在生物学、医学、材料科学等领域有广泛的应用。
1.生物学研究荧光显微镜可以帮助研究者观察和分析生物学样本中的细胞结构和功能。
通过将特定荧光染料标记到细胞中，可以实时监测细胞的代谢状态、基因表达和蛋白质定位。
2.医学诊断荧光显微镜在医学诊断中发挥着重要作用。
例如，通过使用荧光标记剂可以检测肿瘤细胞，帮助医生进行早期诊断和治疗。
3.材料科学荧光显微镜在材料科学中的应用主要集中在材料的结构和性能测试上。
通过标记某些特定的分子或颗粒物，并观察它们在材料中的分布和运动，可以更好地了解材料的组成和特性。
4.环境监测荧光显微镜也可以应用于环境监测领域。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2.1 荧光显微镜旳基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号旳不同，构造
各异，但主要构件，基本相同。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小旳表面 发出最大数量旳紫外光和蓝光，且光亮度大，光
度稳定。汞灯旳构件，中间为一球形石英玻璃管， 有两个钨电极，内充汞滴和少许氩氖混合气体。 汞灯装在牢固旳灯室中，有调中、聚焦和集光装 置。使用中禁止频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭 后，不能立即点亮，经5～10min，汞灯冷却后再 通电点亮。
•
HBO200Ｗ汞灯旳发射光谱为200～600nm，
• 视场光阑旳调整使用：视场光阑位于孔径光阑 之后，亦由外露手杆操纵。视场光阑用于限定样 品表面旳照明区域，其开度一般应与孔径光阑旳 开孔相当。
• 辅助激发滤色镜滑动阀旳使用:滑动阀位于镜臂 专用槽中，可拉出或推入。有三个挡位供不同使 用。全拉出位：供常规使用；中间位：用于Ｂ激 发法，辅助滤色镜进入光路；全推入位：用作光 阀，阻断全光线．
• 某些物质经波长较短旳光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长旳 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光旳可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出旳荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 旳叶绿素分子受激发所发出旳火红色旳荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出旳荧 光称为次生荧光。常用旳荧光染料涉及丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
细胞生物学中的荧光显微镜技术及其应用
细胞生物学中的荧光显微镜技术及其应用荧光显微镜是细胞生物学中一种常用的实验技术，通过利用能够发射荧光的染料或标记物与细胞内某些分子特异性结合，从而对细胞结构和功能进行观察和研究。
本文将介绍荧光显微镜的工作原理、不同类型的荧光标记物以及其在细胞生物学研究中的应用。
一、荧光显微镜工作原理荧光显微镜与普通光学显微镜相比，具有更高的分辨率和灵敏度。
其主要原理是通过激发荧光染料，使其从基态跃迁到激发态，再发射出较长波长的荧光光子。
荧光显微镜通过分离荧光信号与背景光的方法，实现高对比度的成像。
二、荧光标记物的类型1. 荧光染料：荧光染料是一类能够与细胞结构或分子特异性结合的化合物，如荧光素、罗丹明等。
荧光染料可以通过局部或全局染色的方式，直接观察和分析细胞的结构、形状和分布。
2. 荧光探针：荧光探针是一类针对特定分子或细胞组分的标记物。
例如，融合了荧光蛋白的探针可以用于示踪蛋白的定位和转运；荧光标记的抗体可以用于检测特定蛋白的表达水平。
3. 荧光蛋白：荧光蛋白是一类天然存在或通过基因工程得到的具有荧光性质的蛋白质。
荧光蛋白可以通过基因转染或基因编辑等方法，实现对细胞或生物体内某些结构或分子的实时可视化。
三、荧光显微镜在细胞生物学中的应用1. 细胞形态与结构的观察：荧光显微镜可以通过荧光染料的局部或全局染色，对细胞的形态、核仁、细胞骨架等结构进行观察。
例如，通过荧光标记细胞骨架蛋白的分布，可以了解细胞的形态变化和运动机制。
