翻译好的罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书

罗氏 (Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书

(In situ cell death detection kit-POD法)

一、原理：

TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒

是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况。其

原理是荧光素（ fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移

酶（ TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的

3’-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB ）

反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的

细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3‘-OH 形成，很少能够被染色。本

试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细

胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗

肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂

器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱

布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试

剂：试剂盒含：

1 号（蓝盖） Enzyme Solution 酶溶液： TdT 10×、

2号（紫盖） Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、

3号（棕瓶） Converter-POD:标记荧光素抗体的 HRP；

自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、

70%）、

DAB 工作液（临用前配制， 5 μl 20 ×DAB+1 μL 30%H2O2+94 μl PBS）、

Proteinase K工作液（ 10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、

苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ，

pH 7.5， 10 mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。

三、实验步骤

操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL 反

应液→加 converter-POD→与底物 DAB 反应显色→光学显微镜计数并拍照。

具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：

1.用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min；

2.用梯度乙醇（ 100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理

4.用 Proteinase K工作液处理组织 15-30 min 在 21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的

Proteinase K（400μg/mL ）处理 5 分钟。其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即

蛋白酶 K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：

替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100 溶于 0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）

替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中

8-10 min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于 HCl PH2 ，胰蛋白酶 0.25%-0.5%溶于 0.01N HCl ）

替代方法3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M 的柠檬酸缓冲液 PH 6 的塑料盒中，

置于微波炉中 350W（低档）处理 5 min。

5.PBS 漂洗 2 次；

6.制备 TUNEL 反应混合液：

处理组用 50μl 1 号液+450μl 2 号液混匀；

而阴性对照组仅加50μl 2号液，

阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在 15~25℃× 10min，后面步骤同处理组。

7.玻片干后，加 50μl TUNEL 反应混合液（阴性对照组仅加 50μl 2号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃× 1h。

8.PBS 漂洗 3 次；

9.可以加 1 滴 PBS 在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为

450~500nm，检测波长为 515~565nm）；

10.玻片干后加 50μl 3号液（ converter-POD）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应 37℃× 30min。

11.PBS漂洗 3 次；

12.在组织处加 50~100μl DAB 底物，反应 15~25℃× 10min；

13.PBS 漂洗 3 次；

14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯

度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

15.加一滴 PBS 或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500 个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断

（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，

贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状 /凋亡小体）对于培养细胞的预处理：

①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，

干燥后 4℃保存；

②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106 个细胞， PBS 洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载

玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的

载玻片在 4%多聚甲醛中固定 25min；

④PBS 浸洗二次，每次 5min；

⑤将吸附细胞的载玻片在 0.2%的 Triton X-100 中处理 5min；

⑥PBS 浸洗二次，每次 5min；