原位杂交技术ppt课件
合集下载
原位杂交技术ppt课件
探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。
分类
1、 基因组原位杂交技术 基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。
它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作 封阻，在靶染色体上进行原位杂交。 2、荧光原位杂交技术
3 、多彩色荧光原位杂交技术 多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧 光原位杂交技术的基础上发展起来的 一种新技术，它用几种不同颜色的荧 光素单独或混合标记的探针进行原位 杂交，能同时检测多个靶位，各靶位 在荧光显微镜下和照片上的颜色不同， 呈现多种色彩。
4、原位PCR
原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过 PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数 增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定 位和定量分析。
1、标记物
①高度灵敏性； ②标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模
板的结合能力及结合的特异性； ③当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多
大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活 性； ④高度特异性； ⑤较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单 ； ⑥对环境无污染，对人体无损伤； ⑦价格低廉等。
荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性 原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记 的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切 片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系 统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或 DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂 交位点。
分类
1、 基因组原位杂交技术 基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。
它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作 封阻，在靶染色体上进行原位杂交。 2、荧光原位杂交技术
3 、多彩色荧光原位杂交技术 多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧 光原位杂交技术的基础上发展起来的 一种新技术，它用几种不同颜色的荧 光素单独或混合标记的探针进行原位 杂交，能同时检测多个靶位，各靶位 在荧光显微镜下和照片上的颜色不同， 呈现多种色彩。
4、原位PCR
原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过 PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数 增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定 位和定量分析。
1、标记物
①高度灵敏性； ②标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模
板的结合能力及结合的特异性； ③当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多
大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活 性； ④高度特异性； ⑤较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单 ； ⑥对环境无污染，对人体无损伤； ⑦价格低廉等。
荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性 原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记 的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切 片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系 统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或 DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂 交位点。
分子病理检测平台原位杂交PPT课件
❖ CEN-17均值<1.75 亚二体性
❖ CEN-17均值 1.76-2.25 二体性
❖ CEN-17均值 2.26-3.75 低多体性
❖ CEN-17均值>3.76
高多体性
29ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
乳腺癌HER-2 FISH评分标准
石蜡切片（ASCO/CAP 2013指南）
➢ 计数至少30个细胞，统计Ratio值（Ratio值＝30个细胞核中红/绿）。 Ratio≥2.0或者＜2.0但HER-2信号数为≥6.0，结果为阳性，提示基因扩增； Ratio＜2.0且HER-2信号数＜4.0为阴性结果，提示样本无基因扩增； Ratio＜2.0且4.0≤HER-2信号数＜6.0时结果为不确定，可以选择增加计数 胞至100个,或重做FISH实验来判断最终结果。
❖ 1.EBER ❖ 2.HPV ❖ 3. Kappa和Lamda
❖ 荧光原位杂交的原理及探针类型 ❖ 荧光原位杂交的应用
❖ 1.实体性肿瘤 ❖ 2. 淋巴造血系统肿瘤 ❖ 3. 产前诊断
20
荧光原位杂交（FISH）
❖ 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA 靶序列杂交
❖ 用途：检测基因异常
❖ 2.淋巴造血系统疾病
❖ 淋巴瘤诊断分型，检测特异染色体易位，协助淋巴瘤分类； ❖ 慢性粒细胞白血病等白血病及多发性骨髓瘤FISH检测，判断预后等。
❖ 3.产前诊断
❖ 唐氏综合症（21三体）等产前染色体数目检测，协助产前诊断。
22
结果判读、分析
❖ 计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞，细胞核轮廓 不清或有重叠的不要分析。
❖ 1.基因片段扩增
2.基因片段缺失
3.基因片段易位
原位杂交技术ppt课件
10
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
11
2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern 印记杂交、qPCR、RT-PCR等。
49
（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关 的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照
50
五. 实验结果可能的问题和原因
1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮 或脱片
