原位杂交技术ppt课件
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18
Diao HL. 2007. Fertil & Steril
地高辛
在植入期子宫中的定位
19
2. 标记方法 (1)DNA探针标记
①切口移位法
DNase I在DNA双链上造成单链切口
DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切 口处将旧链从5末端逐步切除
在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，将 dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新 的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入
较放射性标记系统安全，方便、省时间 定位准确，杂交背景好
16
17
地高辛标记探针的显色检测 常用免疫酶学显色检测方法有两类： Dig-HRP检测系统
以DAB/H2O2为底物，结果为棕色； 以4-氯-1-萘酚/ H2O2为底物，结果为蓝色。 Dig-AKP检测体系 以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。
Vermot J. 2000. Endocrinology.
Xie HR et al. 2007. PANS
35S
35S
14
(2)非放射性标记物 生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、 碱性磷酸酶等。 特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时 短，标记探针可较长时间的保存和使用
15
地高辛（Digoxigenin 简写Dig-） 类固醇半抗原分子 人及多种动物体内不存在类似的物质，无交 叉反应 特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似
28
标本的储存 所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用 DEPC水清洗。 为防止RNA迅速降解，标本离体切小，迅速投入4％ 多聚甲醛溶液内，置4℃冰箱内2-4小时。 再将组织移入30％蔗糖PBS溶液内，4℃冰箱内过夜。 次日可将标本储存于-80℃ 低温冰箱内保存。
25
去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
26
(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
27
(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态 结构。 基本与免疫组织化学技术相似。 取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制 处理的器具接触标本
10
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
11
2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
20
②随机引物法
随机引物能与各种单链DNA模板结合 DNA聚合酶按53方向合成一新的 DNA链。 带标记的核苷酸掺入到新合成的DNA 分子中
21
(2)RNA探针标记 在体外转录技术中与探针制备同时完成
(3)寡核苷酸探针标记 末端转移法
22
三、原位杂交技术的基本步骤
观察、照相 取材、切片
C CCCCC
6
热变性 解链曲线
熔解温度(, Tm)
变性是在一个相当窄的温 度范围内完成，在这一范 围 内 ， 双 链 DNA 变 性 一 半 所 需 要 的 温 度 称 为 DNA 的 解链温度，又称熔解温度, Tm)。其大小与G+C含量成 正比。
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
7
DNA复性 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复双螺 旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火。
显色
杂交
23
原位杂交技术的基本步骤与原理
原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的 包括：组织和器材的特殊处理
取材、固定、切片 杂交前处理 探针的制备和预杂交 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析
24
（一）器材的特殊处理 DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的 石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA 原位杂交 RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方 法不能将其灭活。因此，当检测RNA或用RNA 作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要 注意预防
形态学实验技术
第四章 原位杂交技术
李成仁 组织胚胎学教研室
Tel：752220，Email：lichengren@sohu.com
1
中心法则
？
核酸分子原位杂交
免疫组织化学
2
一、核酸分子原位杂交的基本概念
(一)定义 简称原位杂交 用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核 酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行 定性、定位和相对定量分析。
12
3. 寡核苷酸
短链探针(长度10-50个核苷酸)
根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上合成
优点：形成杂交体快速(序列短，杂交时易于穿透)
缺点：特异性较低（短链和简单）
13
(三)探针的标记 1. 标记物 (1)放射性标记物
3H、32P、35S、125I等。 特点：敏感性高
半衰期，放射性污染，成本高，耗时长
复性
RNA
DNA
8
二、探针（probe）
(一)定义： 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或 RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞 内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂， 探针的碱基序列是已知的，只能与特定的 核酸分子结合上
9
(二)探针的分类 根据探针的核酸性质分为 DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、 寡核苷酸探针
3
(二) 基本原理 碱基互补配对原理
4
加热变性
杂交Leabharlann Baidu应
酶显色反应
带标记物的探针
酶标记的抗探针标记物的抗体
5
(三)DNA变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开
成两条单链的过程。 方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、
甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。
本质是双链间氢键的断裂
Diao HL. 2007. Fertil & Steril
地高辛
在植入期子宫中的定位
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2. 标记方法 (1)DNA探针标记
①切口移位法
DNase I在DNA双链上造成单链切口
DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切 口处将旧链从5末端逐步切除
在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，将 dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新 的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入
较放射性标记系统安全，方便、省时间 定位准确，杂交背景好
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地高辛标记探针的显色检测 常用免疫酶学显色检测方法有两类： Dig-HRP检测系统
以DAB/H2O2为底物，结果为棕色； 以4-氯-1-萘酚/ H2O2为底物，结果为蓝色。 Dig-AKP检测体系 以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。
Vermot J. 2000. Endocrinology.
