电击法转化农杆菌

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌电击感受态的制备及电击转化表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化（1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。

按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。

（2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。

（3）农杆菌EHA105电击预备处理。

I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。

EHA105II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。

1.5mlIII. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。

IV. 重复步骤ⅲ三次。

V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。

加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。

（4）电击I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。

II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。

III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。

IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L 和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。

8000rpm1.制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。

农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法

农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法电转法1）挑取新鲜单菌落接种到10mL YEP培养基（含50ug/ mL利福平）的试管里，28℃、200r/min培养过夜。

2）稀释2 mL培养过夜的农杆菌到含200 mL YEP培养基的500 mL三角瓶里，28℃、200r/min培养至OD600达0.5。

4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞。

3）用适量体积的 10%的甘油（用去离子水配置）重悬洗涤沉淀2次，洗涤时一定要轻柔地把细胞悬均匀，每次4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞，小心将上清倒掉。

4）将细胞重悬于1 mL 10%的甘油里，细胞可以立即使用，也可分装成每管40μL（质粒连接产物体积不能超过感受态细胞体积的1/10，否则容易爆杯），经液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。

5）取一管感受态细胞放在冰上融化，加入100ng DNA样品混匀，将样品放入冰上的电击杯中，按照电击仪厂商说明进行电击转化，之后涂布在含有相应抗生素的YEB平板上培养（质粒抗性+农杆菌菌株抗性）。

热击法1）挑单菌落于2 mL YEP培养基（含Rif 50mg/ mL）中28℃过夜活化；2）取2 mL过夜菌液接种于200 mL YEP培养基中28℃振荡培养生长至OD600约等于0.5左右；3）冰上放置30 min左右，5000 rpm离心5 min；4）在60 mL冰水浴预冷的无菌0.1M CaCl2溶液中中悬浮细胞；5） 5000 rpm离心5 min，悬浮细胞加入20 mL冰水浴预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2，轻敲管壁使菌体悬浮均匀，每管200 µL 进行分装，液氮速冻后保存于-80℃待用；6）取200 µL感受态细胞，加入0.5 µg质粒DNA，液氮中速冻5 min，37℃水浴热击5min，之后迅速置于冰水浴中冷却2 min，然后加入1 mLYEB 空白培养基，28℃低速振荡培养4 hr；7） 6000 rpm离心2 min，弃部分上清，留约200 µL溶液，重悬细胞，涂布于含有相应抗生素的YEB 平板上，28℃倒置培养约36 hr。

农杆菌电击感受态的制备_转化及验证

农杆菌电击感受态的制备，转化及验证1.制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。

(2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡3-4小时，至OD600=0.8左右。

(3) 5000rpm离心5分钟，去上清。

(4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min.(5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。

(6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟，(7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/管)备用。

2 农杆菌感受态的电转化〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。

(2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。

(3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。

(4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培养基平板上，28℃培养2-3天。

其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化是把茎和叶浸在农杆菌液里30秒..想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以采用注射法导入农杆菌还有就是把植株取出放入侵染液中用真空渗透法导入感受态制备及转化方案二1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。

根癌农杆菌介导的真菌转化

根癌农杆菌介导的真菌转化(一) 农杆菌电击感受态制备及电击转化A 感受态的制备1) 将农杆菌菌液划线于YEB平板（50 µg/ml kana），28℃，36-48h。

2) 挑单菌落至3ml YEB试管（50 µg/ml kana）中，28℃，200rpm 培养过夜。

3) 转1ml至50ml YEB中，28℃，200rpm培养至OD600=0.8。

4) 于4℃，5000rpm，10min收集菌体。

5) 用50mL 10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。

6) 重悬于1ml 10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50µl，液氮速冻后，-80℃保存备用。

B 电击转化1) 将1µl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。

2) 将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。

3) 取出电击杯，迅速加入200-300µl YEB（不加抗生素），并将混合液转入EP管中。

4) 于28℃，220rpm，2-3h。

5) 将50-100µl菌液涂布于YEB平板（50µg/ml car和50 µg/ml kana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。