25
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
26
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
27
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
11
2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
提取标本DNA和RNA进行Southern和Northern 印记杂交、qPCR、RT-PCR等。
49
（4）RNA酶或DNA酶预先处理标本后杂交反应 （5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关 的核酸探针进行杂交。 （6）探针孵育后的检测系统对照
50
五. 实验结果可能的问题和原因
1. 标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮 或脱片
25
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
26
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
27
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
原位杂交ppt课件
对于内源性的AKP和过氧化物酶可通过将标本分别浸于20%乙酸(4℃) 中15秒或过碘酸淋洗和用含1%H2O2的蒸馏水或甲醇溶液室温孵育 30min加以阻断。
21
杂交反应
用杂交液孵育组织切片，杂交液中标记的核酸探针在适当的条 件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。
双链DNA探针和靶DNA变性
杂交反应进行时，探针和靶核酸必须是单链。
8
复性（renaturation）
指变性的DNA(单链)在适当的条件下，两条彼此分开的 多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋 结构
复性的影响因素
温度 DNA浓度 DNA片段长度 DNA分子的复杂性 离子强度
9
第二节 核酸分子杂交
两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原 理形成双链核酸的过程
7
DNA变性(denaturation)
指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。
变性温度（melting temperature,Tm）
热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。
影响Tm的因素
DNA的均一性 DNA分子中的（G+C）含量 溶剂的性质
低离子强度，Tm低 高pH 变性剂甲酰胺
影响杂交体稳定性的因素
杂交双链的碱基组成 杂交双链的长度 碱基错配程度 离子强度 变性剂浓度
10
核酸分子杂交
液相杂交 固相杂交
11
原位杂交组织化学(ISH)
应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测 的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂 交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。
第五章 原位杂交组织化学
(in situ hybridization histochemistry)
21
杂交反应
用杂交液孵育组织切片，杂交液中标记的核酸探针在适当的条 件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。
双链DNA探针和靶DNA变性
杂交反应进行时，探针和靶核酸必须是单链。
8
复性（renaturation）
指变性的DNA(单链)在适当的条件下，两条彼此分开的 多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋 结构
复性的影响因素
温度 DNA浓度 DNA片段长度 DNA分子的复杂性 离子强度
9
第二节 核酸分子杂交
两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原 理形成双链核酸的过程
7
DNA变性(denaturation)
指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。
变性温度（melting temperature,Tm）
热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。
影响Tm的因素
DNA的均一性 DNA分子中的（G+C）含量 溶剂的性质
低离子强度，Tm低 高pH 变性剂甲酰胺
影响杂交体稳定性的因素
杂交双链的碱基组成 杂交双链的长度 碱基错配程度 离子强度 变性剂浓度
10
核酸分子杂交
液相杂交 固相杂交
11
原位杂交组织化学(ISH)
应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测 的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂 交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。
第五章 原位杂交组织化学
(in situ hybridization histochemistry)
原位杂交组织化学幻灯片PPT
当溶液中的DNA分子经高温或高PH处理后，DNA双 链分子会变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降 或pH恢复到中性（复性），单链会按照碱基互补配 对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。 无论两条单链来源是否相同，只要它们之间的碱基 顺序互补或者部分互补，在条件适宜时，就可以全 部或部分复性，产生分子杂交重和多重原位杂交技术
放射性同位素和非放射性标记探针的双重标 记原位杂交
常用的放射性同位素标记物为35S，非放射性标 记物为生物素和地高辛。
非放射性标记探针的双重标记原位杂交
应用生物素和地高辛标记探针的双重标记原位 杂交
双重荧光标记原位杂交
两种同位素标记探针的双重标记原位杂交
探针长度 50-300个碱基，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂 交率高，杂交时间短。
探针浓度 0.5-5.0μg/ml 。
杂交温度和时间 大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便， 将杂交液和标本孵育过夜
四、杂交后处理
杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度 盐溶液的漂洗
间接FISH
Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号
3. 多色FISH
通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合 (直接法)，在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜 色标记，同时检测多种染色体异常。
多色FISH
4.FIBER FISH
将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维， 然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后 用荧光显微镜观察结果并分析.