2. 蛋白定位和追踪：荧光标记的抗体或融合了荧光蛋白的蛋白探针，可以用于检测特定蛋白在细胞内的定位和转运。
这有助于研究蛋白在细胞周期、信号转导和细胞骨架重组等生物过程中的功能。
3. 细胞代谢和药物筛选：荧光染料可以作为指示剂，用于观察细胞内各种代谢过程，如钙离子浓度的变化、酸碱平衡等。
荧光显微镜还可用于药物筛选，通过观察荧光信号的变化，评估药物对细胞功能的影响。
4. 分子相互作用的研究：荧光共振能量转移（FRET）技术是利用荧光标记物之间的能量转移来研究分子相互作用的技术。
荧光显微镜详解
森林生物工程 黄雅婷
目录
一、荧光显微镜成像原理 二、荧光显微镜的优点及应用 三、荧光显微镜的基本构造 四、荧光显微镜的使用 五、使用荧光显微镜注意事项 六、荧光镜检样品的制作注意事项 七、荧光强度计算
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一、荧光显微镜成像原理
某些物质在一定短波长的光(如紫 外光等)的照射下吸收光能进入激发态， 从激发态回到基态时, 就能在极短的时 间内放射出比照射光波长更长的光(可 见光)，这种光就称为荧光。
荧光显微镜是利用一个高发光效
率的点光源，经过滤色系统发出一定 波长的光作为激发光，激发标本内的 荧光物质发射出各种不同颜色的荧光 后，再通过物镜和目镜的放大进行观 察。
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二、荧光显微镜的优点及应用
优点：
1.检出能力高，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高（放大作用） 2.对细胞的刺激小（可以活体染色） 3.能进行多重染色等
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六、荧光镜检样品的制作注意事项
1. 不能使用本身能产生荧光的药剂 2. 切片标本不能太厚 3. 因石蜡可产生青色荧光，采用石蜡制片时，脱蜡必须 彻底。切片进入水后，应充分水洗，再经荧光染料处理。 4. 最好采用萤石玻璃制成的载玻片、盖玻片。 5. 封片时可采用甘油等无荧光的封固剂。
３、检测时间每次以1h为宜，超过90min，高压汞灯发光强度逐 渐下降，荧光减弱，标本经激发15min后，荧光亦明显减弱。 标本染色后立刻观察，因存放时间太久，荧光会逐渐猝灭。 可将染好色的标本用黑纸包好，存放在聚乙烯塑料袋中，4℃ 保存，可延缓荧光的猝灭时间。
4、荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命有限，标本应集中检 查，节省时间
荧光显微镜原理特点及使用
荧光显微镜原理特点及使用
荧光显微镜的原理和结构特点：荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。
这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。
荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。
每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。
荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。
它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。
两种滤光片必须选择配合使用。
荧光显微镜就其光路来分有两种：
1．透射式荧光显微镜: 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。
常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。
其优点是低倍镜时荧光强，而缺。
荧光显微镜介绍及使用
荧光显微镜一.荧光显微镜(Fluorescence microscope) ：荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。
在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。
荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。
荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。
我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。
荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。
由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。
荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。
它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。
是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。
二．工作原理光源多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15m i n。
荧光显微镜基本构造
荧光显微镜基本构造
荧光显微镜是一种特殊的显微镜，它利用物质在受到紫外光的激发后发出荧光的特性来观察样品。
其基本构造包括以下部分：
1. 光源：荧光显微镜一般使用高压水银灯或氙灯作为光源，它们能够产生波长在紫外光范围的光线，激发样品发出荧光。
2. 过滤器：荧光显微镜内置多个滤光片或滤光器，用于选择性地通过或阻挡不同波长的光线。
常用的滤光片有激发滤光片和荧光滤光片。
3. 物镜：荧光显微镜的物镜是专门设计的，能够对激发和荧光光线进行聚焦和收集，以提高图像的亮度和清晰度。
4. 激发系统：激发系统是荧光显微镜的一个重要组成部分，它包括聚光镜、凸透镜和反射镜等，用于将光源发出的紫外光线聚焦在样品上。
5. 荧光滤镜轮：荧光显微镜通常配备一个荧光滤镜轮，用于在不同的观察中选择合适的激发光和荧光光线的滤镜。
6. 荧光检测器：荧光显微镜的荧光检测器能够接收样品发出的荧光信号，并将其转化为电信号。
7. 显示器和图像采集系统：荧光显微镜通常配备显示器和图像采集系统，用于显示和记录荧光显微镜观察到的图像。
以上是荧光显微镜的基本构造，不同型号和用途的荧光显微镜可能会有一些差异。
荧光显微镜的原理和使用方法
激光共聚焦扫描显微镜采用激光作为激发光源，具有高分辨率和高灵敏度，能够观察细胞内细微结构 和动态过程。它通过逐点扫描样品，获得高清晰度的图像，特别适合观察细胞骨架、线粒体和内质网 等结构。
多光子荧光显微镜
总结词
一种非线性光学成像技术，适用于观察活体动物和组织。
详细描述
多光子荧光显微镜采用多光子激发技术，能够在不损伤样品的情况下获得高分辨率和高对比度的图像。它通过使 用脉冲激光和光子计数检测器，能够观察活体动物和组织中的荧光标记物，特别适合用于神经科学和生物学等领 域的研究。
Hale Waihona Puke 谢谢观看光源提供特定波长的激 发光，通常为紫外 光或蓝光。
样品
放置待观察的荧光 样品。
目镜或摄像系统
观察或记录荧光图 像。
荧光物质和激发光
荧光物质
某些物质在吸收激发光后，会发出特定波长的荧光。
激发光
用于激发荧光物质的特定波长光线。
荧光产生的原理
01
当荧光物质吸收激发光时，电子 从基态跃迁至激发态。
02
激发态的电子不稳定，会释放能 量并返回到基态，同时发出荧光 。
03
荧光显微镜的使用方法
荧光显微镜的安装和调试
安装
荧光显微镜应放置在平稳的工作台上 ，确保电源和光源的连接稳定。
调试
调整显微镜的焦距和光源亮度，确保 图像清晰可见。
荧光样品的制备
荧光染料选择
根据观察目标选择合适的荧光染料， 如FITC、TRITC等。
样品处理
将荧光染料与样品混合，进行染色处 理，然后洗涤和干燥。
，进行相应的调整。
使用注意事项
01 使用前先了解操作规程，遵循操作步骤， 避免因误操作导致仪器损坏。
荧光显微镜的原理应用范围
荧光显微镜的原理应用范围引言荧光显微镜是一种用于研究生物和材料的重要工具。
它利用荧光物质在受激发光后发出的可见光来增强对样本的观察。
本文将介绍荧光显微镜的原理和应用范围。
原理荧光显微镜的工作原理基于激发和发射荧光的过程。
下面是荧光显微镜的三个主要元件： - 激发光源：荧光显微镜通常使用紫外光或蓝光作为激发光源。
这些光源的波长比可见光更短，能够激发荧光物质中的电子跃迁。
- 激发滤光片：激发滤光片位于激发光源和样本之间，用于选择性地传递激发光，以阻挡其他波长光线。
