植物体内脯氨酸含量测定

植物体内脯氨酸的含量测定

植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。当植物遭受逆境伤害时，细胞膜受到不同程度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。因此，质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标，广泛应用在植物抗性生理研究中。

当质膜的选择透性被破坏时细胞内电解质外渗，其中包括盐类、有机酸等，这些物质进入环境介质中，如果环境介质是蒸馏水，那么这些物质的外渗会使蒸馏水的导电性增加，表现在电导率的增加上。植物受伤害愈严重，外渗的物质越多，介质导电性也就越强，测得的电导率就越高（不同抗性品种就会显示出抗性上的差异。）

蛋白质水分子

疏水端脯氨酸亲水端

脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。

植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在520nm有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，但加入人造沸石（permutit ），在PH 1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等 2 —氨基的氨基酸）。[ 实验材料] 绿豆幼苗

[ 仪器设备] 分光光度计、水浴锅、天平、带塞试管、研钵、石英砂、漏斗、滤纸、玻棒、电导率仪、微波炉、移液管、试管、50mL 小烧杯等

【试剂药品】

1 ．无离子水

2 ．80% 乙醇。

3 ．酸性茚三酮试剂：称取2.5g 茚三酮，加入60mL 冰醋酸和40mL 6mol/L 磷酸，于70 ℃加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中，

4 ℃保存，两天内稳定。

4 ．脯氨酸标准母液：称取10mg 脯氨酸溶于少量80% 乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL, 成100μg/L 母液。

5 ．人造沸石、活性碳等。

【实验步骤】取绿豆种子，用水吸胀，萌动后加洗净的河沙覆盖，放在光照培养箱中培养（25 ℃，每天光照12h ），当苗高3~5cm 时，即可进行干旱胁迫处理。

•一盆浇充足水分作为对照，另一盆干旱处理24h 。

•肉眼观察伤害症状。

•取样和测定

测相对电导率：

每份取2g （地上部分），剪成小段（ 1.0cm 左右），置小烧杯中，用去离子水洗三次，沥干，准确加入20ml 去离子水，放置1h, 摇匀, 用DDS -11A 电导率仪测得的电导率为R 1 。将材料于微波炉中煮沸，彻底破坏材料的膜结构，冷却至室温后，测电导率R 2 。

测脯氨酸含量：

1 ．脯氨酸标准曲线制作：吸取脯氨酸标准母液0, 0.5, 1.25, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0mL 分别放入8 个50mL 容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至50mL ，配成0.0 ，1.0 ，2.5 ，5.0 ，10.0 ，15.0 ，20.0 ，30.0μg/mL 的系列溶液。分别吸取上述各标准溶液2mL ，冰醋酸2mL ，茚三酮试剂2mL ，加入到10mL 带塞刻度试管中，塞上塞子，于沸水浴中加热15 分钟，用分光光度计测定520nm 的光密度值，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。

2. 测定样品的脯氨酸含量

（ 1 ）提取脯氨酸：分别称取胚轴，每种处理各取三份，每份0.3g 。剪碎，加入适量80% 乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。匀浆液全部转移至25mL 刻度试管中，用80% 乙醇洗研钵，将洗液移入相应的刻度试管中，最后用80% 乙醇定容至刻度，混匀，80 ℃水浴中提取20 分钟。

(2 ）除去干扰的氨基酸：向提取液中加入约0.4g 的人造沸石和0.2g 活性碳，强烈振荡5 分钟，过滤，滤液备用。

（ 3 ）脯氨酸含量的测定：分别吸取上述提取液2mL 于刻度试管中，再取一支刻度试管，加入2mL 80% 乙醇作为参比，分别向上述各试管中加入2mL 冰醋酸和2mL 茚三酮试剂，沸水浴中加热15 分钟，冷却后在分光光度计测520nm 处各样品的光密度，从标准曲线上查出每毫升被测样品液中脯氨酸的含量。

【实验结果及计算】

用下列公式计算相对电导率，表示质膜相对透性：

相对电导率（% ）=R 1 /R 2 × 100%

样品中脯氨酸含量的计算:

脯氨酸含量(μg/g)=(c x v/a)/w 或

脯氨酸含量(%)=[(c*v)/a]/w*10 6 ×100

其中， C ：由标准曲线上查得的脯氨酸微克数；

v ：提取液总体积（mL ）

a ：测定液体积（mL ）

w ：样品重（g ）

注意事项：质膜相对透性的测定虽简单，但干扰因素多，测定时应注意以下问题：

•取材的一致性，代表性。

•器皿和用具要清洁。

•测试条件要一致，如测试温度等要一致。

•注意不同材料其适宜的浸泡时间均不相同。