包含了PCR和FISH二种方法的特点，在染色体重排方面可 选择性的代替FISH技术，在使用PRINS技术时,用简单的寡 核苷酸引物代替探针，原位标记染色体，消除了制备DNA 探针困难的问题。
放射性同位素和非放射性标记探针的双重标 记原位杂交
常用的放射性同位素标记物为35S，非放射性标 记物为生物素和地高辛。
非放射性标记探针的双重标记原位杂交
应用生物素和地高辛标记探针的双重标记原位 杂交
双重荧光标记原位杂交
两种同位素标记探针的双重标记原位杂交
探针长度 50-300个碱基，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂 交率高，杂交时间短。
探针浓度 0.5-5.0μg/ml 。
杂交温度和时间 大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便， 将杂交液和标本孵育过夜
四、杂交后处理
杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度 盐溶液的漂洗
间接FISH
Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号
3. 多色FISH
通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合 (直接法)，在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜 色标记，同时检测多种染色体异常。
多色FISH
4.FIBER FISH
将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维， 然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后 用荧光显微镜观察结果并分析.
包含了PCR和FISH二种方法的特点，在染色体重排方面可 选择性的代替FISH技术，在使用PRINS技术时,用简单的寡 核苷酸引物代替探针，原位标记染色体，消除了制备DNA 探针困难的问题。
原位杂交技术原理及其应用课件
• 光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低， 但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一 个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探 针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度。
原位杂交技术原理及其应用
• 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科 技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－ chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药 盒投放市场。
液中。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液 相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交 等
原位杂交技术原理及其应用
❖固相杂交是将参加反应的一硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、 乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游 离在溶液中。固相杂交包括：
❖菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、 ❖斑点杂交（Dot blot）、 ❖Southern印迹杂交（Southern blot） ❖Northern印迹杂交（Northern blot） ❖组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），
➢ Aromase gene ➢The rat brain section
原位杂交技术原理及其应用
培养细胞
原位杂交技术原理及其应用
原位杂交组织化学技术发展
• 1961年，Hall 液相核酸杂交技术
• 1969年，Gall 和Pardue 用爪蟾核糖体基因探针 与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞 的核仁中。
• 1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利 用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因 定位，创造了原位杂交细胞或组织化学技术。
• Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探 针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次 用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当 时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针 均采用同位素标记。
原位杂交技术原理及其应用
• 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科 技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－ chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药 盒投放市场。
液中。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液 相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交 等
原位杂交技术原理及其应用
❖固相杂交是将参加反应的一硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、 乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游 离在溶液中。固相杂交包括：