- 发射滤光片：发射滤光片位于样本和观察者之间，用于选择性地传递发射光，以阻挡其他波长的光线。
通常，样本中的荧光染料会吸收激发光的能量，并以更长的波长发出发射光。
荧光物质的激发和发射光谱是独特的，可以通过使用适当的滤光片来选择性地观察不同的荧光信号。
应用范围荧光显微镜在生物学和材料科学领域具有广泛的应用范围。
以下是一些主要的应用领域：生物学研究•细胞成像：荧光显微镜可以用于观察和研究细胞的结构和功能。
通过标记细胞中的特定结构或分子，荧光显微镜可以提供高分辨率的图像，揭示细胞内的细节。
•分子交互作用：荧光标记的分子能够通过荧光显微镜来研究它们的相互作用。
例如，蛋白质相互作用、DNA杂交等。
这对于理解生物体内分子之间的相互作用机制非常重要。
医学诊断•免疫荧光：荧光显微镜可以用于检测和诊断许多疾病。
例如，通过在患者标本中引入荧光标记的抗体，可以检测到特定的病原体或肿瘤标志物。
这种技术在免疫组织化学和流式细胞术中广泛应用。
•分子诊断：荧光显微镜可以结合分子探针和显微技术来检测基因突变、染色体异常等遗传病的诊断。
材料科学•纳米材料研究：荧光显微镜可以用于观察和研究具有荧光性质的纳米材料。
这些材料在电子学、光学和生物医学应用中具有潜在的用途。
•材料性能表征：荧光显微镜可以通过添加荧光标记来研究材料的性能和表征。
例如，通过标记聚合物材料的微观结构和扩散性质，可以评估其性能和应用潜力。
细胞培养荧光显微镜的结构
细胞培养荧光显微镜的结构
细胞培养荧光显微镜的结构通常包括以下几个主要部分：
1. 光学系统：包括物镜、目镜和透光系统。
物镜是放置在样品上方，用于聚焦在样品上的光线。
目镜则用于观察样品上的图像。
透光系统是通过将光线传递到物镜和目镜之间的透明部分，以便观察样品。
2. 荧光系统：包括荧光激发光源、滤光片和荧光检测器。
荧光激发光源通常是一个强度可调的光源，例如白炽灯或激光器。
滤光片用于选择性地传递荧光激发光，并阻挡其他波长的光。
荧光检测器用于接收和探测样品上发出的荧光信号。
3. 显微镜支架：用于支持显微镜的结构，确保其稳定性和准确性。
支架通常具有调节和固定仪器的功能，以便在观察样品时进行调整和固定。
4. 样品夹持装置：用于固定和保持细胞培养皿或载玻片上的样品。
样品夹持装置可以通过手动或电动方式控制样品的位置和移动。
5. 数据处理和图像采集系统：细胞培养荧光显微镜通常配备有相应的软件和计算机系统，用于图像采集、存储和数据处理。
这些系统可以帮助用户获得高质量的图像，并进行图像分析和处理。
需要注意的是，细胞培养荧光显微镜的结构可能因厂家和型号而有所不同，但通常基本包括以上所列的主要部分。
荧光显微镜操作说明
荧光显微镜操作说明荧光显微镜（Fluorescence Microscope）是一种用于观察荧光标记生物分子的显微镜。
荧光显微镜具有高灵敏度和高分辨率的特点，适用于细胞生物学、分子生物学、微生物学、免疫学等领域的研究。
本操作说明将介绍荧光显微镜的基本结构、操作步骤以及一些常见的注意事项。
一、荧光显微镜的基本结构荧光显微镜主要由以下几个部分组成：1. 光源系统：荧光显微镜通常使用荧光灯作为光源，荧光灯发出的紫外光经过滤波器后被用于激发样品中的荧光发射。
2. 物镜系统：荧光显微镜使用高倍物镜进行观察，一般有10x、20x、40x、60x、100x等不同倍率的物镜，可以根据需要选择合适的物镜进行观察。
3. 荧光滤光片组：荧光滤光片组由激发滤光片、切分镜和发射滤光片组成，用于选择特定波长的激发光和荧光发射光，以增强信号和抑制背景噪音。
4. 检测系统：荧光显微镜的检测系统包括物镜、光学透镜、眼镜和CCD相机等，用于接收和记录荧光发射的图像。
二、荧光显微镜的操作步骤1. 准备样品：将待观察的样品制备好，可以是细胞、组织或标记了荧光染料的生物分子。
确保样品放置在适当的载玻片上，并加上合适的封片或封装剂。
2. 打开荧光显微镜：首先，确认荧光灯是否打开并运行正常。
然后，按下启动按钮，打开荧光显微镜的电源。
3. 调节照明：调节照明系统以获得适当的亮度和对比度。
根据样品的需要，可以调整照明强度和滤光片的位置。
4. 切换滤光片：根据样品的特点和所需的荧光发射波长，选择合适的激发滤光片、切分镜和发射滤光片。
确保滤光片的位置正确，以获得所需的荧光发射信号。
5. 调节焦距和倍率：使用适当倍率的物镜进行观察，并通过调节焦距和对焦机构以获得清晰的图像。