(二) 农杆菌化学感受态制备及化学法转化A . Competent Cells1)Inoculate a single colony to 5 ml LB2)Grow at 28℃ to log phage,shaking at 250rpm3)Inoculate 2ml of the culture to 50 ml LB medium and grow to OD600=0.5 ca. 8 hours4)Chill on ice for 10 minutes5)Spin down the cells by centrifugation at 3000g(8000rpm) for 10 minutes at 4℃6)Resuspend cells in 1 ml of 20 mM CaCl27)Aliquots into 0.1 ml ,then freeze in liquid nitrogen , and store at -80 ℃B Plasmid Transformation1)Thaw competent cells on ice.2)Add 1 µg plasmid (5µl) to the competent cells and mix well.3)Freeze in liquid nitrogen for 5 min.4)Heatshock at 37℃ for 5 min.5)Add 1 ml LB and grow at 28℃ for 3 hr with shaking at 150 rpm.6)Spread cells onto LB plates containing an appropriate antibiotic and incubate at roomtemperature for 2-3 days.(三）农杆菌介导的真菌转化1 将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYEB液体培养基（50µg/ml car和50 µg/ml kana）中，于28℃摇床中220rpm过夜培养（16-20h）。

农杆菌EHA105感受态细胞的电击转化

农杆菌EHA105感受态细胞的电击转化
(1)调节电击仪,使其电脉冲为25ｕF,电压为2.5KV,电阻为400Ω
(2)从-70℃冰箱中取出EHA105感受态细胞,置于冰上使其融化.
(3)加1ｕL质粒于感受态细胞中,轻轻混匀.
(4)将上述菌液和DNA悬液加进电击杯的底部,迅速将电击杯放进电击仪.
(5)按设定的参数,启动对细胞的电脉冲.
(6)电击以后,尽快取出样品,加入1ML无抗YEB培养基.
(7)将上述菌液转入1.5MLdorf管中,28℃ 2小时以上
(8)将菌液涂布在加有相应抗生素的YEB培养基上, 28℃培养2-3天,直至菌落长出.
备注:所有操作最好在冰上进行,电击杯电击之前在冰上预冷.。

农杆菌感受态的制备及电击转化

农杆菌感受态的制备及电击转化（1）将农杆菌EHA105菌株在含有50 mg/l 利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48 h；（2）挑取单克隆，于10 ml 含50 mg/l 利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；（3）当OD600达到0.5~0.7时，6 000 r/min 4℃离心10 min收集菌体；（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2 ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用；（5）取重组质粒（pROK2-LbDREB）1 μl，加入100 μl EHA105感受态细胞，混匀后冰上放置；（6）将混合液放入预冷的电击杯中，1 800 V电击；（7）电击完成后迅速取出，加入500 μl LB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1 h复苏；（8）取适量菌液涂布于含50 mg/l 卡那、50 mg/l 利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48 h；①农杆菌感受态细胞制备a. 在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7；b. 取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min；c. 去除上清，用1ml 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基；d. 向洗好的菌体用100μl 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。

②根癌农杆菌的电击转化a. 取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中；b. 1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μl LB液体培养基，迅速吸打混匀；c. 尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h；d. 取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h。

关于电激法做农杆菌的转化的问题(农杆菌,电激法,质粒)

农杆菌感受态细胞制备方法1．农杆菌稀释100倍过夜培养；3．5000rpm离心5min，弃去上清液；4．沉淀用1.5 ml 25mM CaCl2悬浮,冰浴20min；5．5000rpm离心5min，弃去上清液；6．每管用50μl CaCl2悬浮，20 min 后用于转化；7．加入质粒DNA 0.1～1μg，之后冰浴30 min；8．放入液N2中5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；10．取出10～50μl菌液涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。