❖菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、 ❖斑点杂交（Dot blot）、 ❖Southern印迹杂交（Southern blot） ❖Northern印迹杂交（Northern blot） ❖组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），
➢ Aromase gene ➢The rat brain section
原位杂交技术原理及其应用
培养细胞
原位杂交技术原理及其应用
原位杂交组织化学技术发展
• 1961年，Hall 液相核酸杂交技术
• 1969年，Gall 和Pardue 用爪蟾核糖体基因探针 与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞 的核仁中。
• 1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利 用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因 定位，创造了原位杂交细胞或组织化学技术。
• Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探 针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次 用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当 时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针 均采用同位素标记。
实验七 植物mRNA原位杂交技术-PPT精选文档
3、纳瓦兴（Navaschjn‘s）固定液：植物制片技术中广泛 应用。配方：75 ml 1%铬酸，5 ml冰醋酸和20 ml福尔 马林混合。根据实验材料的种类，目前有很多的改良液， 效果更好。
材料脱水
材料洗涤后，如果材料含有水分，水与石蜡不能 相溶，通常用酒精脱水。材料由水入酒精中，由 低浓度酒精渐至高浓度酒精。通常由30%、50%、 70%、80%到90%酒精，每次须经半小时左右， 具体的时间由材料大小而定。
实
原位杂交（in situ hybridization）是一种在细胞水 平上研究基因表达调控的最直接有效的分子生物 学技术。
RNA原位杂交是用同位素标记或非同位素标记的 双链DNA或单链反义RNA探针对组织切片或装片 的不同细胞中基因产物mRNA或rRNA进行原位定 位。分布于细胞中的mRNA与反义RNA探针互补而 杂交产生双链的RNA。标记在反义链上的同位素 经放射自显影、非同位素经酶促免疫显色或免疫 荧光反应，均可显示mRNA在植物组织细胞中的分 布位置。用标记的有义RNA作探针，由于与细胞 内的mRNA不互补而不能杂交，可以作为对照。
地高辛标记的体外转录 （12月3日）
1、按照下表将各成分加入EP管中，混匀后在37 ℃保温2小时；
2、加入2 μl无RNase的DNaseI，37℃保温15分钟； 3、加入2 μl 0.2 mol/L EDTA终止反应； 4、加入2.5 μl 4 mol/L LiCl 和75 μl冰冷的100%乙醇，沉淀过夜； 5、12000 rpm，4 ℃离心15分钟。用70%冷乙醇清洗后在室温下进行干燥。 6、根据沉淀物的多少（一般为6-10 μg），重悬于30-50 μl DEPC-H2O中，
九、封片观察（12月6日）
1、将载玻片转入缓冲液III（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8）中，浸5分钟，终止反应。
材料脱水
材料洗涤后，如果材料含有水分，水与石蜡不能 相溶，通常用酒精脱水。材料由水入酒精中，由 低浓度酒精渐至高浓度酒精。通常由30%、50%、 70%、80%到90%酒精，每次须经半小时左右， 具体的时间由材料大小而定。
实
原位杂交（in situ hybridization）是一种在细胞水 平上研究基因表达调控的最直接有效的分子生物 学技术。
RNA原位杂交是用同位素标记或非同位素标记的 双链DNA或单链反义RNA探针对组织切片或装片 的不同细胞中基因产物mRNA或rRNA进行原位定 位。分布于细胞中的mRNA与反义RNA探针互补而 杂交产生双链的RNA。标记在反义链上的同位素 经放射自显影、非同位素经酶促免疫显色或免疫 荧光反应，均可显示mRNA在植物组织细胞中的分 布位置。用标记的有义RNA作探针，由于与细胞 内的mRNA不互补而不能杂交，可以作为对照。
地高辛标记的体外转录 （12月3日）
1、按照下表将各成分加入EP管中，混匀后在37 ℃保温2小时；
2、加入2 μl无RNase的DNaseI，37℃保温15分钟； 3、加入2 μl 0.2 mol/L EDTA终止反应； 4、加入2.5 μl 4 mol/L LiCl 和75 μl冰冷的100%乙醇，沉淀过夜； 5、12000 rpm，4 ℃离心15分钟。用70%冷乙醇清洗后在室温下进行干燥。 6、根据沉淀物的多少（一般为6-10 μg），重悬于30-50 μl DEPC-H2O中，
九、封片观察（12月6日）
1、将载玻片转入缓冲液III（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8）中，浸5分钟，终止反应。
荧光原位杂交(FISH)_ppt课件
肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
探针的制备
探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
探针的分类
根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
FISH的基本原理
FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。
荧光原位杂交(FISH)技术.ppt
__ 第二天丢弃洗液
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
需要的主要设备
荧光显微镜 在荧光显微镜下，DNA探针上
的荧光基团在一定波长的激发光激发后会发 出一定颜色的光线。射入光激发荧光分子， 荧光分子随后发出光子，发出的光子具有较 长的波长 – 较低的能量荧光标记的探针与其 靶标结合后 – 将能检测到荧光信号