如果需要更高的放大倍率，可以更换为更高倍率的物镜。
6. 观察样品：将载玻片放置在显微镜的样品台上，并通过移动样品台和调整操纵旋钮来观察样品。
使用眼镜或连接到计算机的CCD相机来记录荧光发射的图像。
荧光显微镜的基本光路结构
荧光显微镜的基本光路结构1.光源：荧光显微镜一般使用激发光源来激发样品中的荧光。
常用的光源包括汞灯、氙灯、LED等。
汞灯是最常用的激发光源，其产生的紫外光可以激发许多常见的荧光染料。
2.激发光过滤系统：为了选择适当的激发光波长，荧光显微镜通常使用一套滤光片来滤除非激发光波长的光线。
一般由激发滤光片和透反滤光片组成。
激发滤光片选择激发光波长并排除其他波长的光线，而透反滤光片则用于透射或反射荧光信号。
3.物镜：荧光显微镜的物镜与普通显微镜的物镜类似，但通常具有更高的数值孔径（NA）和更短的工作距离。
较大的数值孔径可以提高分辨率和收集更多的荧光信号。
4.物镜调焦系统：荧光显微镜一般配备了一套精确的调焦系统，以确保准确的对焦。
在获取高质量的荧光图像时，对焦是非常重要的。
5.荧光信号的准直和激发：激发光通过透反滤光片进入物镜，并被准直到焦平面。
物镜将激发光聚焦到样品上。
当激发光与染料相互作用时，染料吸收能量并发出荧光光子。
6.荧光信号搜集：收集荧光信号的系统包括物镜和物镜下方的收集镜。
物镜收集荧光信号是通过用透反滤光片来确保只有带有特定波长的荧光信号通过。
荧光信号从物镜进入物镜下方的收集镜，在此平面上可以安装不同的光学器件进行进一步的搜集、分析和记录。
7.目镜：荧光显微镜的目镜与普通显微镜的目镜相似，用于放大收集到的荧光图像。
目镜通常具有高放大倍数，并具有透明的中心孔，以便观察样本。
8.荧光滤光片：荧光滤光片用于阻挡激发光的通过，只允许荧光信号通过。
常见的荧光滤光片有激发滤光片，用于选择激发光波长；透射滤光片，用于选择荧光信号的波长；以及反射滤光片，用于选择反射荧光信号的波长。
总结：荧光显微镜的基本光路结构包括激发光源、激发光过滤系统、物镜、调焦系统、荧光信号的准直和激发、荧光信号的搜集、目镜以及荧光滤光片。
这些光学元件的组合可以实现荧光显微镜对样品中特定荧光信号的检测和观察。
荧光显微镜
荧光显微镜一、结构及其原理荧光显微镜的基本构造通常由普通光学显微镜再加一些如荧光光源、激发滤片、双色束分离器及阻断滤片等附件的基础上组成。
同时采用的荧光光源一般为超高压汞灯，它可发出各种波长的光，且每种荧光物质都会有一个产生最强荧光的激发光波长，这时需加置激发滤片，通常有紫外、紫色、蓝色及绿色激发滤片，仅需使一定波长的激发光透过并照射到标本上，并将其他光都吸收掉。
同时在每种物质被激发光照射后，更可在极短时间内发射出比照射波长更长的可见荧光。
荧光显微镜的特殊结构包括：(一)滤色系统滤色块是荧光显微镜的重要部位，其核心部件由激发光滤色片(first barrier filter)、发射光滤色片(second barrier filter)和半透半反滤色片(beam-splitting mirror)组成。
各厂家的滤色片型号、名称常不统一。
1.激发光滤色片及发射光滤色片：根据光源和荧光色素的特点，通常选用以下三类配套，提供一定波长范围的激发光，并使样品激发出的荧光透过，到达目镜成像。
紫外光激发：激发光滤色片可使紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。
与之相应的发射光滤色片可允许蓝光通过，视野内的光呈蓝色，如应用于DAPI 染色。
蓝光激发：激发光滤色片可使蓝光通过，阻挡其他波段的光。
与之相应的发射光滤色片可允许绿光通过，如GFP 染色标记。
绿光激发：激发光滤色片使绿光通过，阻挡其他波段的光。
与之相应的发射光滤色片通常可允许红光通过，如Rhodamine染色。
2.半透半反滤色片：它的作用是完全阻挡激发光通过，而将其反射;并透过相应波长范围的发射光。
其型号与激发光滤色片和发射光滤色片相对应。
(二)物镜及目镜各种物镜基本可以应用，但最好选用增称、消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能(波长范围)适合于荧光。
由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。
荧光显微镜的结构及荧光染色
经荧光染料染色的样品放在载物台上 ,先用溴钨灯透射照明 ,用低倍物镜聚焦 ,待寻找到最佳影像后 ,熄灭溴钨灯改用汞灯 .