转化时一般200μl感受态细胞悬液（OD600为0.5-0.6）中加入的质粒含量不超过50ng,体积不超过10μl。

电转化步骤如下：1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

3. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

4. 打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

7．37℃，220－250rpm复苏1小时。

8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。

其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。

注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。

电击杯清洗流程1．用清水将电击杯稍冲一下。

2．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4．加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。

电转农杆菌感受态细胞制备与转化

1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。

（如用5mlYEP，需培养36h）2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。

3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。

5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

6．重复4、5步骤2~3次。

7．用2ml冰浴的10%甘油重悬。

8．每管100µl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。

1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。

注：HEPES需现用现配。

电击法转化农杆菌感受态细胞1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。

2．加2µl质粒DNA于100µl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。

3．取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(电击杯-20℃预冷)，在2500V高压下电击。

4．取出电击杯，加入500µl预冷的YEP培养液(不含抗生素)，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h。

5．取30-40µl菌液涂在含相应抗生素的YEP平板上，28℃倒置培养1.5~2d。

注：1．细胞与质粒的混合物应沿槽壁慢慢加入电击杯中，避免产生气泡。

2．电击前擦干电击杯外侧。

3．涂板菌液量可根据菌液浓度作调整。

给你做几点修改：1 HEPES 可以用纯的灭菌水代替2 电压跟电击杯宽度有关，若是1mm的宽度用1500V1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

农杆菌感受态的制备及电击转化

农杆菌感受态的制备及电击转化（1）将农杆菌EHA105菌株在含有50 mg/l 利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48 h；（2）挑取单克隆，于10 ml 含50 mg/l 利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；（3）当OD600达到0.5~0.7时，6 000 r/min 4℃离心10 min收集菌体；（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2 ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用；（5）取重组质粒（pROK2-LbDREB）1 μl，加入100 μl EHA105感受态细胞，混匀后冰上放置；（6）将混合液放入预冷的电击杯中，1 800 V电击；（7）电击完成后迅速取出，加入500 μl LB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1 h复苏；（8）取适量菌液涂布于含50 mg/l 卡那、50 mg/l 利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48 h；①农杆菌感受态细胞制备a. 在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7；b. 取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min；c. 去除上清，用1ml 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基；d. 向洗好的菌体用100μl 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。

②根癌农杆菌的电击转化a. 取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中；b. 1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μl LB液体培养基，迅速吸打混匀；c. 尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h；d. 取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h。

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证农杆菌电击感受态的制备及电击转化表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化（1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒 pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。

按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。

（2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。

（3）农杆菌EHA105电击预备处理。

I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。

EHA105 II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。

1.5mlIII. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。

IV. 重复步骤�Ｈ�次。

V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。

加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。

（4）电击I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。

II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。

III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。

IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。

8000rpm1. 制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。

农杆菌转化法介绍

农杆菌转化法介绍农杆菌感受态制备与转化普通农杆菌感受态制备与转化：方案一1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。

6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。

7. 液氮中冷冻1分钟。

8. 37℃水浴溶化细胞。

9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。

10.离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。

11.涂板，28℃培养2-3天。

电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二1. 挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。