水浴箱2台、热台1个，恒温箱1台。（或 者只需1台FISH杂交仪）。
将滴好的片子放在2×SSC中，37 ℃ 1小时老化。
将玻片放到新鲜配置的胃蛋白酶溶液37 ℃杂交预处理 13 mins 。
PBS洗，后固定液固定10分钟，PBS洗，晾干后70%的酒精1 min，85%的酒精1 min，100%的酒精1 min 酒精梯度脱水 。
实验程序3 变性杂交
玻片变性，73±1 ℃ 5mins 。关键步骤！！ 20 ℃ 冷冻的70%的酒精1 min85%的酒精1 min100% 的酒精1 min 酒精梯度脱水 。在45-50 ℃热台上使 玻片完全干燥 。---保持DNA单链状态。
二、细胞间期和分裂中期相中的染色体计数
识别和确定染色体易位
单个位点或基因的缺失/扩增
中期分裂相染色体涂片识别某染色体
FISH技术优点
标本多样性：细胞涂片（绒毛、精子、卵裂
球PGD等） 脱落细胞收集制片（羊水等）。
客观判断 高灵敏性 高特异性 定量分析、重复性好 在同一标本中同时评价多个基因的改变 DNA的稳定性
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
需要的主要设备
荧光显微镜 在荧光显微镜下，DNA探针上
的荧光基团在一定波长的激发光激发后会发 出一定颜色的光线。射入光激发荧光分子， 荧光分子随后发出光子，发出的光子具有较 长的波长 – 较低的能量荧光标记的探针与其 靶标结合后 – 将能检测到荧光信号
水浴箱2台、热台1个，恒温箱1台。（或 者只需1台FISH杂交仪）。
将滴好的片子放在2×SSC中，37 ℃ 1小时老化。
将玻片放到新鲜配置的胃蛋白酶溶液37 ℃杂交预处理 13 mins 。
PBS洗，后固定液固定10分钟，PBS洗，晾干后70%的酒精1 min，85%的酒精1 min，100%的酒精1 min 酒精梯度脱水 。
实验程序3 变性杂交
玻片变性，73±1 ℃ 5mins 。关键步骤！！ 20 ℃ 冷冻的70%的酒精1 min85%的酒精1 min100% 的酒精1 min 酒精梯度脱水 。在45-50 ℃热台上使 玻片完全干燥 。---保持DNA单链状态。
二、细胞间期和分裂中期相中的染色体计数
识别和确定染色体易位
单个位点或基因的缺失/扩增
中期分裂相染色体涂片识别某染色体
FISH技术优点
标本多样性：细胞涂片（绒毛、精子、卵裂
球PGD等） 脱落细胞收集制片（羊水等）。
客观判断 高灵敏性 高特异性 定量分析、重复性好 在同一标本中同时评价多个基因的改变 DNA的稳定性
荧光原位杂交(FISH)技术.ppt
CEP 18 CEP X CEP Y
LSI 21 LSI 13
产前诊断异常核型
羊水标本，未培养，XY, +18。
CEP 18 CEP X CEP Y
LSI 21 LSI 13
24色染色体涂染
比较基因组杂交(Comparative genomic hybridiation,CGH)
比较基因 组杂交 (CGH)
实验程序5 显微镜下观察
选择杂交最好的区域来观察结果 1. 用25X 的物镜扫描整个杂交区域 2. 选择分散较好的区域间期细胞重叠较少或
者分裂相较多的区域观察 3. 用40X 或者 100X物镜 开始从左到右从上到
下计数分析. 4. 计数50个细胞核。 5. 当出现10 – 60% 的嵌和体时，需要计数200
FISH杂交仪
荧光显微镜
光源
滤光片： 一定波长 的光能通 过，其余 波长的光 滤掉，保 证只有需 要的荧光 被激发。
实验程序
样品染色体DNA变性 探针变性 杂交过夜 洗涤复染 显微观察
实验程序1 样本 收集
__AneuVysion kit主要用于培养后的以及未经培养的羊水 __样本必须按照ACT手册的推荐的方法收集 __样本收集必须要保证最小程度的母体细胞污染 __羊水最小需要量为2-5ml,这个依赖与孕周龄 __从收集羊水细胞到培养之间的间隔尽量要短（最晚
__ 第二天丢弃洗液
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
最新原位杂交与凋亡检测技术ppt课件
HL-60 APO-BRDU
鼻咽癌细胞Hoechst33342/PI双染荧光显微镜 ×400
（三）凋亡细胞的电镜观察： 1、组织处理：组织、细胞固定、包埋、 染色与一般电镜标本相同。
3、细胞形态： （1）凋亡细胞：体积缩小，胞浆浓缩、 红染，核固缩深染或碎裂。 （2）凋亡小体（嗜酸性小体）：被巨噬细 胞或上皮细胞吞噬或游离的凋亡细胞。圆形 或卵圆形、大小不等，胞浆浓缩，强嗜酸性， 可有或无固缩深染的核碎片。
食管鳞癌细胞系石蜡切片HE染色
（二）荧光显微镜下形态：荧光显微镜下凋亡 细胞呈黄色。 1、 荧光染料： PI(propidium iodide) 5~10ug/ml DAPI（4’，6’—diamidino-2-phenylindole）
级分别为 1、2、3分。
4、 用计算机辅助的图像分析、显微分 光度计或图像分析仪对不同类型核酸显色 数量和强度进行检测。
七、原位杂交结合免疫组织化学双标记法： 原位分子杂交检测DNA或RNA，能进
行基因定位或在转录水平上研究基因表达； 免疫组织化学检测细胞和组织内蛋白抗原 成分，在翻译水平上研究基因表达。二者 结合起来，形成一个新的分子检测系统， 对于深入研究基因扩增、表达的调控与疾 病的发生机理有广泛的应用前景。
（四）、增强组织的通透性和核酸探针 的穿透性： 1、Triton X-100 2、蛋白酶K（Proteinase K 1ug/ml）
37 0C 15~20 min 3、胃蛋白酶（Pepsin 20~100ug/ml）
37 0C 30 min 上述酶消化后用4%多聚甲醛后固定。
（五） 减低背景染色 1、乙酸酐和三乙醇胺浸洗，以减低静 电效应。 2、杂交后酶处理。 3、杂交后洗涤。
肝细胞癌 CD44V6 mRNA（+）， ISH
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
较放射性标记系统安全，方便、省时间 定位准确，杂交背景好
16
17
地高辛标记探针的显色检测 常用免疫酶学显色检测方法有两类： Dig-HRP检测系统
以DAB/H2O2为底物，结果为棕色； 以4-氯-1-萘酚/ H2O2为底物，结果为蓝色。 Dig-AKP检测体系 以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。
Vermot J. 2000. Endocrinology.