Xie HR et al. 2007. PANS
35S
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(2)非放射性标记物 生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、 碱性磷酸酶等。 特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时 短，标记探针可较长时间的保存和使用
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地高辛（Digoxigenin 简写Dig-） 类固醇半抗原分子 人及多种动物体内不存在类似的物质，无交 叉反应 特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似
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标本的储存 所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用 DEPC水清洗。 为防止RNA迅速降解，标本离体切小，迅速投入4％ 多聚甲醛溶液内，置4℃冰箱内2-4小时。 再将组织移入30％蔗糖PBS溶液内，4℃冰箱内过夜。 次日可将标本储存于-80℃ 低温冰箱内保存。
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去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法：
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘 烤（180-200℃干烤4-6小时）
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法：
焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒
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(1)取材的器具用火焰灼烧过或高温消毒 (2)标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNA酶 (3)所用玻璃器皿均须DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸馏
水清洗后高压消毒，然后180℃处理3h以上 (4)塑料器材最好用灭菌的一次性用品或DEPC处理 整个操作过程带手套和口罩。
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(二)取 材 目的：既要充分保留被测核酸，（特别是RNA）不
被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态 结构。 基本与免疫组织化学技术相似。 取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制 处理的器具接触标本
10
1. cDNA(complementary DNA) 互补于mRNA的DNA分子 （长度为数百-数千碱基对）
优点 ⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
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2. RNA RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对） 优点：
⑴ 杂交效率比DNA探针高 ⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比 DNA-mRNA杂交体稳定 缺点：容易受RNA酶的污染而被降解
20
②随机引物法
随机引物能与各种单链DNA模板结合 DNA聚合酶按53方向合成一新的 DNA链。 带标记的核苷酸掺入到新合成的DNA 分子中
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(2)RNA探针标记 在体外转录技术中与探针制备同时完成
(3)寡核苷酸探针标记 末端转移法
22
三、原位杂交技术的基本步骤
观察、照相 取材、切片
C CCCCC
6
热变性 解链曲线
熔解温度(, Tm)
变性是在一个相当窄的温 度范围内完成，在这一范 围 内 ， 双 链 DNA 变 性 一 半 所 需 要 的 温 度 称 为 DNA 的 解链温度，又称熔解温度, Tm)。其大小与G+C含量成 正比。
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
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DNA复性 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复双螺 旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火。
显色
杂交
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原位杂交技术的基本步骤与原理
原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的 包括：组织和器材的特殊处理
取材、固定、切片 杂交前处理 探针的制备和预杂交 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析
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（一）器材的特殊处理 DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的 石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA 原位杂交 RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方 法不能将其灭活。因此，当检测RNA或用RNA 作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要 注意预防
形态学实验技术
第四章 原位杂交技术
李成仁 组织胚胎学教研室
Tel：752220，Email：lichengren@sohu.com
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中心法则
？
核酸分子原位杂交
免疫组织化学
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一、核酸分子原位杂交的基本概念
(一)定义 简称原位杂交 用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核 酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行 定性、定位和相对定量分析。
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3. 寡核苷酸
短链探针(长度10-50个核苷酸)
根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上合成
优点：形成杂交体快速(序列短，杂交时易于穿透)
缺点：特异性较低（短链和简单）
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(三)探针的标记 1. 标记物 (1)放射性标记物
3H、32P、35S、125I等。 特点：敏感性高
半衰期，放射性污染，成本高，耗时长
复性
RNA
DNA
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二、探针（probe）
(一)定义： 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或 RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞 内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂， 探针的碱基序列是已知的，只能与特定的 核酸分子结合上
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(二)探针的分类 根据探针的核酸性质分为 DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、 寡核苷酸探针
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(二) 基本原理 碱基互补配对原理
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加热变性
杂交Leabharlann Baidu应
酶显色反应
带标记物的探针
酶标记的抗探针标记物的抗体
5
(三)DNA变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开
成两条单链的过程。 方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、
甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。
本质是双链间氢键的断裂