（如用5mlYEP，需培养36h）2. 将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。

3. 转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

4. 用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。

5. 4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

6. 重复4、5步骤2~3次。

7. 用2ml冰浴的10％甘油重悬。

8. 每管100ul1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。

1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。

注：HEPES需现用现配。

电击法转化农杆菌感受态细胞1. 取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。

2. 加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。

电击法转化农杆菌
电击法转化农杆菌
需要时间：电击操作40min左右+ 培养4h（期间可以干别的事）+ 涂平板操作20min左右+ 培养48h
电转化杯：平时洗净放酒精中；大肠杆菌用2mm；农杆菌用4mm或2mm(4mm好用些）
大肠杆菌：37℃培养24小时（生长较快），1500V/6ms电击
农杆菌：28℃培养48小时（生长较慢），2500V/6ms电击
离心管：1.5mL下端尖2mL下端圆
比例：40μL感受态农杆菌(GV3101) : 1μL质粒
（用手指弹几下混匀）
具体操作过程：
1、将20μL农杆菌和0.5μL质粒混匀，
2、用枪加入4mm电转化杯中，盖上盖，贴标签，
3、在电击器上2500V/6ms进行电击，促使质粒进入农杆菌，
4、电击后，用枪将液体移到装有500μL LB培养液的2mL离心管中，
5、写标签，用石蜡膜封口，
6、在28℃生化培养箱中摇晃培养4h左右，让菌在有氧条件下复苏，
7、将离心管进行离心1min，使菌体沉降到管壁上，
8、准备LB平板，写标签，用酒精擦拭三角玻璃棒，然后在火焰上烧10s左右灭菌，放置冷却备用，
9、用枪吸取100μL 上清液，将剩下液体倒掉，在将枪中液体打入离
心管中，并用枪反复吸打，冲下壁上菌体混匀，（涂平板时100μL 就够了，所以进行离心浓缩）
10、吸出菌液，滴在平板上，用玻棒涂抹均匀，
11、盖上盖，用石蜡膜封口，放入28℃生化培养箱中48h（2
天），即可长出菌落。

农杆菌感受态的制备及电击转化

农杆菌感受态的制备及电击转化（1）将农杆菌EHA105菌株在含有50 mg/l 利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48 h；（2）挑取单克隆，于10 ml 含50 mg/l 利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；（3）当OD600达到0.5~0.7时，6 000 r/min 4℃离心10 min收集菌体；（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2 ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用；（5）取重组质粒（pROK2-LbDREB）1 μl，加入100 μl EHA105感受态细胞，混匀后冰上放置；（6）将混合液放入预冷的电击杯中，1 800 V电击；（7）电击完成后迅速取出，加入500 μl LB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1 h复苏；（8）取适量菌液涂布于含50 mg/l 卡那、50 mg/l 利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48 h；①农杆菌感受态细胞制备a. 在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7；b. 取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min；c. 去除上清，用1ml 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基；d. 向洗好的菌体用100μl 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。

②根癌农杆菌的电击转化a. 取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中；b. 1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μl LB液体培养基，迅速吸打混匀；c. 尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h；d. 取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h。

12、农杆菌的电转化

电转化一电转化感受态细胞的制备1、用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。

（同时做培养基和枪头的空白对照）2、 37℃，220rpm，培养14-16个小时。

3、第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。

4、将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。

5、弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。

6、弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。

7、弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。

8、弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。

同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。

9、次日观察转化子生长情况，并记录。

二电转化1、用无水乙醇清洗浸泡在无水乙醇中的电击杯,于超净台吹干.将连接产物和0.1CM的电击杯一起置于冰上预冷。

准备800ul无抗LB,于冰上预冷.2.、从-70℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；3、取1ul连接产物加入到100ul感受态中,混匀后转入电击杯中.轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部.4、打开电转仪，将电击杯放入。

5、按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

6、 37℃，220－250rpm复苏1小时。

7、5000rpm,5分钟,弃上清剩100ul,涂板,放于37℃过夜培养，次日查看转化结果.三电击杯清洗流程1．用清水将电击杯稍冲一下。

农杆菌的电转化过程

农杆菌转化(电转化)
电阻：农杆菌400欧姆
(Ecoli 200 欧姆)
电容：25uF
电压：2500V
电击杯:0.2cm
标准反应体系为每管40ul感受态,加入1ul的质粒
(在感受态中加入质粒,混匀后在转入电转化杯)
1 将混匀好的感受态和质粒转到电击杯中(此步在冰上进行)
2 在电转化仪上电击一下,拿出后立刻加入1ml的LB培养基(不加任何抗生素)混匀.
3 吸出,转移到1.5ml的eppendorf管中,28℃温育1-2小时,使细胞恢复生长.
4 涂板,从恒温箱中取出eppendorf管,在离心机上甩一下,使菌沉淀下来,然后,从管中吸
出800ul的LB培养基,剩余的用枪混匀,涂在LB(kan50 Rif50)板上,置于28℃恒温箱中培养,直到长出菌落.。