Xie HR et al. 2007. PANS
35S
35S
14
(2)非放射性标记物 生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、 碱性磷酸酶等。 特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时 短，标记探针可较长时间的保存和使用
15
地高辛（Digoxigenin 简写Dig-） 类固醇半抗原分子 人及多种动物体内不存在类似的物质，无交 叉反应 特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似
显色
杂交
23
原位杂交技术的基本步骤与原理
原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的 包括：组织和器材的特殊处理
取材、固定、切片 杂交前处理 探针的制备和预杂交 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析
24
（一）器材的特殊处理 DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的 石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA 原位杂交 RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方 法不能将其灭活。因此，当检测RNA或用RNA 作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要 注意预防
12
3. 寡核苷酸
短链探针(长度10-50个核苷酸)
根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上合成
优点：形成杂交体快速(序列短，杂交时易于穿透)
缺点：特异性较低（短链和简单）
13
(三)探针的标记 1. 标记物 (1)放射性标记物
3H、32P、35S、125I等。 特点：敏感性高
半衰期，放射性污染，成本高，耗时长
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
27
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态 结构。 基本与免疫组织化学技术相似。 取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制 处理的器具接触标本
复性
RNA
DNA
8
二、探针（probe）
(一)定义： 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或 RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞 内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂， 探针的碱基序列是已知的，只能与特定的 核酸分子结合上
9
(二)探针的分类 根据探针的核酸性质分为 DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、 寡核苷酸探针
20
②随机引物法
随机引物能与各种单链DNA模板结合 DNA聚合酶按53方向合成一新的 DNA链。 带标记的核苷酸掺入到新合成的DNA 分子中
21
(2)RNA探针标记 在体外转录技术中与探针制备同时完成
(3)寡核苷酸探针标记 末端转移法
22
三、原位杂交技术的基本步骤
观察、照相 取材、切片
C CCCCC
18
Diao HL. 2007. Fertil & Steril
地高辛
在植入期子宫中的定位
19
2. 标记方法 (1)DNA探针标记
①切口移位法
DNase I在DNA双链上造成单链切口
DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切 口处将旧链从5末端逐步切除
在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，将 dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新 的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入
6
热变性 解链曲线
熔解温度(, Tm)
变性是在一个相当窄的温 度范围内完成，在这一范 围 内 ， 双 链 DNA 变 性 一 半 所 需 要 的 温 度 称 为 DNA 的 解链温度，又称熔解温度, Tm)。其大小与G+C含量成 正比。
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
7
DNA复性 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复双螺 旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火。
3
(二) 基本原理 碱基互补配对原理
4
加热变性
杂交反应
酶显色反应
带标记物的探针
酶标记的抗探针标记物的抗体
5
(三)DNA变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开
成两条单链的过程。 方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、
甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。
本质是双链间氢键的断裂
25
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
26
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
28
标本的储存 所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用 DEPC水清洗。 为防止RNA迅速降解，标本离体切小，迅速投入4％ 多聚甲醛溶液内，置4℃冰箱内2-4小时。 再将组织移入30％蔗糖PBS溶液内，4℃冰箱内过夜。 次日可将标本储存于-80℃ 低温冰箱内保存。
10
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
11
2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
形态学实验技术
第四章 原位杂交技术
李成仁 组织胚胎学教研室
Tel：752220，Emai子原位杂交
免疫组织化学
2
一、核酸分子原位杂交的基本概念
(一)定义 简称原位杂交 用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核 酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行 定性、定位和相对定量分析。
16
17
地高辛标记探针的显色检测 常用免疫酶学显色检测方法有两类： Dig-HRP检测系统
以DAB/H2O2为底物，结果为棕色； 以4-氯-1-萘酚/ H2O2为底物，结果为蓝色。 Dig-AKP检测体系 以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。
Vermot J. 2000. Endocrinology.