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5.样品聚焦:
点亮汞灯 ,嵌入系统滤色镜
使用 UVFL 40X(Oil)和 UVFL 100X(Oil) 油浸物镜 ,应用无荧光浸油 ,物镜的内装可变光阑应适当缩小 ,以增大影像反差和清晰度 .
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自发荧光: 组织、细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所呈现的荧光，称为自发荧光 。
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继发性荧光: 组织、细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的某种成分结合后而呈现的荧光为继发性荧光 。
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一、显微镜的成像原理
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荧光显微镜的基本结构和光路图
基本结构: 光源：超高压汞灯,用以产生强光照(含大量紫外光 ,蓝紫光) 滤片系统: 激发滤色镜，提供一定波长范围的激发光 . 阻断滤色镜 ,透过相应波长范围的荧光 ,阻断 或吸收剩余激发光 . 二向分色镜，透射长波光线和反射短波光线的功能 . 荧光物镜 普通显微镜
荧光镜检样品的制作
不能使用本身能产生荧光的药剂 切片标本不能太厚 因石蜡可产生青色荧光，采用石蜡制片时，脱蜡必须彻底。切片进入水后，应充分水洗，再经荧光染料处理。 最好采用萤石玻璃制成的载玻片、盖玻片。 封片时可采用甘油等无荧光的封固剂。
材料: 藻类, 鸭趾草下表皮, 动物结缔组 织, 血细胞, 花粉. 染液: 0.01%丫啶橙染液. 观察藻类，鸭趾草下表面叶绿体的自发荧光 丫啶橙染花粉, 血细胞, 疏松结缔组织。
荧光显微术
了解荧光显微镜的基本构成和基本原理。 初步掌握荧光显微镜的调节步骤和使用。
荧光显微镜的基本原理及应用
减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射 标本。 3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（最好不要短 时间内反复开关，标本应集中观察。）
4 载物台前方黄色遮光板：最好不直接用肉眼看激发 光，以防短波光中的紫外伤害。 5标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。
A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2)
三、荧光显微镜的操作
(1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
4、荧光染料Ho33342和罗丹明123:Ho33342能与细 胞中DNA进行特异的结合，罗丹明123能与线粒
六、荧光组化实验中应注意的几个问题
1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。 当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变， 因此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了 加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一 种特制的表面镀有若干层对不同波长的光 起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖 玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激 发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消 耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。 另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点 击数码成像系统软件，采集数码图像。
细胞培养荧光显微镜的结构
细胞培养荧光显微镜的结构引言：细胞培养荧光显微镜是一种重要的实验工具，广泛应用于生物学、生物医学和生物化学等领域。
它通过荧光探针与细胞内的特定分子相互作用，能够实时观察细胞内的结构和功能。
本文将介绍细胞培养荧光显微镜的主要结构组成及其功能。
一、荧光显微镜的光源系统荧光显微镜的光源系统是实现显微镜成像的关键部分。
它通常由一个或多个光源组成，常见的光源有汞灯、氙灯和LED光源等。
其中，汞灯是最常用的光源之一，它能够提供丰富的波长光线，适用于多种荧光探针的激发。
而氙灯和LED光源则具有更高的亮度和更长的寿命，同时还能够提供更窄的波长范围。
光源系统通常还包括滤光器、偏振器和光路调节装置等，以便调节光源的强度、波长和方向。
二、荧光显微镜的物镜系统物镜系统是荧光显微镜中最重要的部分之一，它决定了显微镜的分辨率和放大倍数。
荧光显微镜的物镜由目镜、物镜和补偿镜组成。
其中，物镜是最关键的部分，它通常具有高数值孔径和长工作距离，以提供较高的分辨率和透射率。
不同的物镜可根据需要选择不同的放大倍数和工作距离，以实现对细胞的不同层次和结构的观察。
三、荧光显微镜的检测系统荧光显微镜的检测系统用于接收和记录荧光信号。
它通常由目镜、物镜和物镜下的探测器组成。
其中，探测器是关键的部分，它能够接收细胞发出的荧光信号，并将其转化为电信号进行放大和处理。
常见的探测器有光电二极管（photomultiplier tube，PMT）和CCD相机等，它们具有较高的灵敏度和动态范围，能够实现高质量的荧光成像。
四、荧光显微镜的成像系统荧光显微镜的成像系统用于将荧光信号转化为可见的图像。
它通常由物镜下的透射光学系统和目镜上的观察光学系统组成。
透射光学系统由物镜、透镜和滤光器等组成，它能够将荧光信号聚焦到探测器上。
观察光学系统由目镜、透镜和滤光器等组成，它能够将成像物体放大并呈现在观察者的眼睛或CCD相机上。
五、荧光显微镜的控制系统荧光显微镜的控制系统用于控制显微镜的各个部分和参数。
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反射荧光显微镜
缺点：
• 在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用 大数值孔径的物镜。 • 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光 。
落射荧光显微镜各部件特性和作用
• 汞灯光源: 提供激发光(U、V、B、G)
• 激发滤色镜: 波长选择
T%
nm
BAND PASS
落射荧光显微镜各部件特性和作用
• 分色镜: 反射激发光,透过荧光
Objects with a sharp rise in refraction index
透射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱 激发滤色镜
落射荧光显微镜的构造
紫外线保护罩
吸收滤色镜 激发滤色镜
孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜
汞灯
Immersion objectives: Remember the refraction index!
