Western-Blotting实验报告

Western Blotting

本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。

Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。它通常分为两种方法：

同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。

一、实验原理

Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质为抗原，与之对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电泳分离的提议目的蛋白成分。蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维网孔结构(凝胶）。据有无浓缩效应可将电泳分为两类：

i.连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效

应区分。

ii.不连续系统：缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、分子筛效应、浓缩效应区分。

SDS-PAGE的原理是：依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了SDS和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白质构象：

在实验中要注意：印迹法需要较好的蛋白质凝胶电泳技术，是蛋白质样品达到良好的分离效果，而且要注意胶的质量，是蛋白质容易转移带固相支持物上，另外蛋白质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物阶段不丢失和扩散。免疫印迹分析之需要很小体积的时间，较短的时间过长，操作容易，适用于理论和应用上的研究。

本实验采用人血清为材料，人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中IgG占血清免疫球蛋白总量的75%～80%。人的IgG由两条重链和两条轻链组成，它们之间以二硫键相连。在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。对此样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG 为第二抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测人的IgG。

二、试剂，器材和实验材料

【试剂】

1.30％丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水

至100ml。

2.浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。

3.分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。

4.10％过硫酸铵(w/v)：临用前用蒸馏水配制。

5.10％SDS(w/v)。

6.10％TEMED。

7.电极缓冲液：甘氨酸11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。

8.样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8，20％甘油，4％SDS，10％

巯基乙醇，0.005％溴酚兰。

9.考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙

酸。

10.脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。

11.TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/L Tris-HCl,

12.500mmol/L NaCl，pH7.5，每组配150ml。

13.TTBS：取100mlTBS，加250μl 20％Tween-20。

14.封闭液及抗体稀释液：3％脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。

15.底物溶液：2.5mg二氨基联苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10μl H2O2，临用

前配制。

16.考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙

酸，总体积500ml。

17.脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。

【器材】

1.夹心式电泳槽

2.转移电泳槽

3.电泳仪

【实验材料】

1.人血清

2.硝酸纤维素膜

三、实验步骤

ⅠSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.灌胶前的准备：将两块玻璃板洗净晾干或用吹风机吹干，嵌入本体的

凹槽中，长玻板朝外，短玻板朝内，两块玻璃板之间就形成了凝胶室。合上滑块，拧螺栓锁紧凝胶室，检查凝胶室底部是否与本体底端重合。然后将以上组合放入制胶架，插入并旋转凸轮，即可灌胶。

2.配制胶液