Xie HR et al. 2007. PANS
35S
35S
14
(2)非放射性标记物 生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、 碱性磷酸酶等。 特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时 短，标记探针可较长时间的保存和使用
15
地高辛（Digoxigenin 简写Dig-） 类固醇半抗原分子 人及多种动物体内不存在类似的物质，无交 叉反应 特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似
显色
杂交
23
原位杂交技术的基本步骤与原理
原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的 包括：组织和器材的特殊处理
取材、固定、切片 杂交前处理 探针的制备和预杂交 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析
24
（一）器材的特殊处理 DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的 石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA 原位杂交 RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方 法不能将其灭活。因此，当检测RNA或用RNA 作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要 注意预防
12
3. 寡核苷酸
短链探针(长度10-50个核苷酸)
根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上合成
优点：形成杂交体快速(序列短，杂交时易于穿透)
缺点：特异性较低（短链和简单）
13
(三)探针的标记 1. 标记物 (1)放射性标记物
3H、32P、35S、125I等。 特点：敏感性高
半衰期，放射性污染，成本高，耗时长
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
27
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态 结构。 基本与免疫组织化学技术相似。 取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制 处理的器具接触标本
复性
RNA
DNA
8
二、探针（probe）
(一)定义： 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或 RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞 内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂， 探针的碱基序列是已知的，只能与特定的 核酸分子结合上
9
(二)探针的分类 根据探针的核酸性质分为 DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、 寡核苷酸探针
20
②随机引物法
随机引物能与各种单链DNA模板结合 DNA聚合酶按53方向合成一新的 DNA链。 带标记的核苷酸掺入到新合成的DNA 分子中
21
(2)RNA探针标记 在体外转录技术中与探针制备同时完成
(3)寡核苷酸探针标记 末端转移法
22
三、原位杂交技术的基本步骤
观察、照相 取材、切片
C CCCCC
18
Diao HL. 2007. Fertil & Steril
地高辛
在植入期子宫中的定位
19
2. 标记方法 (1)DNA探针标记
①切口移位法
DNase I在DNA双链上造成单链切口
DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切 口处将旧链从5末端逐步切除
在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，将 dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新 的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入
6
热变性 解链曲线
熔解温度(, Tm)
变性是在一个相当窄的温 度范围内完成，在这一范 围 内 ， 双 链 DNA 变 性 一 半 所 需 要 的 温 度 称 为 DNA 的 解链温度，又称熔解温度, Tm)。其大小与G+C含量成 正比。
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
7
DNA复性 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复双螺 旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火。
3
(二) 基本原理 碱基互补配对原理
4
加热变性
杂交反应
酶显色反应
带标记物的探针
酶标记的抗探针标记物的抗体
5
(三)DNA变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开
成两条单链的过程。 方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、
甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。
本质是双链间氢键的断裂
25
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
26
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
28
标本的储存 所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用 DEPC水清洗。 为防止RNA迅速降解，标本离体切小，迅速投入4％ 多聚甲醛溶液内，置4℃冰箱内2-4小时。 再将组织移入30％蔗糖PBS溶液内，4℃冰箱内过夜。 次日可将标本储存于-80℃ 低温冰箱内保存。
10
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
11
2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
形态学实验技术
第四章 原位杂交技术
李成仁 组织胚胎学教研室
Tel：752220，Emai子原位杂交
免疫组织化学
2
一、核酸分子原位杂交的基本概念
(一)定义 简称原位杂交 用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核 酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行 定性、定位和相对定量分析。