T%
＜A 反射
＞A 透过
A
nm
• 吸收滤色镜:
T%
透过荧光,阻挡杂光
water or oil immersion objective medium (water or oil) specimen
Light source
Emission
Excitation DM
refraction index (n)
air 1.00 water = 1.37
oil = 1.5 glass = 1.5
Bright and dark field illumination
Bright field • total illumination of the specimen • direct light collection by objective • dark/colored object on bright background
Immersion objective with specimen
透射荧光显微镜
优点：
• 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因 此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 • 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。 • 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。
透射荧光显微镜
缺点：
• 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧 光像。 • 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。 • 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 • 厚的或不透明的标本不适用。
.自发荧光（不加染色） ; .二次荧光（用化学染色） ; .抗体荧光技术（用免疫染色）;
自发荧光：有些物质不加染色，也能发出荧 光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生 物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。
发射光
激发光
二次荧光（用化学染色）
非荧光性的物质 （蛋白质、炭水化 合物）用荧光色素 染色，由荧光色素 产生荧光（二次荧 光），以便进行观 察。对特定物体选 择合适的荧光色素， 该物体就能和周围 的组织或细胞区别 出来而可以观察到。
反射荧光显微镜
优点：
• 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 • 采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。 • 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高 分辨率的像。 • 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 • 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透 射微分干涉差法相结合。 • 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。
度、荧光效率
荧光显主要部件
透射式
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 暗场聚光镜 • 吸收滤色镜
落射式
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 分色镜 • 吸收滤色镜
暗视野照明方式
聚光镜中央有档 光片，使照明光 线不直接进入物 镜，只允许被标 本反射和衍射的 光线进入物镜， 因而视野的背景 是黑的，物体的 边缘是亮的。
Dark field • part-illumination of the specimen • scattered light collected by objective • bright object on dark background
Objects with high contrast
(with modification )
一种光化荧光
Basic idea of fluorescence microscopy: Stokes shift
excitation level 1
excitation level 2
E1 E = hn
E2 c = n
E~1/
base level
E0
E1
E2
1
2
Stokes shift
荧光的种类
荧光显微镜构造和 应用
Fluorescence microscopy
Mainly fluorescence detector systems are color-blind!
(Colors are based on a [pseudo-]color look-up table)
荧光显微镜的优点和用途
优点： • 检出能力高 • 对细胞的刺激小 • 能进行多重染色 用途： • 物体构造的观察 • 荧光的有无、色调比较进行物质判别 • 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转 变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
抗体荧光技术（用免疫染色） :
利用特定的抗原 必然和特定的抗 体相结合这一个 事实，有意识地 使带荧光标记的 抗体和标本中的 抗原进行抗原/抗 体反应，这样两 者的结合体就能 通过抗体的荧光 观察到。
荧光的性质
• 吸收光 • 保持固有的荧光特性 • 荧光波长＞激发波长（STOKES 法则） • 荧光强度极小于激发光的强度 • 有不同程度的衰减 • 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓
Bright and dark field illumination
dark field without specimen
dark field with specimen
objective
object plane
specimen
condensor
- ring diaphragm (usually) - dark field condensor